小麦组蛋白修饰酶基因及DNA甲基转移酶基因的分离及鉴定

小麦组蛋白修饰酶基因及DNA甲基转移酶基因的分离及鉴定 中国农业大学 博士学位论文小麦组蛋白修饰酶基因及DNA甲基转移酶基因的分离及鉴定 姓名:戴艳 申请学位级别:博士 专业:作物遗传育种 指导教师:孙其信倪中福 20050401 摘要 表观遗传学是指在不改变,,,序列的情况下，在碱基序列外的各种修饰和与之相关的各种蛋白质或,,,的协同作用下，调控基因的表达，以完成生命周期或适应环境变化，而且这套系统还能在世代之间传递。就目前的研究来看，表观遗传学主要包括组蛋白密码、,,,甲基化、,,,干涉、基因组印记等多个方面，小麦是世界第二大粮食作物，关于小麦表观遗传学的研究鲜有报道。本文采用简并性引物同源扩增及电子克隆的方法，分析了小麦组蛋白修饰酶基因及,,,甲基转移酶基因的结构及其表达，以期从转录水平增加对小麦生长发育调控的认识。此外(采用转基因的方法在拟南芥中超表达了一个组蛋白乙酰转移酶基因和一个组蛋白脱乙酰化酶基因，以期探索它们的生物学功能，主要结果如下: ,)利用电子克隆方法，结台,,,,,,分析，从小麦中克隆了包含完整,,,的,个不同类型的组蛋白乙酰转移酶基因(,,,,类型，,,,,类型)和,个代表不同类型的(,，,(,类型，,,,类型，,,,,类型，,,,，类型)组蛋白脱乙酰化酶基因，分别命名为,,,,,,,,，,,,,，一,。结构分析表明它们具有组蛋白乙酰转移酶及脱乙酰化酶的典型的结构特征。亚细胞定位结果表明,,,,,,定位在细胞核中，,,,,,属于核质穿梭型的组蛋白脱乙酰化酶。本研究是有关小麦组蛋白乙酰转移酶及脱乙酰化酶基因的首次报道。 ,)采用同源序列扩增法，分离克隆了,个小麦的,,,蛋白基因片段，同源进化分析表明它们均属于,,(,,,),,,类型的,,,蛋白基因。同时利用电子克隆结合,,,,,,方法分离了两个具有完整,,,的,,,蛋白基因，分别命名为,,,,,,和而晒口。同源进化分析表明它们分别属于,,,和,,(,,,),,,类型的,,,蛋白基因。 ,)采用生物信息学手段及结合,,,,,,方法获得了,条代表不同类型(,,,,,，,,,,,，;,?,，,,,,,)的小麦,,,甲基转移酶基因的片段，分别命名为,,,,,,，,,,,,,,，,,,,,和,,,,,,;同时采用电子克隆结合,,,,,,方法获得一个具有完整,,,的,,,,,类型基因，命名为,,,,,,,。此外，也获得了该序列相应于,,,区的基因组序列。序列分析表明在该基因,,,区域含有,,个内含子。 ,)以小麦,,,,水浸泡,(,,小时(每隔,小时取一次样)的种子的种胚，水浸泡,,小时的胚根、胚芽，不同发育时期的,,片、根系及千种子、授粉,天、,,天的种子为材料检测了所获得基因的表达情况。结果表明所检测的基因在大部分材料中均表达。有趣的是只有,,,,,,和,,,,,,在干种子中表达，其它所检测的基因均不表达。此外，以拔节期的小麦,,,,，,,,,及其组配的强优势杂交种的叶片、茎、根系为材料，采用半定量,,,,,,方法检测了所获得基因的表达情况，结果表明它们在小麦杂交种与亲本之间存在明显的袭达差异，并且差异表达模式园基因类型和所检测的组织器官不同而变化。,)在拟南芥中分别超表达,,,,类型的小麦组蛋白乙酰转移酶基因,,,,,,及,,,,类型的脱乙酰化酶基因,,,,,，结果发现它们均出现了叶片、花的畸形发育，我们推测这两个基因与小麦生长发育的调控有关。本研究是对推测的小麦组蛋白乙酰转移酶及脱乙酰化酶基因功能研究的首次报道。关键词:小麦，组蛋白修饰酶基因，,,,甲基转移酶基因，基因克隆，基因表达 ,,,,,,;, ,,,,,,,, ,; ,,,,,,,,,, ,, , ,,,,, ,,,,;, ,, ,,,, ;,,,,,, ,, ,,,;, ,,,,,,,,, ;,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,？,,,;,，,,,;, ,,,,,, ,,;,,,,, ,,,,,,, ;,,,，,,,,,,,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,;, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,(,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,;, ,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,(，, ,,,, ,,,,;,,，,,,,, ,,;,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,;, ;,,,,,,(,,, ,,,, ,,,,,,, ,,, ,, ,,,,,,,:,),,, ,,,,,,, ,;,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,,;, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,;,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,;, ;,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,，,,,,,,,,,, ,,,,,，?,，,,,,，一, ,,,,,;,,,,,,(,,,,, ,;,, ,,？,,,;, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ;,,,,,,,, ,,,,;,, ,,,;,,,,,, ,,,, ,,, ,, ;,,,,;,,,,,,,;, ,, ,,,,,,, ,;,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,(,,,,,,,,,,, ,,;,,,,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,;,,, ;,,;,,,,,,,, ,, ,,, ,,;,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,,,;,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,(,, ,,, ,,,,,,,,,，,, ,,,,, ,,;,,,,, ,,,,,,, ,;,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,;,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,),,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,颍?,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,(,,,,,,,,,,,; 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白榈鞍椎募谆 ,送猓 模危良谆式峁沟闹饕 绞接凶榈鞍滓阴; 彩潜砉垡糯 У囊恢制毡橄窒螅 斡肓嘶 虻谋泶锏骺毓 獭,泼娼 哉馊 龇矫妫ㄗ榈鞍滓阴; 胪岩阴; 榈鞍准谆 肴ゼ谆 模危良谆 ?难芯拷 菇 凶凼觥,保 弊榈鞍滓阴; 胪岩阴; 难芯拷 ?染色体主要由核小体组成，核小体是真核生物细胞染色质的基本结构单位。在其,种组蛋白组分(,,、,,,、,,,、,,、,,)中，除,,的,末端富含疏水氨基酸。,末端富含碱性氨基酸之外，其余,种在,末端富含碱性氮基酸(如精氨酸、赖氨酸)，,末端寓含疏水氨基酸(如缬氨酸、异亮氨酸)。在形成聚合体的过程中，组蛋白,,,、,,,,、,,,、,,,的,端的疏水氦基酸相互结合，而,端的碱性氢基酸则向四面伸出，以便与,,,分子相互作用(伸出的碱性氨基酸就是“组蛋白的尾巴”)。表观遗传调控是通过改变染色质的结构来调控基因豹表达，其中一个重要的过程是组蛋白核小体尾巴的乙酰化与脱乙酰化。通常乙酰化与基因的表达有关，脱乙酰化与基阑的抑制相联系，而催化这两个过程的关键酶为组蛋白乙酰转移酶(,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,)和组蛋白脱乙酰化酶(,,,,,,, ,,,;,,,,,,,,。,,,)。,(, ,组蛋白乙酰转移酶与脱乙酰化酶的发现和分类 自从四十多年前人们发现组蛋白的乙酰化与脱乙酰化(,,,,,,, ,, ,,，,,,,)以来，组蛋白的乙酰化与脱乙酰化一直是表观遗传学研究的热点之一。随着人们对它们研究的不断深入，对参与组蛋白的乙酰化与脱乙酰化的相关酶及基因的研究也日益增多。第一个组蛋白乙酰转移酶是,,,,年,,,,,,,,等在四膜虫的核区纯化出,,,的一个亚单位,,,，发现它与酵母的转录因子,;,, ,极为相似，并证明,;,, ,本身就是一种,,,。随后，许多组蛋白乙酰转移酶在各种生物中相继分离与鉴定。真核细胞,,,分为两种类型:,型主要存在于细胞核中，与染色质结合，乙酰化 染色质组蛋白:,型主要存在于细胞质中，乙酰化游离的组蛋白;此外，序列结构分析表明组蛋白乙酰转移酶主要分为四种类型:第一类为,,,,(,,,,,,,,,,,, ,(,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,)类型:第二类为,,,,类型(,,,,,,, ,, ,,，,,,,;,,,,,, ,, ,,，,,,,)，它的一些成员除了催化组蛋白外，还可以催化非组蛋白和一些小分子物质;第三类为,,,,,,,,,结合蛋白(,,,)辅激活子类型，在动物中该类型的成员与细胞周期的控制、分化及细胞凋亡有关(,,,,,,,,, ,, ,,，,,,,;,,,,, ,, ,,，,,,,);第四类为,,,,,,,类型(,,,,,, ,, ,,，,,,,)。中圜农业人学博,(学化论文 掉一章 文献综述 ,,,,年(美国哈佛人学的,,,,,,,管利用组蛋白脱乙酰化抑制剂,,,,,,,,经改造后作亲和基质，分离了嬲个核蛋白，通过对这两个蛋白进行测序发现其中一个与,,,,,等(,,,,)在酿酒酵母中发现的与基冈转录调,,有关的蛋白质,,,,有同源性:义从表达序列标签数据库(,,,,,,,,,,,, ,,？,,,;, ,,, ,,,,,,,,(,,,,,)中找到两条人的相关的;,,,部分序列，以人,,,,,,,细胞;,,,文库为进行,,,扩增，获得,,,的,,,产物，再筛选文库，获得数个刚性克降，其中一个包含全长的;,,,(推导出其蛋白质含,,,个氧基酸，分子量约,,,,，与酵母,,,,有,,,的同源性。其重组蛋白有组蛋白脱乙酰化的活性，命名为,,，(,,,,,, ,,,;,,,,,,,，后有人称其为,,,,,)。,,,,,发现席，,,,,,,,,等(,,,,)也证实了酵母,,,,与酵母组蛋白的脱乙酰化有关:禽有酵母,,,,的复合物可使组蛋白脱乙酰化:而,,,,突变可提高组蛋白,,和,,的乙酰化。,,,,年末，美国南佛罗里达大学的,,,,等(,,,,)利用酵母舣杂合系统寻找与哺乳动物转录冈子,,，相且作州的蛋白质，结果找纠,广另一个与酵母,,,,有高度同源性的人和鼠的,,,,，它有转录抑制活性，与,,,,,相比有,,,的一致性(并命名为,,,,,。组蛋白脱乙酰化酶在许多生物中也被分离克隆。根据这些酶的序列特钮,，组蛋白脱乙酰化酶也存在四种不同的类型(〔(,,,,, ,, ,,，,,,,):第种为,,,,型(第二二种为,,,,型(,,,,, ,,, ,,,,,，,,,,;,,,,,,,, ,, ,,，,,,,;,,,,,,,, ,, ,,，,,,,，,,,,)，第二种为,,,型(,,,,,, ,, ,,，,,,,)，是植物特异的，,?要存在丁细胞的核,:中，第四种为依赖丁,,,行使催化作用的,，,,类型(,,,, ,,,,(,,,,;,,,,,, ,, ,,，,,,,)。,(,(,组蛋白乙酰化作用位点 组蛋白乙酰化并不是发生在组蛋白尾巴的所有位点。除了,,量梢员灰阴; 猓 诵淖榈鞍淄ǔ,校矗 蹈隼蛋彼岵谢 挥畔纫阴; 纾仆妓 尽,ǔ, 叨缺,氐模龋常 耍埂?龋骋唬耍保础?龋常 耍保浮?龋常 耍玻场?龋矗 耍怠?龋矗 耍浮?龋矗 耍保埠停龋矗 耍保兜任坏愕囊阴; 牖 虻谋泶镉泄兀ǎ牵颍酰睿螅簦澹椋睿 保梗梗埃 ,谥参镏校 龋矗 耍怠?龋矗 耍浮?龋矗 耍保病?龋矗 耍保都埃龋矗 耍玻暗任坏阌畔缺灰阴; ǎ蹋酰螅螅澹?,, ,,，,,,,)。虽然研究表明组蛋白乙酰化与基因的表达有关，但是，在果蝇中的,异染色体和酵母中的异染色体沉默位点中，,,(,,,位点也优先被乙酰化(,,,, ,,，,,,,;,,,,,,,,,, ,, ,,(,,,,)。中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述,(,(,组蛋白乙酰化作用机制 关于组蛋白,,酰化与脱乙酰化影响基因转录的作用机制目前有几种假设:首先组蛋白乙酰转移酶将乙酰辅酶,上的乙酰基转移到组蛋白的氨基末端尾巴上，中和了上面的正电荷(,,,,,,,,,,,，,,,,)，从而削弱了带负电荷的,,,与组蛋白的结合，使染色体结构松散而利于基因的激活表达;相反，组蛋白脱乙酰化酶将组蛋白尾巴上的乙酰基移走(增加了上面的正电荷，,,,与组蛋白结合紧密(,,,, ,,, ,，,,,，,,,,)，阻碍了启动子与转录机器的结合(,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,,)(因而弱乙酰化状态与基因的抑制有关。最近的研究表明，组蛋白乙酰化可以抑制核小体序列折叠成更复杂的结构(,,, ,, ,,，,,,,)，因此组蛋白乙酰化与脱乙酰化可以直接通过影响染色质高级结构的形成来调控基因的转录(,,,, ,,, ,,,,,,,,，,,,,)。此外，组蛋白的乙酰化与脱乙酰化还可以为激活子与抑制子提供结合位点来调控基因的表达及有利于常染色质、异染色质的形成。在酵母与哺乳动物细胞中，许多组蛋白己酰转移酶与激活子相联系，组蛋白脱乙酰化酶与抑制子共同包含在一个抑制复合物中(,,,,, ,,, ,,,,,,,,，,,,,)。例如，在酵母中，,,的弱乙酰化及,,,—,(,,的去乙酰化对于转录抑制子,,,,结合到异染色质区域是必不可少的(,,,,,, ,, ,,，,,,,;,,,,,,, ,,，,,,,)。,(,(,组蛋白乙酰化、脱乙酰化的生物学功,,, ,, 能,(,(,(,组蛋白乙酰化和脱乙酰化与转录调节,)组蛋白乙酰化、脱乙酰化与染色质构象 体外研究发现，在类似生理条件的离子强度和缺乏, ,时，将乙酰化的组蛋白八聚体与海胆的, , , , , ,基因的线状, , ,结合后，乙酰化的核小体复合物呈伸展状态，而未乙酰化的对照组核小体的构象呈紧缩状态(,,,;,, ,,,,,,,, ,, ,,，,,,,)。如在体外将组蛋白乙酰化，可发现与其结合的染色质折叠程度降低(,,,,,,,,,，,,,,)。,)组蛋白乙酰化、脱乙酰化与转录活性 组蛋白乙酰化与转录活性有密切关系:高乙酰化组蛋白特异地聚集在染色质功能区:低乙酰化组蛋白聚集在无转录活性的非功能区。体外将核心颗粒中,,,,,,,二聚体乙酰化(,,,,,, ,,,,，,,,,)或(,,?,,),四聚体乙酰化(,,,,,,,, ,, ,,，,,,,)后，组蛋白对转录的抑制作用大大减弱，,,,合成效率提高。用, ,,抑制,,后，组蛋白,,乙酰化程度提高，可引起人类脐静脉内皮细胞中组织纤溶酶原激活因子(, , ,)产量增,,,,(,,,, ,, ,,，,,,,)。,,,,,,,等(,,,,)发现, , ,诱导的组蛋白乙酰化与组蛋白,,。(,,家族中一类分化相关蛋白)基因袭达密切相关。,,。启动子对染色质乙酰化很敏感，,,单一乙酰化已足以使其表达增加。用,,, ,,,,,,处理野生型, ,,,细胞可观察到,,。基因的高表达，在其衍生的, , ,抗性细胞系, ,,,,(无 ,中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 , , ,时，单一乙酰化的,,水平已经很高)中，也能观察到,,。的高表达。,,，，,,,,等(,,,,)展近发现:,，,,病毒基因与宿主细胞基因组整合后，在其启动子转录起始位点有一个核小体 (,,,(,)，可抑制,，,,基因转录，使宿主细胞处于潜伏期。用,,,,,,,,或, , ,抑制, ,可使,,;(,破裂，,，, ,转录启动，病毒产量人大增加。这说明,，,,转录激活可通过染色质化学修饰完成。以上事实都表明组蛋自己酰化可激活转录。 组蛋白脱乙酰化与基因转录的关系比较复杂。一般认为，核心组蛋白脱乙酰化导致基因转录受抑制。早在,,,,年，,,,,,等(,,,,)就发现(具有组蛋白脱乙酰化酶活性的,,,,缺失的酵母中，有的基因转录活性提高了,,,倍，表明酵母,,,,可抑制基因转录。,,,,等(,,,,)发现,,,,,既可介导,,,的转录抑制效应(也有直接抑制转染质粒转录的作用。,,,,等(,,,,)也发现,,,(,,,,,融合蛋白可抑制体外转染质粒的转录。最近，有几个实验室同时报道了组蛋白脱乙酰化酶与某些位点特异的,,,结合的转录抑制子之间的关系。,,,,,等(,,,,)认为:首先(,,,结合的转录抑制子(如,,,家族、非配体化的核受体、,,,,)结合到转录共抑制子,,,,(包括酵母,,,,或哺乳动物的,,,,,和,,,,,)上，,,,,再结合组蛋白脱乙酰化酶,,,,，此复合物位于启动子附近，使中心组蛋白脱乙酰化，基因转录受到抑制。此外，转录共抑制子,(,,,或,,,,也能与,,,,结合，再共同与,,,,结合成复合物，抑制转录。还有其它蛋白质 (例如,,,,,、,,,,,、,,,,,,、,,,,,,等)也可能参与了复合物的形成。综上所述，组蛋白脱乙酰化酶可能晟终介导了位点特异,,,结合的转录抑制子的转录抑制功能。但是，并非所有转录抑制子的转录抑制功能都是由组蛋白脱乙酰化酶介导的(,,,,, ,, ,,，,,,,)。例如，有人发现，酵母,,,,对于转录抑制子,,;,,,,,,和,;,,也不是必要的。 另外，有人发现，缺失,,,,,,中与,,,,,相互作用的区域后，没有消除,,,,,,,的转录抑制功能:还有人发现，,,,,,,,的截断形式,,,,,,,,不能与,,,,,结合，但能抑制转录。 这都说明，共抑制子,,,,,,,和,,,,,,的抑制转录功能也并非必须结合组蛋白脱乙酰化酶。因此，组蛋白脱乙酰化可能是介导某些转录抑制子的抑制转录的充分条件(陈坚，,,,,)。 此外，有研究表明，酵母、人类、植物等生物中启动子区,,和,,的乙酰化与基因的表达有关(,,,,, ,,。,,,,;,,,,, ,, ,,，,,,,;,,,, ,, ,,，,,,,)，然而并不是只有启动子区的乙酰化与基因的表达有关(,,,,,,, ,, ,,(,,,,;,,,,,(,,,,,,,,,, ,,，,,,,)，编码区也发生组蛋白的乙酰化与脱乙酰化，表明组蛋白乙酰化与脱乙酰化不仅与基因转录的起始有关，还与转录的延伸有关。另外，组蛋白的乙酰化也与基因的抑制有关，而脱乙酰化也可能与基因的表达有关。例如 ,, ,,，酵母中的组蛋白脱乙酰化酶,,,,,直接与基因的表达相联系，而不是与抑制有关(,,,,,,,,)。此外，,,,,,等(,,,,, ;, ,,，,,,,)发现，在,,,,缺失的酵母中，也可使一些基因转录抑制,,,倍。后来，,,,,,,,等(,,,,)也发现，酵母,,,,的缺失抑制了,,,,启动子的激活。,,,,,,,,,,等(,,,,)则发现，果蝇,,,,的缺失抑制果蝇某些基因的转录激活。这些都说明组蛋向脱乙酰化酶还可能介导基因转录的激活。, ,(,(,组蛋白乙酰化、脱乙酰化与细胞周期的关系 ,,的强效抑制剂,,,可抑制细胞增殖。用正常大鼠成纤维细胞研究发现(,,,,,,, ;, ,,，,中国农业太学博士学位论文 第一章文献综述,,,,):,,,可将增殖细胞特异地锁定在,,和,,期，可见,,， ,,期的演进需要,,,。去除,,,后，锁定在,,期的细胞同步进入,期，而锁定在,,期的细胞不能进入,期，而是再次进入,期，形成增殖性四倍体细胞。这可能是由于细胞内形成了,,到,,期的直接通道，造成周期反复现象。用, , ,,,及,,, , ,,,的,,,处理野生型,,,,细胞，使其,,,的,,乙酰化后仍可进行细胞分裂，如用浓度更高的, , ,处理，则细胞增殖受抑制(,,,;,, ,, ,,，,,,,)。这表明至少,些染色质功能区的组蛋白乙酰化可造成生长抑制。,,,引起的细胞周期锁定可能是由于其造成的组蛋白高乙酰化状态干预了细胞周期调节因子(,,周期蛋白)的作用。 ,,,,,,等(,,,,)发现，酒精酵母中组蛋白,,尾部区域的赖氨酸(乙酰化的靶氨基酸)如困被精氨酸替代而不能乙酰化，则导致酵母细胞生长缓慢，如因被谷氨酸(模仿乙酰化的赖氨酸)替代而不能脱乙酰化，则导致,,,,期的延长，表明组蛋白,,的乙酰化和脱乙酰化对于细胞周期进程是必需的。,,,,,,也认为，乙酰化和脱乙酰化导致染色质结构的改变，对于负责细胞周期调控的基因的转录是必需的。,,,,,,,等认为，组蛋白脱乙酰化与细胞周期有关可能是由于:组蛋白脱乙酰化后，使一些细胞周期的特异性调节蛋白如周期蛋白依赖性激酶抑制剂的转录获得上调。,(,(, ,与细胞分化、衰老的关系 ,,,具有很强的诱导,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)细胞分化的作用(,,,,,,, ,, ,,(,,,,)(将,,,细胞暴露在,,,,,,浓度的,,,,,, ,即可产生高分化的血红蛋白阳性细胞。用,,,处理分化极低的肿瘤细胞，如,,,,细胞，,,细胞和其它转化细胞，可诱导其形态学分化，变得与正常细胞形态相似(,,,,,,,,, ,, ,,，,,,,)。人类自血病,,,,细胞中，乙酰化,,在编码区附近较多，而中心和端粒异染色质, ; , ,,,重复序列的,,只有少量(,,,)乙酰化:用二甲基亚砜诱导,,,,分化后，编码区,,乙酰化程度不变，但中心异染色质区,,乙酰化水平短暂升高 (,,,,,,, ,, ,,，,,,,)。这表明分化与核心蛋白乙酰化可能有某种联系。,,,可影响胚胎发育，低浓度,,,可在间充质形成前早期原肠胚阶段抑制海星胚胎发育。,,,处理非洲爪蟾胚胎可延迟其原肠胚形成，阻止正常的中胚层形成，表明组蛋白乙酰化调节在原肠胚形成阶段起重要作用。近来发现(,,,处理人类癌细胞系可诱导产生凝溶胶蛋白(,,,,,,,,)，一种;,,，依赖性肌动蛋白纤.