[doc格式] 高铁肌红蛋白还原酶活力测定方法的优化

[doc格式] 高铁肌红蛋白还原酶活力测定的优化 高铁肌红蛋白还原酶活力测定方法的优化 第12期(总第157期)农产品加工’学刊 2008年l2月AcademicPeriodicalofFarmProductsProeessing No.12 Dec. 文章编号:1671—9646(2008)12—0004—04 高铁肌红蛋白还原酶活力测定方法的优化 白凤霞,戴瑞彤,孔保华 (1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨150030;2.中国农业大学食品科学与营养学院,北京100083) 摘要:高铁肌红蛋白还原酶是和肉色相关的一类酶,它可以阻抗引起肉品褐变的高铁肌红蛋白的生成,从而延长肉 品货架期.对高铁肌红蛋白还原酶活力的测定方法进行优化,结果明,在测定高铁肌红蛋白还原酶活力的标准反 应物中,酶粗提液的添加量为0.3mL,以牛心为材料,高铁肌红蛋白的添加量为0.1mL,以牛背最长肌为材料,高 铁肌红蛋白的添加量为O.05mL,NADH的添加量均为0.2mL;测定酶反应的最适温度为25?,保温时间为25min. 在酶标准反应物中,只有NADH是必须的起始物质,以前报道过的电子传递体K,Fe(CN)并非必须反应物质,但它和 底物高铁肌红蛋白和EDTA都有增强酶活力的作用. 关键词:高铁肌红蛋白;高铁肌红蛋白还原酶活力;酶活力测定方法 中图分类号:Q55文献标志码:A TheMethodsfortheDeterminationofMetmyoglobinReductaseActivity BaiFengxia,.DaiRuitong~,KongBaohua (1.CollegeofFoodScience,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,Heilongjiang150030,China; 2.CollegeofScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China) Abstract:Themetmyoglobinreductasecanresisttheformationofthemetmyoglobinwhichinducedthebrowningofmeatand extendtheshelflifeofmeat.Themethodsforthedeterminationofmetmyoglobinreductaseactivitywerestudiedandtheresult suggested:theoptimumconditionswerethatthecontentofenzymeextract:0.3mL,theamountofmetmyoglobinfrombeef heart:0.1mL;theamountofmetmyoglobinfromlongissimusmuscleofbeef:0.05mL,theadditionofNADH:0.2mL; theoptimaltemperatureforthereaction:25oC,theholdingtime:25min.Inthestandardreactants,NADHwasnecessary fnrthereaction,K4Fe(CN)6aselectron~ansfermediatorisnotnecessary;butK4Fe(CN)6,metmyoglobinandEDTAcould improvethemetmyoglobinreductaseactivity. Keywor~sI(MMb);metmyoglobinreductaseactivity(MRA);methodsforth edeterminationofenzymeactivity 0引言 高铁肌红蛋白还原酶是肌肉中存在的可以还原高 铁肌红蛋白(MMb)的一类酶,它与肉色的关系是 国内外研究的热点. 肉色的褐变是氧合肌红蛋白氧化生成MMb所造 成的,而肌细胞内部的高铁肌红蛋白还原酶可以起到 阻抗MMb积累的作用,从而稳定肉色.国内外已经 对此类酶做了相当多的研究,但是由于测定酶活力方 法的不一致,导致很多研究结果不统一. Stewart等人(1965年)【l】最早用铁氰化钾作为氧 化剂来测定高铁肌红蛋白还原酶活力(MRA),但此 方法测定结果不稳定. Watts等人(1966年)[21在此基础上,通过使用 亚硝酸钠氧化肌肉色素,但是在无氧条件下肌肉中存 在的其他的还原系统可以把氧化的肌红蛋白还原. Ledward(1972年)嘲发现一种创新的方法,不用人 工合成的化学氧化剂,利用低氧分压条件下的氧化肌 红蛋白,创造了有氧还原法,但是此方法可能使肌红 蛋白氧化不完全,而且费时.于是Lee等人 (1981年)提出了测定总的还原活性的方法,但是 这种方法的意义和性质是不清楚的,而且用到三氯乙 酸,显然测定的不是特异性的MRA.文献【5】,[6】, [7]报道了用次甲基蓝测定MRA的方法,但次甲基蓝 能通过抑制吡啶核苷酸的氧化和还原而影响总的还原 酶活力.文献[8】,【9】报道的对MRA方法进行适当修 正,得出现在通常用的测定酶活力的方法,但此方法 没有很好地表述其适用条件.本文通过对测定MRA 过程的各个条件进行优化,从而为更好地研究高铁肌 红蛋白还原酶与肉色稳定性的关系奠定一定的基础. 收稿日期:2008—09—19 基金项目:国家自然科学基金项目(30771523). 作者简介:白凤霞(1982一),女,河北人,在读硕士,研究方向:畜产品科学. 为通讯作者:戴瑞彤(1966一),女,博士,副教授,研究方向:畜产品科学.E—mail:dairuitong@gmail.o0m. 2008年第l2期白凤霞,等:高铁肌红蛋白还原酶活力测定方法的优化?5? 1材料与方法 1.1材料和设备 1.1.1材料来源 牛心,牛背最长肌,均购自北京御香苑市场.将 屠宰lh内取出的肉样用冰盒保存,带回实验室,去 掉筋膜,立即处理,制备高铁肌红蛋白还原酶粗提 液.牛心制备样称为A样,牛背最长肌样称为B样. 肌红蛋白,NADH,购自Sigma公司;磷酸二氢 钠,磷酸氢二钠,Tris,HCI,EDTA,高铁氰化钾, 亚铁氰化钾等,购自蓝弋试剂公司,均为分析纯. 1.1.2主要试验设备 高速组织捣碎机,万分之一电子天平,酸度计, 高速冷冻离心机,超低温冰箱,移液器,恒温水浴 锅,紫外分光光度计. 1.2方法 1.2.1样品处理方法 参考文献【8]介绍的方法,略有改动.每个样品 取l0g加入20mL冰的磷酸盐缓冲液(PB,浓度为 2.0mmoUL,pH值7.0),4?下,经组织捣碎机处理 1min,再用高速组织分散器连续均质处理1min,均 质液在4?下,转速10000r/min下离心20min,上 清液经中速定性滤纸过滤除去脂肪,滤液中氧合肌红 蛋白用稍过量的高铁氰化钾氧化后,再用冰磷酸盐缓 冲液(PB,浓度为2.0mmol/L,pH值7.O),4?下 透析(透析袋截留分子量为14000Da,进口)24h, 期间换液3次,主要是除去过量的高铁氰化钾.透析 完毕后,在4?,转速12000r/min下离心20min, 取上清液作为高铁肌红蛋白还原酶的粗提酶液. 1.2.2酶活力的测定方法嘲 配置标准反应物,反应温度为25?,空白对照 以水代替NADH,其他组分不变. 高铁肌红蛋白还原酶活力测定的反应物组分见 表1. 表1高铁肌红蛋白还原酶活力测定的反应物组分 反应由加入NADH而起始,用紫外分光光度计 在波长580nm下进行扫描,每10s记录吸光值. MetMb与MbO:的吸光值在580nm时差异最大,两 者的摩尔消光系数为12×101/(mol?cm).通过比较反 应前后(在反应线性阶段)吸光值的变化,便可计算 出MetMb的还原酶活力.1个酶活力单位定义为: 1U=InmolMetMbreduced/min,高铁肌红蛋白还原 酶比活力表示为反应线性阶段每1mg蛋白所具有的 活力单位(U/mg),每个样品的酶活力测定重复 2次,取平均值.由于本文实验的样品都是同一批次 同时测定的样品,酶粗提液中的总蛋白含量是相同 的,为了简化步骤,就直接用反应线性阶段的 吸光值/时间值/t)来表示酶活力的变化情况. 1.2.3实验分组 (1)确定酶标准反应物,进行6组实验. 高铁肌红蛋白还原酶测定过程中添加的标准反应 物见表2. 表2高铁肌红蛋白还原酶测定过程中添加的标准反应物 注:A代表牛心提取液,B代表牛背最长肌提取液. (2)高铁肌红蛋白还原酶粗提液的提取条件: 缓冲液种类:磷酸盐缓冲液(PB),s一_一Hcl; 缓冲液浓度:1.0,2.0,5.0,10,20mmol/L; 缓冲液pH值:6.0,6.5,7.0,7.5,8.0. (3)标准反应物中各物质的添加量: Emzymeextract:0.0,0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5mL; MetMb:0.0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4mL; NADH:A样0.0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25mL; B样0.0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL. (4)酶反应的最适温度以及保温时间: 反应温度:5,15,25,35,45,55oC; 保温时间:0,5,l0,15,20,25,30min. 1.2.4数据分析 所得数据用SPSS软件(8.0版)进行极差分析. 2结果与分析 2.1不同标准反应物对酶活力的影响 添加不同标准反应物对酶活力的影响见图1. 由图1可见,与第1组添加了全部的反应物相 比,不加底物高铁肌红蛋白的第2组样中,A样酶活 力没有显着性差异(p>0.05),而B样却显着降低 (p<0.05),说明酶粗提液本身就含有底物高铁肌红蛋 白,在不加底物的情况下也可以很好地反应,但是牛 背最长肌样(即B样)可能是由于底物浓度较小, 所以酶活力显着降低.不加EDTA的第3组样和第1组 农产品加工?学刊2008年第l2期 妲 罐 123456 实验组 ?一A样;豳一B样 图1添加不同标准反应物对酶活力的影响 相比,A样活力下降比B样多,但差异均不显着 (p>0.05).不加K4Fe(CN)6的第4组样品和第l组相 比,活力稍有下降但差异不显着(p>0.05),说明 K4Fe(CN)在反应过程中起电子传递作用,但它并不 是反应必需的物质.第5组不加酶粗提液和第6组不 加NADH的样品酶活力均为0,说明NADH是反应 的起始物质,是必不可少的,同时说明粗提液中确实 存在高铁肌红蛋白还原酶. 2.2高铁肌红蛋白还原酶粗提液提取条件对酶活力 的影响 2.2.1缓冲液种类以及pH值对酶活力的影响 缓冲液种类以及pH值对酶活力的影响见图2. 6.06.57.07.58.O pH值 ?一PB:踊一Tris—HC1 图2缓冲液种类以及pH值对酶活力的影响 由图2可见,用磷酸盐缓冲液提取的粗提酶液的 酶活力要大于用Tris—HC1提取的酶液,且在pH值 7.0时达到最大值,而用s—HCI提取的酶液在pH 值8.0时的酶活力达到最大值,表明高铁肌红蛋白还 原酶液提取过程用pH值7.0的磷酸盐缓冲液的效果 较好. 2-2.2缓冲液种类以及缓冲液浓度对酶活力的影响 缓冲液种类及其浓度对酶活力的影响见图3. 由图3可见,用磷酸盐缓冲液提取的粗提酶液的 酶活力要大于用Tris—HCI提取的酶液,结果与图2一 致,而且PB浓度为2.0mmol/L时的酶活力达到最 IZ5l02O 浓度C/mmol?L-’ ?一PB:圈一Tfis—HCI 图3缓冲液种类及其浓度对酶活力的影响 大,用Tris—HCI提取的酶液在其浓度为 1.0mmol/Lt~的酶活力达到最大值,表明高铁肌红蛋 白还原酶液提取过程用浓度为2.0mmol/L的磷酸盐缓 冲液的效果较好. 2.3标准反应物中各物质的添加量 2.3.1Enzymeextract添加量 Enzymeextract添加量对酶活力的影响见图4. Enzymeextract添加量/mL ?一A样;-i-一B样 图4Enzymeextract添加量对酶活力的影响 由图4可见,A样和B样均是随着酶提取液添 加量的增多逐渐增大,但是添加量超过0.3mL后酶 活力没有显着性差异,表明酶反应中酶粗提液的添加 量为0.3mL较合适. 2.3.2MetMb添加量 MetMb添加量对酶活力的影响见图5. MetMb添加量/mL ?一A样;-i-一B样 图5MetMb添加量对酶活力的影响 765432lO???????吣 OOOOOOOO . 妲龌 65432lO??吣??? OOOOOOO 765432lO?吣????? 0000OO0O . 姆龌 O8642O叭??吣?吣 0O0O0O s.靼蜒 65432l0耋; 000O0O0 . 蝗龌 2008年第12期白凤霞,等:高铁肌红蛋白还原酶活力测定方法的优 化.7. 由图5可见,随着MetMb添加量的增大,酶活2.4.2保温时间 力先增大后减小,这可能是由于底物浓度太大反而抑 制了酶的活力.A样酶活力在MetMb添加量为 0.1mL,B样酶活力在MetMb添加量为0.05mL时达 到最大值,确定酶反应中MetMb的添加量A样为 0.1mL,B样为0.05mL. 2.3.3NADH添加量的确定 NADH添加量对酶活力的影响见图6. 翅 谣 NADH添加量/mL 0.oo35 O.0o3O n 0.0020 0.0015 0.0010龌 0.0005 0.0000 NADH添加量,mL ?一A样;一?一一B样 图6NADH添加量对酶活力的影响 由图6可见,随着NADH添加量的增大,酶活 力先升高后下降,这说明NADH是不可缺少的反应 的起始物,但它有最适量,超过这个量酶活力不再上 升反而下降. 由图6可知,A样和B样的酶活力均在NADH 的添加量为0.2mL时达到最大值,于是确定NADH 的添加量为0.2mL. 2.4酶反应的最适温度以及保温时间 2.4.1反应温度 酶反应的最适温度对酶活力的影响见图7. 妲 谧 反应温度? ?一A样;?一B样 图7酶反应的最适温度对酶活力的影响 由图7可见,随着酶反应温度的升高,试样酶活 力在15?时下降,此温度可能是酶的抑制温度,到 55?时出现絮状的蛋白沉淀,酶活力已经完全丧失, 在25?时试样酶活力均达到最大值,确定酶反应的 最适温度是25?. 酶反应的保温时间对酶活力的影响见图8. j型 婕 蹴 保温时I司t/min ?一A样;--l-一B样 图8酶反应的保温时间对酶活力的影响 由图8可见,保温时间对酶活力的影响不是很 大,由于酶活力在其测定过程中存在很大的偶然性, 出现如图8所示的结果,即A样酶活力在保温25min 时达到了最大值,而B样酶活力在保温30min时达 到最大值,但是在保温时间为0时差异不显着 >0.05),为了保持实验的一致性,于是确定酶反应 过程中的保温时间为25min. 3结论 (1)A样的酶活力均大于B样的酶活力,说明 从动物不同部位取得样品的酶活力是不同的,牛心的 酶活力要显着高于牛背最长肌的酶活力.在测定高铁 肌红蛋白还原酶活力的标准反应物中,只有NADH是 必须的起始物质,以前报道过的电子传递体 K4Fe(CN)并非是必须的,但它和底物高铁肌红蛋白 及EDTA都有增强酶活的作用. (2)在提取高铁肌红蛋白还原酶的过程中,用浓 度为2mmo1]L的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液;在测 定酶活力的最终反应物中,酶粗提液的添加量为 0-3mL,高铁肌红蛋白的添加量为:牛心0.1mL,牛 背最长肌为0.05mL,NADH的添加量均为0.2mL; 测定酶反应的最适温度为25?,保温时间为25min. 参考文献: 【1JStewartMR,ZipserMW,WattsBM.Theuseofre- flectancespectrophotometeryfortheassayofrawmeatpig— ments[J】.JoumalofFoodScience,1965,30:464—469. [2】WattsBM,KendrickJ,ZipserMW,eta1.Enzymaticre- ducingpathwaysinmeat[J].JournalofFoodScience, 1966.32:855—862. 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(3)已知小米中的氮含量,通过蛋白质中赖氨酸 与氮含量回归方程,可以估算出其蛋白质赖氨酸的含 量,采取强化或与食物搭配使用措施,可提高小米的 生物利用率. 参考文献: [1]陈卫军,魏益民,张国权,等.国内外谷子的研究现状 [J].杂粮作物,2000(3):27—29. [2】解喜明,张剑波.小米营养分析与深加工『J].食品科 学,1990(4):18—21. [3】李庆春,黎裕,曹永生,等.小米蛋白质含量和氨基酸 组分及对其蛋白质品质的评价[J】.中国粮油, l994(12):7-13. [4】古世禄,刘厦.中国谷子蛋白质氨基酸组成的研究[J]. 华北,1989(1):8-15. I5】H.Taira.AminoAcidCompositionofDifferentVarietiesof FoxtailMillet(Setariaitalica)【J].agric.foodchem., 1968(6):l025一l027. 【6】P.V.Monteiro.ProteinsofItalianMfiletAminoAcidCom— position,SolubilityFractionandElectrophpresisofProtein FractionIJ】.Sci.FoodAgrie,1982,33:1072-1079. 【7】卢健鸣,陕方,马晓凤,等.利用多种蛋白资源提高膳 食营养水平【JJ.山西食品工业,1995(3):10—14. (上接第7页) Preservation,1981,5:191—205. [5]RenerreM,LabasR.Biochemicalfactorsinfluencingmet— myoglobinformationinbeefmuscles[J].MeatScience, 1987,19:15l一165. 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