β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素引起星形胶质细胞ERK磷酸化的信号传导途径(可编辑)

β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素引起星形胶质细胞ERK磷酸化的信号传导途径(可编辑) β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素引起星形胶质细 胞ERK磷酸化的信号传导途径 中国医科大学 硕士学位 β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素引起星形胶质细胞ERK磷 酸化的信号传导途径 姓名:李红梅 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:彭亮 20080501?英文缩略语? 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料,与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 论文作者签名: 查兰堑 中国医科大学研究生学位论文版权使用 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学,且导师 为通讯作者,通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容保密内容除外,以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 吝争栳 论文作者签名: 指导教师签名: 日?中文论著摘要? 一肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素引起 星形胶质细胞磷酸化的信号传导途径 月 吾 在脑内,肾上腺素能和去甲肾上腺素能神经元位于脑桥和延髓,分别向上和 向下投射神经纤维,其支配区域相当广泛,包括大脑皮质、边缘叶、海马和脊髓。 正常状态下,对维持脑的功能发挥重要作用。在病理状态时,去甲肾上腺素除了 与抑郁症有关外,目前研究发现在多发性硬化病人的脑白质中,星形胶质细胞出 现.肾上腺素受体的丢失;在老年性痴呆的病人,蛋白耦联受体细胞内信号传 导系统、和蛋白激酶功能降低。 神经胶质细胞可分为星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。其中星形 胶质细胞是哺乳动物脑内分布最为广泛的一类细胞。星形胶质细胞从胞体伸出许 多长且有分支的线状伪足,并黏附在微血管周围。相邻星形胶质细胞间有缝隙连 接,缝隙连接处狭窄,只允许小分子物质通过。星形胶质细胞是不可兴奋型细胞, 具有支持、营养神经细胞,维持细胞外液离子平衡,构成血脑屏障 及合成神经活 性物质的功能,同时表达多种生物活性物质的受体,并且在免疫调节中起着重要 作用。 上皮生长因子受体的间接激活是近年来发现的 细胞内/外信号传导途径,是细胞根据外界刺激调节自身功能的一种巧妙方式。 蛋白耦联受体激活或外界刺激,导致某种生长因子的释放,进而激活自 身和相邻的酪氨酸激酶受体,产生与直接激活酪氨酸激酶相似效应的过 程。被配体激活后启动细胞内信号传导,经过细胞质中衔接蛋白、酶的级 联反应等,调控细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡,并且与肿瘤的形成与恶化 密切相关。 .肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素对细胞的调节具有细胞特异性。在某些细胞异丙肾上腺素能够引起上皮生长因子受体的激活,而在另一 些细胞则抑制细胞外信号调节激酶的磷酸化;即使同样是一肾上腺素受 体激活所引起的磷酸化,其信号传导通路也不尽相同。本篇文章 主要研究在 星形胶质细胞,.肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素是否引起的间接 激活;异丙肾上腺素引起磷酸化的信号传导途径。 方法 星形胶质细胞取材于新生.小鼠大脑皮层。无菌操作,断头剥离脑膜后, 取出脑组织。显微镜下分离出大脑皮层,切碎后加入培养液充分振荡分钟。分 葡萄 别过岬和 滤膜,放入培养皿中。用含有. 糖的培养基进行培养,每周更换两次新鲜培养液,培养三周后用于实验, 实验前一周加入促进细胞分化成熟。首先在培养皿中加入、.、 、肝素、或其中任一种抑制剂,孵育分钟。再加入 异丙肾上腺素,孵育分钟。移出培养液,应用清洗细胞后,加入“/ 皿裂解液收集细胞。匀浆后的样品进行免疫凝胶电泳半定量测定/磷酸化水 方法进行比 平。使用 .软件进行统计,多组资料用 较,.表示差异具有统计学意义。 结果 当日弋 、异丙肾上腺素诱导的磷酸化 在星形胶质细胞,异丙肾上腺素引起的磷酸化。异丙肾上腺素浓 度为 、 、州和小时,磷酸化水 时,忍略有升高,而在 异丙肾上腺素引起的磷酸 平显著升高,差异具有统计学意义。并且 化作用时间较长,、和分钟后均引起了的显著增高,差异具有 统计学意义。 、蛋白抑制剂的作用 蛋白抑制剂百日咳毒素不能抑制由异丙肾上腺素引起的 .“/ 磷酸化,差异具有统计学意义。表明.肾上腺素受体激动剂引起的 磷 酸化与蛋白的丫亚单位无关。 、抑制剂的作用 抑制剂.不能抑制由异丙肾上腺素引起的磷酸化,差异 具有统计学意义。表明一肾上腺素受体激动剂介导的磷酸化与无 关。 、诱导的磷酸化 在星形胶质细胞,?/特异性激活剂’...能够 引起的磷酸化,差异具有统计学意义。表明及其下游调节机制参与了 .肾上腺素受体激动剂介导的磷酸化过程。 、金属蛋白酶抑制剂和肝素的作用 依赖性金属蛋白酶抑制剂和 /肝素均不能抑制由 异丙肾上腺素引起的磷酸化,差异具有统计学意义。表明.肾上腺素受体激 动剂引起的磷酸化与金属蛋白酶无关,并且也无.的剥离释放。 、和抑制剂的作用 “上皮生长因子受体特异性拮抗剂能够部分抑制由异丙肾上腺素 引起的磷酸化,而 酪氨酸激酶抑制剂能够完全抑制此磷酸化 过程,差异均具有统计学意义。表明异丙肾上腺素介导的磷酸化,可通过 酪氨酸激酶直接引起上皮生长因子受体激活,进而引起的磷酸化;并且 酪氨酸激酶也可能直接激活。 讨论 传统的.蛋白激酶途径是以靶细胞内浓度改变和激活为主 要特征。被激活后,能在存在的情况下使许多蛋白质特定的丝氨 酸和/或苏氨酸残基磷酸化,从而调节细胞的物质代谢和基因表达。最近研究发现 在哺乳动物细胞,可直接激活和/或/。是一种由. 直接激活的交换蛋白,能够进一步激活 和。 与/和蛋白耦联受体所引起的上皮生长因子受体间接激活有所不同, 蛋白耦联受体激活的信号传导途径更为复杂。由不同的蛋白耦联受体 激活上皮生长因子受体,其生理功能可完全不同,原因可能有以下两点:上皮 生长因子受体激活的强度及持续时间不同,/和蛋白耦联受体所引起的 磷酸化,一般发生快,持续时间短,大约在至分钟达高峰,然后很快下降 至消失;而.伊引起的磷酸化持续时间较长。配体与受体结合时,引 起的二聚化作用,可以形成同型二聚体,也可以和、、 形成异型二聚体。 上皮生长因子受体间接激活的信号传导途径不仅取决于蛋白耦联受体的种 类,而且也依赖于细胞的种类。随着研究的不断深入,人们发现蛋白耦联受 体的激活在某些细胞,如细胞,也能引起上皮生长因子受体的激活,而在 另一些细胞,如成纤维瘤细胞和血管平滑肌细胞,则抑制的磷酸化。 即使同样是.肾上腺素受体激活所引起的磷酸化,在细胞此磷酸化是 由.肾上腺素受体的蛋白转变成蛋白所引起,而且不能被所替代; 而在淋巴瘤细胞磷酸化是通过/信号通路完成的。在星形胶质细 胞情况则更为复杂,、/、和可能都参与了异丙肾上腺素引 起的磷酸化。 结论 在星形胶质细胞,.肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素与.肾上腺素受体结 合后,催化蛋白,使细胞内浓度增高,进而激活,通过与酪 氨酸激酶有关的途径直接引起上皮生长因子受体的激活,进一步引起磷酸 化;并且酪氨酸激酶也可能直接激活。 关键词 上皮生长因子受体; 星形胶质细胞; 异丙肾上腺素; .肾上腺素受体; 间接激活;;; ?英文论著摘要 .. . . , ,, . .一 , .. . , . , , ,. , . ‘’ ? . ?一 . , , . . . ; . 一 , ,. , , , ,肛 心【,’ . . % , /%:%. / , ./ ?.. , 嬲 . .% % 鹇 , . %?.、析 .. , . . . .? , , 尼./, . , , , . . , , .. ./ 所 陀, 所 . . ., ,. . / ?. , .?, ,州?/ , .. ,.?陀 , , ,.. , , , , , /. . / . / , ./.. / , . ./ ... , ,,. ., ,. . ,一. ,/ . ,,, . ; ;;;; ;; ?论文? 一肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素引起 星形胶质细胞磷酸化的信号传导途径 刖 吾 、脑内肾上腺素能系统及肾上腺素受体 在脑内,肾上腺素能和去甲肾上腺素能神经元位于脑桥和延髓。去甲肾上腺 素能神经元胞体密集在蓝斑核。从蓝斑核向前脑方向发出三束投射纤维,分别是 中央被盖束、中央灰质背纵束和腹侧被盖一内侧前脑束。三束纤维主要同侧上行支 配大脑皮层各区、边缘系统包括扣带回,杏仁核、海马、下丘脑和中脑被盖等核 团、丘脑和上丘、下丘、蓝斑核,另发出投射纤维到小脑,终止于小脑皮质和中 央核群。蓝斑核下行去甲肾上腺素能纤维投射到延髓及脊髓。正常状态下,对维 持脑的功能发挥重要作用【。在病理状态时,目前研究发现去甲肾上腺素除了与 抑郁症有关外,在多发性硬化病人的脑白质中,星形胶质细胞出现.肾上腺素受 体的丢失【。在老年性痴呆的病人,蛋白耦联受体细胞内信号传导系统、 和蛋白激酶功能降低。 目前已经发现脑内肾上腺素受体分为【和两种,.肾上腺素受体又可进一 步分为、和三种亚型。.肾上腺素受体是典型的蛋白耦联次跨膜受体 超家族成员。它们全部是只含有一条肽链的糖蛋白,其端在细胞外侧,端在 细胞内,中段形成七个跨膜螺旋结构和三个细胞外环与三个细胞内环。这类受体 的特点是其胞浆面第三个环能与鸟苷酸结合蛋白简称蛋白相耦联,从而影 响腺苷酸环化酶或磷脂酶等的活性,使细胞内产生第二信使。在原代培 养的小鼠脑星形胶质细胞中,每个细胞含有大约 蛋白【,每毫克蛋白结合 . 分子的双氢烯丙心胺,表明每个细胞含有大约个/子上腺素受体 ×母.×。在星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的细胞表 面均有.肾上腺素受体的表达,但是细胞的不同分化状态决定其表达水平【。在 前脑、大脑皮层和小脑,.肾上腺素受体主要在星形胶质细胞上表达【。 星形胶质细胞表达.、睨.、.和.肾上腺素受体【刀’是中枢去甲肾上腺素 能系统的主要作用靶点【】 一和.肾上腺素受体为和/蛋白耦联受体,. 肾上腺素受体为蛋白耦联受体。蛋白耦联受体在细胞增殖、分化、存活中 起关键的调节作用,在众多诸如肿瘤和记忆形成的生物学过程中扮演重要角色【】。 .肾上腺素受体的激活对星形胶质细胞的分化成熟【、糖原合成与分解‘】、谷氨 酸摄取【、激活“,.酣’、增加缝隙连接通透性【及免疫反应等具有 深远的影响。星形胶质细胞的.肾上腺素受体作为潜在的药物作用靶点,不仅能 够降低神经炎症反应,并且能够提供神经保护作用【】。活体脑内.肾上腺素受体 激动剂能够减少缺血后的梗塞面积:在混合的海马培养中,.肾上腺素受体的激 活能够降低谷氨酸介导的神经元损伤。 、星形胶质细胞 神经胶质细胞按形态可分为原浆性和纤维性星形胶质细胞、少突胶质细胞和 小胶质细胞【。其中星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞,也是 胶质细胞中体积最大的一种,约占脑细胞容量的%。原浆性星形胶质细胞多分 布在灰质,细胞突起粗短,分支多,胞质内胶质丝较少。而纤维性星形胶质细胞 在白质中占优势,突起细长,分支较少,胞质中含大量胶质丝。星形胶质细胞从 胞体伸出许多长且有分支的线状伪足,并黏附在微血管周围】。相邻星形胶质 细胞间有缝隙连接,缝隙连接处狭窄,只允许小分子物质通过。星形胶质细胞是 不可兴奋型细胞【,这就意味着它不能产生动作电位。中枢神经系统去 极化导致神经元的勾流,而缺乏电压依赖性通道的星形胶质细胞没有 的内流。星形胶质细胞具有支持、营养神经细胞,维持细胞外液离子平衡,调控 神经递质循环,构成血脑屏障及合成等神经活性物质的功能,同时表达多种 生物活性物质的受体,并且在免疫调节中起着重要作用。 在神经系统发育时期,星形胶质细胞有引导神经元向一定部位迁移的作用。 星形胶质细胞可促进神经元之间突触的建立并使其传导速度增加.倍,并且能 通过突触对神经元的活动进行调控团’。目前认为,突触是神经元轴突终末、树突和胞体及星形胶质细胞的突起共同构成的三重突触结构【。星形胶质细胞在突 触发生、突触传递的调节和突触可塑性中发挥极为重要的功能【】。 、上皮生长因子家族及其受体在脑内的表达 ; 上皮生长因子家族有七个成员阳:上皮生长因子;、 、肝素结合上皮生长因子;.【、双向调节素 转化生长因子. 、、和。脑内只表达前四种【’。 .存在于脑内的神经元及星形胶质细胞【】,在幼龄动物中的表达比成年动 物多【。.的基因表达在大脑缺血【’、兴奋毒性及脑损伤中增强口?。 .的为. .含个氨基酸残基,通过特 ,其前体 定的金属蛋白酶水解近膜区,释放出.。成熟的.是可溶性蛋白, 含个氨基酸残基,由保守区、.端肝素结合区及.连接的寡聚多糖组成。 肝素可与.作用从而阻断其与上皮生长因子受体的结合。 上皮生长因子受体广泛存在于脑内【,包括、、 和,被归入瑚三/家族,同属于受体酪氨酸激酶。星形胶质细胞表达 及少量的。由三部分组成【,胞外区:在 端,为配体结合区。跨膜区胞内区:由近膜区、酪氨酸激酶 区、.末端等三个亚区构成。自身磷酸化位点位于.末端,其中、、 为主要位点,、为次要位点,与信号传递密切相关。配体与受体 结合后,引起受体的二聚化作用,可以形成同型二聚体,也可以和、 或形成异型二聚体。二聚化的受体发生交联磷酸化,即一个受体使另 外一个受体上特定酪氨酸残基磷酸化。被配体激活后启动细胞内信号传导, 经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应,指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋 亡,且与肿瘤的形成和恶化密切相关。 、的间接激活途径 亚区随着二聚体的形成及.末端酪氨酸的磷酸化而被激活是信号传导的 第一步。受体.末端上特定的酪氨酸残基被磷酸化,为具有结构域的蛋白质 信号分子提供停泊位点阳,这些信号分子包括:衔接蛋白如等,激酶如 等。上皮生长因子受体间接激活是近年来发现的细胞内/ 外信号传导途径,是细胞根据外界刺激调节自身功能的一种巧妙方式。它是指通 过蛋白耦联受体激活或外界刺激,导致某种生长因子的剥离释放, 释放的生长因子进而激活自身和相邻细胞的酪氨酸激酶受体,产生与直接激活酪 氨酸激酶受体相似效应的过程。间接激活对于调节星形胶质细胞自身功能及其周 围神经元细胞的功能有重要作用,成为星形胶质细胞调节与其相 邻的神经元细胞 增生、分化、生长等效应的关键环节。 经典的上皮生长因子受体间接激活的信号传导途径为【】:蛋白耦联受体激 活后,由三合体蛋白的丫亚单位通过尚未清楚的步骤激活了细胞内金属蛋白 酶,在后者的作用下上皮生长因子家族成员,如.前体由细胞膜表面剥离 脱落释放于细胞外液,然后具有活性的生长因子结合于细胞自身与邻近细胞的上 皮生长因子受体,导致上皮生长因子受体自身磷酸化。研究发现,在星形胶质细 胞右旋美托咪啶能够间接激活上皮生长因子受体【’。释放 的.在脑内不仅作用于星形胶质细胞,还作用于相邻的神经元细胞。因此, 间接激活很可能成为睨一肾上腺受体激动剂神经保护效应机制的基础。同时发现 【,在.细胞蛋白的丫亚单位也可激活家族非受体型蛋白酪氨酸激 酶,后者进一步引起和的酪氨酸残基磷酸化,激活细胞内的信 号传导通路。 、.肾上腺素受体激动剂对细胞的调节具有细胞特异性 上皮生长因子受体间接激活的信号传导途径不仅取决于蛋白耦联受体的种 类,而且也依赖于细胞的种类。随着研究的不断深入,人们发现蛋白耦联受 体的激活在某些细胞,如细胞,也能引起上皮生长因子受体激活【】,而在 另一些细胞,如成纤维瘤细胞和血管平滑肌细胞,则抑制的磷酸化。 即使同样是.肾上腺素受体激活所引起的磷酸化,在细胞此磷酸化是 由.肾上腺素受体的蛋白转变成的蛋白所引起,而且不能被所替代 】。蛋白激活后转变为蛋白,引起阶亚单位从蛋白分离,进而激活金 属蛋白酶,导致生长因子前体水解脱落。此过程可被蛋白抑制剂百日咳毒素所 阻断,但对蛋白抑制剂霍乱毒素不敏感。而在淋巴瘤细胞磷酸化是通过 /信号通路完成的【。最近发现细胞膜渗透型类似物双丁酸环腺苷酸毙够激活 和,而后者进而激活 和,在诱导的细 胞效应中起着重要作用。激活后的尼可以磷酸化许多种蛋白来调 控细胞的生 理功能,如细胞增殖、调节细胞周期、细胞骨架的再造等阳。 我们将检测在星形胶质细胞,.肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素引起 磷酸化的信号传导途径。异丙肾上腺素引起的磷酸化是否通过蛋白 介导;是否通过传统的.途径;是否有的间接激活; 是否有酪氨酸激酶的参与。我们假设,在星形胶质细胞异丙肾上腺素 引起的磷酸化可能与下列因素有关:.肾上腺素受体激活后,细胞内 浓度升高,可以激活和/或/,进而激活酪氨酸激酶。而 酪氨酸激酶可能通过尚不清楚的步骤导致上皮生长因子受体磷酸化;或者通过激 活金属蛋白酶导致生长因子前体剥离脱落,而由活化的生长因子激活上皮生长因 子受体,进而引起磷酸化;也可由酪氨酸激酶直接引起磷酸化见 图。 实验材料和方法 、实验动物 .小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。 、试剂 马血清购自公司;、、和购自 公司;、.、、和购自公司;肝 素购自北京奥博星生物技术责任有限公司;’一..购自 购 公司;一抗和一抗、二抗羊抗兔 和二抗羊抗鼠 自美国公司; 、原代星形胶质细胞培养 星形胶质细胞取材于新生.小鼠大脑皮层。无菌操作,断头剥离脑 膜后, 取出脑组织。显微镜 下分离出大脑皮层,将其切碎,组织 块要小于删,然后将切碎的组织移入离心管中,放在涡旋器上充 分振荡分 培养皿,孵 钟,分别过和 滤膜。将细胞混悬液放入 培养皿。细胞使用 育在、%的培养箱中,一个大脑可以铺个 / ., 含有. 葡萄糖的培养基. ,. / . / / / , ,. 呻, . / ,初始为%马血清的培养液,每隔三天更换 一次新鲜培养液,第三次更换的培养液浓度降为%。当培养两周细胞铺满整个 培养皿时,加入. ,能够促进细胞分化成熟。 、药物处理 将原代培养成熟的星形胶质细胞分成四组,分别为对照组、异丙肾上腺素、 抑制剂和异丙肾上腺素加抑制剂组。首先在含有抑制剂的实验组中加入、 .、、肝素、和其中任一种抑制剂,在相应的实验组中加 入抑制剂的对照二甲基亚砜或生理盐水,孵育分钟。随后在含 有异丙肾上腺素的实验组中加入 异丙肾上腺素,相应的实验组中加入生,. , 理盐水,孵育分钟。移出培养液,应用冷?, , ,. 和. 一, .清洗细胞后,加入 , /皿裂解液.%,%, ,. .,收集细胞。 , 、蛋白印迹分析 样品匀浆,应用方法【进行蛋白定量。取嵋星形胶质细胞样品 做.电泳,转入硝酸纤维膜上,%的脱脂牛奶封闭小时。用 ., 或一抗在室温中孵育小时。用. ,.% 洗膜次时间分别为,,,分钟后,用羊抗 二抗孵育小时,再洗膜次。 鼠. 或羊抗兔 用 ,,显色,并在胶片 .,,,上感光。显出的色带用扫描仪扫描, .分析软件进行灰度分析。 、统计学方法 使用 .软件进行统计分析。多组资料用.方法进行比 较,.表示差异具有统计学意义。 结 果 、异丙肾上腺素能够引起磷酸化 在星形胶质细胞异丙肾上腺素能够引起磷酸化。总体,无明显变 化,用与、与的灰度值比值代表磷酸化程度。 、 、 在异丙肾上腺素浓度为 时,磷酸化水平略有升高,而在 . 和山时,磷酸化水平显著升高,差异具有统计学意义图。并且异丙肾上 腺素所引起的磷酸化持续时间较长图, 异丙肾上腺素作用细胞 、和分钟后出现显著升高,差异具有统计学意义。 、蛋白抑制剂对异丙肾上腺素引起磷酸化的影响 百日咳毒素能催化蛋白.亚基上的半胱氨酸一糖基化, 蛋白抑 蛋白失去了交换能力,导致蛋白不能被激活。./ 制剂不能抑制由异丙肾上腺素引起的磷酸化,差异具有统计学意义。 表明.肾上腺素受体激动剂引起的磷酸化不是通过蛋白的阱亚单位介导 完成的图。 、抑制剂对异丙肾上腺素引起磷酸化的影响 抑制剂.不能抑制由异丙肾上腺素引起的磷酸化,差异 具有统计学意义。表明.肾上腺素受体介导的磷酸化与无关图。 、/特异性激动剂能够引起磷酸化 ’一.../为山位类似物,能特异性激活/,而对 无激活作用。在星形胶质细胞,“ ’一...能够引起磷酸 化图,差异具有统计学意义。表明及其下游调节机制参与了/子上腺 素受体激动剂介导的磷酸化过程。 、金属蛋白酶抑制剂和肝素的影响 . 依赖性金属蛋白酶抑制剂和 /肝素均不能抑制由 异丙肾上腺素引起的磷酸化,差异具有统计学意义。表明.肾上腺素受体激 动剂引起的磷酸化与金属蛋白酶无关图,并且也无.的剥离释 放图。 、抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂的影响 上皮生长因子受体特异性拮抗剂能够部分抑制由异丙肾上腺 素引起的磷酸化图,而 酪氨酸激酶抑制剂能够完全抑制 此磷酸化过程图,差异均具有统计学意义表明酪氨酸激酶参与一肾上腺 素受体激动剂异丙肾上腺素介导的磷酸化。可由酪氨酸激酶直接引起上 皮生长因子受体激活,进而引起磷酸化;并且酪氨酸激酶也可能直接激 活。 图,在星形胶质细胞,.肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素引起磷酸 化的可能途径。.肾上腺素受体激动剂结合于一肾上腺素受体,可能通过蛋白 导致细胞内升高,进而激活和/或。后二者可通过与酪氨酸 激酶有关的途径直接引起的磷酸化;或者通过激活金属蛋白酶, 导致生长因 子前体,如肝素结合上皮生长因子船.前体水解脱落,而通过脱落 的生长 因子如.引起的磷酸化,上皮生长因子受体的激活,可进而激 活细胞内的和两条信号传导通路;酪氨酸激酶也可能直接激活 。 图,在星形胶质细胞,异丙肾上腺素引起磷酸化的浓度曲线。有 两种亚型,分别为 的和 的。/为磷酸化的, 、 、 、 对照组、 ,为非磷酸化的。将细胞分别在 为代表性的改变,独 或 异丙肾上腺素培养液中孵育分钟。 立的实验重复三次。分别用与、与的灰度 值比值代表磷酸化程度。对照组设为,实验组的数值用其?/比 值和/比值分别与对照组的/比值和/比值相 、 、 比,用柱形图表示。冰代表 和州与对照组差异具有统 计学意义尸.。 图,在星形胶质细胞,异丙肾上腺素引起磷酸化的时间曲线。将细 胞 分别孵育在含 异丙肾上腺素培养液中、或分钟;对照组加入同 体积.%孵育分钟。为代表性的改变,独立的实验重复两次。分别 用与、与的灰度值比值代表磷酸化程 度。实验结果化同前。,.代表、和分钟与对照组差异具有具有统计学 意义.。图,在星形胶质细胞,.肾上腺素受体激动剂介导的磷酸化与蛋白 无关。将原代培养成熟的星形胶质细胞分别孵育在不含任何处理因素 的对照组、异丙肾上腺素、蛋白抑制剂和异丙肾上腺素实验组。首 先将含有. 或同体积.%的星形胶质细胞孵育分钟,随 / 后加入 异丙肾上腺素或同体积.%孵育分钟。为代表性的改 变,独立的实验重复四次。分别用与、与 异丙肾 的灰度值比值代表磷酸化程度。实验结果标准化同前。,.代表 上腺素和异丙肾上腺素与对照组和实验组差异具有统计学意义 .。 图,在星形胶质细胞,.肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素引起的 磷 酸化与无关。将原代培养成熟的星形胶质细胞分别孵育在不含任何处理因素 的对照组、异丙肾上腺素、抑制剂.和异丙肾上腺素 实验组。首先将含有州.或.%的星形胶质细胞孵育分 钟,随后加入 异丙肾上腺素或同体积.%孵育分钟。为代表 性的改变,独立的实验重复四次。分别用.与、与 的灰度值比值代表磷酸化程度。实验结果标准化同前。卡代表 异丙肾上腺素和异丙肾上腺素.与对照组和.实验组差异具有统计学意义 .。 图,在星形胶质细胞/特异性激活剂..引起 的磷酸化。原代培养成熟的星形胶质细胞在含有’... 或 的无血清培养液中孵育分钟。为代表性的改 变,独立的实验重复三次。分别用与、与 的灰度值比值代表磷酸化程度。实验结果标准化同前。幸代表 ’...与对照组差异具有统计学意义尸.。 图,在星形胶质细胞,异丙肾上腺素介导的磷酸化与金属蛋白酶无关。 将原代培养成熟的星形胶质细胞分别孵育在不含任何处理因素 的对照 组、异丙肾上腺素、金属蛋白酶抑制剂和异丙肾上腺素实验组。 首先将含有州金属蛋白酶抑制剂或.%的星形胶质细胞 孵育分钟,随后加入 异丙肾上腺素或同体积.%孵育分 钟。为代表性的改变,独立的实验重复六次。分别用.与、 。列岛与的灰度值比值代表磷酸化程度。实验结果标准化同前。 半代表 异丙肾上腺素与异丙肾上腺素较对照组和实验 组差异具有统计学意义尸.。 图,在星形胶质细胞,.肾上腺素受体介导的磷酸化过程中无 的剥离释放。将原代培养成熟的星形胶质细胞分别孵育在不含任何处理因素 的对照组、异丙肾上腺素、肝素和异丙肾上腺素肝素实验组。首先将 含有 /肝素或同体积.%的星形胶质细胞孵育分钟,随后加 入 异丙肾上腺素或同体积.%孵育分钟。为代表性的改变, 独立的实验重复三次。分别用.与、与的灰 异丙肾上腺 度值比值代表磷酸化程度。实验结果标准化同前。唯代表 素与异丙肾上腺素肝素较对照组和肝素实验组差异具有统计学意义.。图,在星形胶质细胞,异丙肾上腺素引起的磷酸化过程中有上皮生长 因子受体的激活。将原代培养成熟的星形胶质细胞分别孵育在不含任何处理因素 的对照组、异丙’肾上腺素、上皮生长因子受体特异性拮抗剂 或.%的 和异丙肾上腺素实验组。首先将含有 星形胶质细胞孵育分钟,随后加入 异丙肾上腺素或同体积.% 孵育分钟。为代表性的改变,独立的实验重复四次。分别用.与 、.与的灰度值比值代表磷酸化程度。实验结果标准 化同前。十代表 与对照组、及异丙肾上腺素 实验组差异具有统计学意义.。,母代表异丙肾上腺素与对照组、 和异丙肾上腺素实验组差异具有统计学意义.。图,在星形胶质细胞,酪氨酸激酶参与异丙肾上腺素介导的磷酸 化。将原代培养成熟的星形胶质细胞分别孵育在不含任何处理因素的 对照组、异丙肾上腺素、酪氨酸激酶抑制剂和异丙肾上腺素实验组。 首先将含有 或.%的星形胶质细胞孵育分钟,随后 加入 异丙肾上腺素或同体积.%孵育分钟。为代表性的改变, 独立的实验重复三次。分别用.与、与的灰 度值比值代表磷酸化程度。实验结果标准化同前。木代表 异丙肾上 腺素与对照组、以及异丙肾上腺素实验组差异具有统计学意义尸.。 讨论 我们研究发现,在星形胶质细胞.肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素能够引 起磷酸化,并且所引起的磷酸化不能被蛋白抑制剂百日咳毒素、 抑制剂.和金属蛋白酶抑制剂所阻断,但可以被上皮生长因子受体拮 抗剂部分抑制,说明异丙肾上腺素可部分通过上皮生长因子受体的激活 引起磷酸化。我们同时发现酪氨酸激酶抑制剂能够完全阻断异丙肾 上腺素诱导的磷酸化。因此推测.肾上腺素受体激动剂引起的磷酸化 可能通过蛋白导致细胞内升高,进而激活,通过与酪氨酸激 酶有关的途径直接引起上皮生长因子受体的激活,进一步引起磷酸化;并且 酪氨酸激酶也可能直接激活。 传统的.蛋白激酶途径是以靶细胞内浓度改变和激活为主 要特征,配体与特异性受体结合而激活受体。活化的受体可催化的与 交换,导致的【亚基与丫解离,蛋白释放出.。.能激活腺苷酸 环化酶,催化转化成,使细胞内浓度增高。对细胞的 调节作用是通过激活系统来实现的。被激活后,能在存在 的情况下使许多蛋白质特定的丝氨酸残基和/或苏氨酸残基磷酸化,从而调节细胞 的物质代谢和基因表达【。最近研究发现在哺乳动物细胞,伊可直接激活 和/或/,是一种由:直接激活的交换蛋白【,进一步激 活 和。然而以往的介导通路研究都集中在 上,例如在体内和体外实验中与记忆形成有关已经得到证实【。现在大量证 据表明在细胞的生理学方面起着同等重要的作用【~。我们研究发现,. 肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素与.肾上腺素受体结合后,催化蛋白,使 细胞内御浓度增高,进而引起磷酸化,但这种过程并不是由介导 完成的,因为的磷酸化不能被抑制剂.所抑制。 在星形胶质细胞,睨一肾上腺素受体激动剂右旋美托咪啶能够引起磷酸 化,并且在分钟达到高峰,随后逐渐下降至消失。而.肾上腺素受体激动 剂异丙肾上腺素引起的磷酸化持续时间较长,并且可以部分被上 皮生长因子 受体特异性拮抗剂所抑制。与/和蛋白耦联受体所引起的上皮生长因子受体间接激活有所不同,蛋白耦联受体激活的信号传导途径更为 复杂,而且在多数文献中对是否有上皮生长因子受体的参与未做任何报导。由不 同的蛋白耦联受体激活上皮生长因子受体,其生理功能可完全不同,原因可能 有以下两点:上皮生长因子受体激活的强度及持续时间不同,/和蛋 白耦联受体所引起的磷酸化,一般发生快,持续时间短,大约在至分 钟达高峰,然后很快下降至消失,而引起的磷酸化持续时间较长。 配体与受体结合时,引起的二聚化作用,可以形成同型二聚体,也 可以和、、形成异型二聚体。而不同的组合可能与上皮生长因子 受体两个主要的细胞内信号传导途径和激活的不同程度有关。 有资料表明,某些酪氨酸激酶参与了.肾上腺素受体介导的信号传导过程。 在细胞中的研究发现,.肾上腺素受体激动后与.形成复合物 并富集到笼形蛋白包裹的小泡中,此复合物进一步激活【不。在神经胶质 瘤细胞中以异丙肾上腺素激动.肾上腺素受体,引起、的活性增高 以及 .磷酸化程度增加,而.是的下游底物,需通过而磷酸化垆引, 这提示.肾上腺素受体激动后其下游的信号通路存在交互作用,而这种信号之间 的交互作用可能是调节细胞功能的基本特征。在转染了不同蛋白亚基的 细胞中,.肾上腺素受体以时间和剂量依赖性方式并通过阶信号途径激活了 。在众多的信号转导系统中,信号途径是近年来的一个研究热点。 同时具有脂质激酶和蛋白激酶的活性,因而广泛参与调节细胞的多种生物功 能。研究发现,激活.肾上腺素受体可以激活下游底物亦称蛋白激酶 ,,而用抑制蛋白、蛋白肽类抑制剂抑制阶亚基,或 用抑制均完全阻断了的活性,并逆转了.肾上腺素能受体介 导的抗心肌细胞凋亡作用,从而导致细胞凋亡。提示.肾上腺素能受体通过.阶 ..信号组成一条抗凋亡途径。在本实验中,我们没有检测的活性。 目前,人们对于上皮生长因子受体间接激活的研究集中在转染细胞系的信号 传导途径上,而利用原代培养的细胞尤其是功能学的研究较少。两个功能学研究 的例子分别为.肾上腺素受体激动剂在胃粘液细胞通过上皮生长因子受体间接激 活引起的胃粘液分泌【】和肠血管活性肽 ; 在“细胞通过同样的途径引起氯离子分泌【】。 结论 在星形胶质细胞,.肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素与.肾上腺素受体结 合后,催化蛋白,使细胞内浓度增高,进而激活,通过与酪 氨酸激酶有关的途径直接引起上皮生长因子受体的激活,进一步引起磷酸 化;并且酪氨酸激酶也可能直接激活。 ?本研究创新性的自我? 在本项目的研究内容中,从.肾上腺素受体激动剂引起星形胶质细胞上皮生 长因子受体间接激活到其信号传导途径,在国际国内均无报道。 ?参考文献, , , . : . ;:. , , , . .;:.. , , . . ;:?. .,. .;:?....;:?... .;:?. . . . :?. ; . , , ,. ?. .;:, , , . .;:., , , . .;:. .. . . ;:. . , . . .;:?. :/ . . 蚯;: ?. ./ ..;:. , , , .. .;:. . , , ,.;:?. . . 咖他 , , , . . . : . .;. ?, : . :.. ,.; , , ....;:.. : :. ?. ..; . , , ,. . ;:?., . . .;:?. . : . ;: ... ., .;:. , , , . :百 . .;:.. . , , ,. ;:?. . .;:. .., , , .. : .;:?.., , , .;:. . ., , , 百. . :?. ; ?, , , ..? :.;:?.., ,. . ;:.., , , .? . / . ; :?. . , , , . . ; :. , , , . . ;:? . . .. .;:?. ., , , : . : ? . .; , , , . . .. ;: , , , . ..;: 一 .. , , , ...;:. , , , . . .;:., , , . ,..;:?. //~正/ . .;:?. . , , , .? ..;:?. 抽. / . .;:. , , , . . ..;: . . . . ;: ... .;:?. . ..;:?. / , . .. .;: .. . ., , , .;:?. “” .., ,,? ..;:. . . .: ;:. . :. .;:?.一 ? ..;:. ? . .;:. . , , . 一 ,..;:?. , . ?: . .;:?. .. , , , . . ;: ,, .,‘ , .:?. .; . ??. .;:?. . ,. .;: .. ?综述? 在星形胶质细胞一肾上腺素受体的功能 摘要 在中枢神经系统,星形胶质细胞是数目上占优势的一类胶质细胞,在神经元 的整个发育过程中起重要作用。能够调节神经细胞内、外离子浓度;摄取、灭活 和供给神经递质;营养和修复等作用。在脑内,肾上腺素能和去甲肾上腺素能神 经元位于脑桥和延髓,分别向上和向下投射神经纤维,其支配区域相当广泛,包 括脊髓、边缘叶、大脑皮质和海马。研究表明,在星形胶质细胞、神经元和少突 胶质细胞的细胞表面均有.肾上腺素受体的表达,但是细胞的不同分化状态决定 其表达水平。在前脑、大脑皮层和小脑,一肾上腺素受体主要在星形胶质细胞上 表达。本文主要阐述星形胶质细胞的生物学功能及其与疾病的关系和在星形胶质 细胞,.肾上腺素受体的作用和信号传导机制。随着对.肾上腺素 受体在星形胶 质细胞的分布及其药理学特性、生物学机制等进一步研究,相信一些更有效、特 异性及安全性更高的激动剂或拮抗剂会广泛应用于临床。 关键词 星形胶质细胞; 肾上腺素受体; 信号传导; 中枢神经系统; 一、星形胶质细胞 一星形胶质细胞的功能 星形胶质细胞在中枢神经系统中始终伴随神经元的生长发育,数量 最多,是神经元的.倍。星形胶质细胞从胞体伸出许多长且有分支的线状伪 足,并黏附在微血管周围【。因其是不可兴奋型细胞‘,这就意味着不能产生动 作电位。星形胶质细胞具有支持、营养神经细胞,维持细胞外液离子平衡,调控 神经递质的循环,构成血脑屏障及合成等神经活性物质的功能,并具有一定 的吞噬能力,同时表达多种生物活性物质的受体。 、调节神经细胞内、外离子浓度 星形胶质细胞上拥有丰富的间隙连接及多种离子通道,可调节神经元内外隙 离子浓度、值等,特别是对控制神经元外浓度,维持内环境的稳定性具有 重要作用。星形胶质细胞间隙连接可缓冲神经元细胞外隙的浓度【】。星形胶质 细胞还可通过释放柠檬酸,结合胞外矗、孑,进而调节离子浓度和神经元的 兴奋性。 、摄取、灭活和供给神经递质 在,星形胶质细胞上拥有多种神经活性氨基酸的高亲和载体,在突触间 隙的谷氨酸被星形胶质细胞相应的高亲和载体转运至星形胶质细胞内,在谷氨酰 胺合成酶作用下合成谷氨酰胺,再转运给神经元,作为制造谷氨酸的前体。星形 胶质细胞摄取谷氨酸是保持细胞外谷氨酸浓度稳定的最主要途径,限制了谷氨酸 对神经元的兴奋毒性作用。星形胶质细胞还能摄取和灭活单胺类递质,如去甲肾 上腺素、多巴胺和.羟色胺。 、营养和修复作用 星形胶质细胞能分泌大量可扩散的神经营养因子和非扩散的神经元支持物 质,如促进轴突生长的糖蛋白、神经营养因子膜结合分子、细胞黏附分子层粘连 蛋白,这些物质对神经元起一定的营养作用。实验表明,在某些培养条件下的神 经元,只有在星形胶质细胞存在的情况下,神经元的树突才能发育成熟。缺乏 星形胶质细胞时,神经元只形成轴突,不形成树突。 星形胶质细胞可促进神经元之间突触的建立并使其传导速度增加.倍,并 且能通过突触对神经元的活动进行调控限。星形胶质细胞还能直接调节培养的海 马神经元之间的突触传递,并且星形胶质细胞内钙浓度增加可引起兴奋性或抑制 性突触传递的降低【。目前认为,突触是神经元轴突终末、树突和胞体及星形胶 质细胞的突起共同构成的三重突触结构【】。星形胶质细胞在突触发生、突触传递 的调节和突触可塑性中发挥极为重要的功能【。 星形胶质细胞在脑损伤早期与巨噬细胞一起清除出血及坏死组织。反应性星 形胶质细胞增生的结果往往是形成胶质瘢痕,胶质瘢痕在分隔损伤和正常组织中 起着有益的作用,但也构成了神经元突起向外生长的屏障而干扰 神经元功能的恢