引流淋巴结树突状细胞对自身肿瘤细胞作用研究

引流淋巴结树突状细胞对自身肿瘤细胞作用研究 引流淋巴结树突状细胞对自身肿瘤细胞作 用研究 中国基层医药2004年lO月第ll卷第lO期ChinJPmMedPharm,October2004.v0I.1l,No.10 引流淋巴结树突状细胞对自身肿瘤细胞作用研究 黄俭陈作严 【摘要】目的从胃癌患者引流淋巴结中分离和定向诱导培养扩增树突状细胞(DC),观察其经自身肿 瘤细胞抗原冲击后对自身细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)杀伤活性的影响.取手术切除肿瘤周 围转移引流淋巴结,提取单个核细胞,将贴壁生长的细胞用细胞因子rhGM.CSF,rhIL一4,rhTNF-a联合诱导培 养DC,然后用自身肿瘤细胞抗原冲击DC并作用CIK细胞,最后检测CIK细胞杀伤三种靶细胞(自身胃癌细 胞,K562和S0巴7901细胞)的活性.结果胃癌患者转移引流淋巴结中的贴壁细胞,经细胞因子联合诱导 培养,DC含量可达45%.经自身肿瘤抗原冲击的引流淋巴结DC活化的CIK细胞,杀伤自身肿瘤细胞活性 达79.3%,单纯CIK细胞为33%,两者比较差异有显着意义(P<0.01);而对K562和SGD7901细胞杀伤活 性无明显差异.结论肿瘤周围转移引流淋巴结贴壁细胞在体外能定向诱导扩增出大量DC:DC经自身肿 瘤抗原冲击后能明显提高CIK细胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性.此结果为肿瘤DC的免疫治疗应用奠定了 理论基础. 【关键词】胃癌;树突状细胞;细胞因子;协同刺激分子 ActivityoflymphaticdendriticcellsontumorcellsHUANGJian.cHENGZuo-yan.Departm entofInternal Medicine,L"odingPeople'sHospital,Guangdong,527200,China 【Abstract】 0bjectiveToobservethekillingactivityontargetcellsoftheDCandCIKlashedbyitstumor cellantigenwiththesegregationandsitedirectedinduction,cultureandamplificationofDCsfromthelymphnodesof cancerofstomachpatients,MethodsWeremovedthelymphnodesaroundthetumorbyoperation.extractedthe mononuclearcells,andco-indueedandculturedthewallcellsintoD[=swiththecytokinesrhGM.CSF,rhIL.4,and rhTNF-a.ThenthetumorcellantigenslashedDCsandactedonCIK,Intheend,wemeasuredthekillingactivityof CIKonthesethreekindsoftargetcells(breastcarcinoma,K562andSGG7901).ResultsThecontentofDCraised tO15.3%, 37%withthecombineduseofcytokines.ThekillingactivityontargetcellsofCIKandDClashedby tumorcellantigenswassignificantlyincreased.ConclusionThewallcellsoftransferlymphnodesaroundthetumor caninduceandamplifymultitudeCs,andtheycanincreasethekillingactivityofthetumorcellsoncelashedbythe antigens.ThisresultestablishesatheoreticalbasisfortheimmunetreatmentandapplicationofDC, 【Keywords】 Cancerofstomach;DendriticceU(DC);Cytokine;Synergicstimulatingfactor 树突状细胞(dendriticcell,DC)是目前发现的功 能最强的专职抗原提呈细胞(antigenpresentation cell,APE),由于它在启动细胞免疫中起关键作用, 近年来倍受关注l1J.荷瘤患者肿瘤细胞能产生一 些免疫抑制因子,在体内不利于DC的加工和提呈, 其T细胞也常伴有功能缺陷,不利于肿瘤的清除. 我们从肿瘤转移引流淋巴结中提取贴壁生长的单个 核细胞用相应的细胞因子诱导DC,并用自身肿瘤抗 原冲击后再与CIK细胞(cytokine—inducedkillers, CIK)共孵育,观察其对自身肿瘤细胞的杀伤活性. 1材料与方法 1.1主要试剂rhlL一4(比活性13U/ng),rhTNF.口(比活性 36U/ng),rhIL-2(比活性40U/ng);rhGM.CSF;鼠抗人CD3 单克隆抗体;RPM1640完全培养基包括RPMI1640,10% 胎牛血清,2mmol/L谷氨酰氨,1X10U/L青霉素,1×10 U/L链霉素:淋巴细胞分离液;PE—CD1a单抗及同亚型对照 抗体兔抗鼠IgGlk;FITC.CD14单抗及同亚型对照抗体. 作者单位:527200广东罗定,罗定市人民医院内科(黄俭),检验 科(陈作严) 1.2胃癌患者的引流淋巴结DC和CIK细胞来源取手术 切除肿瘤周围转移引流淋巴结2,4枚(细胞涂片经病理确 诊),先用无菌生理盐水冲洗,再除去结缔组织和脂肪组织, 用剪刀将组织剪成lmm大小的组织碎片,过200目钢网, 用玻璃注射器芯轻轻按压同时反复用生理盐水冲洗,收集细 胞用Ficol1分离,吸取单个核细胞层细胞备用. 1.3自身单个肿瘤细胞的制备收集手术切除的新鲜肿瘤 组织标本,除去结缔组织和脂肪组织,然后将肿瘤组织块浸 于含青霉素1×10U/L,链霉素1×10U/L的RPMI1640 中2h.用无菌生理盐水反复冲洗肿瘤组织数次,将瘤体剪 成1mm大小,置于含0.05%胶原酶,0.02%DNA酶, 0.01%透明质酸酶,10%小牛血清的RPMI.1640培养基中. 4?磁力搅拌过夜消化,再经200目钢网过滤,收集细胞,用 Hank's液洗2遍,将细胞配成2×10/L的细胞悬液.用Fi— coil分离,吸取单个核细胞层细胞,再用Hank'S液洗2遍,用 细胞冻存液将细胞配成5×10/L,置冻存管,梯度降温,最 后液氮冻存. 1.4D(=:的体外培养取上述引流淋巴结中提取的单个核 细胞.用RPMI1640完全培养基将细胞配成2×10/L.加入 6孔板细胞培养板,每孔3ml,置37?,5%Co2培养箱孵育 2h,收集非贴壁悬浮的单个核细胞用于CIK细胞培养;粘附 于培养板上贴壁的单个核细胞,用预热的培养基轻洗2次. 每孔加人完全培养基(含rhGM.CSF200g/L,rhlL.45Og/ L)3ml.培养3d后再加入rhTNF.alOt~g/L.每3天半量 换培养基一次,同时调整细胞数至1×10S/L.于9,12d收 集悬浮细胞进行FCM检测. 1?5CIK细胞诱导方法用pH7. 4PBS将抗CD3单克隆 抗体配成1mg/L,包被24孔细胞培养板,4?过夜,pH7.4 PBS洗3次备用.将分离DC时悬浮的单个核细胞 ,用RP. MI?1640完全液(含rlL-25×10.U/L,INF一72×106U/L) 配成510./L的细胞悬液,加入上述CD3包被的培养板 ,每 孔2ml.置37?,5%CO~培养.每2天半量换培养基(含 rhlL-2510./L和1mg/LCD3mAb)1次,并调整细胞数至 5×108/L. 1?6细胞表型的流式细胞仪用于细胞表面标记的单 克隆抗体为PE结合的鼠抗人CD1a和CD80单抗 ,FITC结 合的CD14和CD86单抗.抗体1:10稀释,与细胞4?孵育 2O,25rain,PBS洗涤2次,重新悬浮,流式细胞仪(美国产) 检测,每个样本分析细胞数?5×1O.. 1?7自身胃癌细胞抗原制备(Ag)将107个胃癌细胞用生 理盐水洗涤2遍,加入100tal生理盐水,放人液氮中,1Omin 后迅速放人37?水浴中,待其完全融化后,再次放人液氮 中,反复3次,将冻融的胃癌细胞稀释到1 mI,通过微孔滤膜 过滤,除去细胞碎片,收集滤液于4?保存备用 . 1?8CIK细胞杀伤活性检测按刘军权等建立的方法[2】进 行.将靶细胞用RPMI1640完全培养液培养至对数增殖 期,收集细胞用Hank's液洗2次,配成2×10/L;效应细胞 配成210/L.将效靶细胞数按10:1比例混合 ,500r/m;n 离心5m;n,置37?,5%C环境孵育6h,轻轻混匀细胞.1 5OO/mi"离心10min,收集上清液,用Encore全自动生化分 析仪LD-P法,测定LDH的活性单位(U/L).实验结果以i ?s表示.用f检验比较各组闻均数差异有显着意义. clK绷息的杀伤活性磊番羞喜兽名×too%. 2绪果 2?1DC的增殖和形态观察剐分离的引流淋巴结单个核 细胞呈球形散在分布,表面光滑:贴壁2h后 ,贴壁细胞为单 个核细胞,加入rhGM—CSF,rhlL.4培养24h贴壁细胞的单 个核细胞在光镜下为均匀散布的细胞聚集体 ;培养2d时细 胞数减少,部分细胞死亡;培养3d后培养孔中可见部分悬 浮细胞,6,7d大部分细胞胞体较大 ,悬浮不贴壁,聚集成 簇,形态不,相差显微镜可见伸展的大量毛刺 ,可见典型 的DC形态. 2.2免疫表型分析结果培养第12dCD1 a/CD14和 CD8O/CD86阳性细胞分别占40. 9%和45.3%,刚分离的单 个核细胞这两组细胞分别为3. 2%和1.O%.培养前后两者 差异有显着意义(P<O. 01). 2.3胃癌抗原负载的引流淋巴结DC与CIK细胞共培养 后,其CIK细胞对自身肿瘤细胞, K562和SGC.7901的杀伤 活性经自身肿瘤抗原冲击的引流淋巴结DC活化的cIK细 胞,杀伤自身肿瘤细胞活性达7996,而单纯CIK细胞为 33%,两者比较差异有着意义(P<O. 01).对K562和SGc 盏盟j』一丛鲤b婴!QQ..】.1l,No.1o 7901杀伤活性无明显影响.结果见图1. —_._一a鲁?曩?? — ?一 loo 8o iB0蛭们 20 O CIKCIl(+~gCII(?I)CCII(?DC .^g 图15J滚淋巴结诱导培养的Dc和cIK细胞对3种靶细胞的杀伤作用 3讨论 在体内,DC通过细胞内吞作用摄取抗原,并酸 化胞浆中降解的抗原肽再与MHClI类分子结合 , 共I司表达在DC表面,同时也可由MHCI类途径提 呈外源性摄入的抗原或内源性表达的抗原[3I .DC 摄取抗原后迅速游走到引流淋巴结.引流淋巴结 (LN)是淋巴细胞定居和增殖的场所,免疫应答发生 的基地.由于肿瘤本身可产生IL.10和VEGF等负 性调控因子,肿瘤患者体内的微环境不利于DC对 抗原加工,提呈.因此DC在引流淋巴结体内不能 捕捉肿瘤抗原;而肿瘤患者常伴有T细胞功能的 缺陷,晚期肿瘤患者体内的肿瘤细胞本身也是非专 职APC,不能表达丰富的辅助刺激分子 ,因而导致T 细胞免疫耐受[. 人外周血淋巴细胞经抗CD3单克隆抗体 ,IL一2, IL一1,INF一7共同诱导培养能扩增出CIK细胞 ,为 CD3CD56T细胞:它兼具有T淋巴细胞抗瘤活 性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点 ,并证实 它的细胞杀伤活性和增殖活性均较LAK细胞强 , 与NK细胞相似.但是CIK细胞表面不表达F c受 体,不能产生抗体依赖性的细胞毒作用.为提高免 疫效应细胞的杀伤活性,用肿瘤抗原体外冲击致敏 DC,可使肿瘤抗原被高效摄取,DC通过高表达 MHC分子高效提呈了丰富的肿瘤抗原肽 ,使相应T 细胞的TCR充分结合抗原表位,同时DC高水平的 1,B7—2,CD40等共刺激分子,使T细胞充分激 B7— 活,DC同时也分泌IL一2,介导TH一1型应答,有利于 清除肿瘤细胞,.近来发现,DC可分泌趋化因子 DC—CCK,专一性趋化初始型T细胞,DC通过DC. CCK促使T细胞聚集,增强对T细胞激活 ,这些因 素保证了DC回输体内后可诱导体内产生高效的抗 肿瘤效应. 我们研究表明,胃癌抗原负载的DC能进一 步 提高CIK细胞的杀伤活性.其机制可能是通过 CD3单抗激活CIK细胞产生第一信号 ,DC表面 CD8O,CD4O等共刺激分子提供第二信号,共同促发 中国基层医药2004年lO月第ll卷第lO期 ChinJPrimMedPharm.Oetober2oo4.v01.1l,No.10 面部外用皮质类固醇激素致皮炎282例临床分析 陈焕英米宁 【摘要】目的探讨皮质类固醇激素所致的皮炎发病因素,临床表现及治疗.方法收 集我院门诊 2000年2月至2003年2月资科完整282例病例进行临床分析.结果282例患者, 分别外用皮康王霜,皮炎 平霜,肤轻松霜等.或外用2种以上皮质类固醇制剂,人均用药时间为2,13个月, 人均用药量30,162g. 其临床表现为红斑,干燥,脱屑282例(100%),毛细血管扩张159例(56.38%),毛囊性 炎性丘疹145例 (51.42%),皮肤萎缩126例(44.68%),色素沉着98例(34.75%),毛孔粗大65例 (23.05%),多毛57例 (20.21%).结论面部外用皮质类固醇激素所致的皮炎发病原因与适应证掌握不准 确,药物品种选择不当, 用药部位选择不当,用药时间过长有关;其临床表现以红斑,干燥,脱屑为基本损害 的多形性皮损;治疗方法为 首先停用激素,采取综合治疗,可取得较好疗效. 【关键词】皮炎;皮质类固醇激素;外用 Dermatitiscausedbyfacialaplicationofsteroids:astudyof282casCHENHuan-ying.MlNing.Department ofDermatology,FirstPeople'sHospitalofZhaoqing,Guangdong,526021,China 【Abstract】 0bjectiveToexplorepathogenosis,pathogenicfactorsandclinicalcharacteristicsofdermatitisfor externalcorticosteroidsuseonfacosandfinetreatmentmethods.MethodsFrom2000to2003.282caseswerecol— lectedfromourhospital'soutpatientandanalyzed.ResultsThe282patientsusedketoconazoleandclobetaaolpro— bionategream,compounddexamethasoneacetategream,fluoeinonidedintmentandsoon.Someusedmorethantwo steroids.Theyusedthesemedicationsfor2,13monthsat30, 162gonoverage.Clinicalcharacteristicsincludedred spot,dry,peelin282cases(100%),telangiectasisin159cases(56.38%),folliculitis-papulein145casos(51.42%), atrophyofskinin126casos(44.68%),pigmentcomposedin98cases(34.75%),bulkyporein65cases(23.05%), thickhairsin57cases(20.21%).ConclusionDermatilisinducedbyexternalusedofcorticoste roidsonfacesisat— tributabletomismatchbetweensysptomsandmedicine,inappropriatedose,administ而 tionanddurationetc. 【Keywords】Dermatilis;Corticosteroids;Externalusing 近年来由于面部外用皮质类固醇制剂和含皮质 类固醇的化妆品的广泛使用,使面部外用皮质类固 醇激素所致皮炎的病例猛增….为探讨其发病原 因,发病相关因素,临床表现以及寻找其治疗方案, 现将我院门诊2000年2月至2003年2月资料完整 的282例病例进行了临床分析,现如下. 1临床资料 1.1一般资料282例中男62例(21.99%),女220例 (78.01%);年龄5,76岁,平均33.2岁;病程35d至5年, 作者单位:526021广东肇庆.肇庆市第一人民医院皮肤科 平均10个月.文化程度:初中及以下者186例(65.96%). 高中(含同等学历)者62例(21.99%),大专以上者34例 (12.05%).外用激素前就诊情况:?不曾就诊自行搽药者 156例(55.32%);?曾就诊于卫生室,个体诊所,乡镇卫生 院者103例(36.52%);?就诊于县级以上医院者23例 (8.16%). 1.2原发病或使用原因寻常痤疮133例(47.17%),脂溢 性皮炎65例(23.05%),酒渣鼻44例(15.60%),湿疹29例 (10.28%),接触性皮炎6例(2.13%),黄褐斑5例 (1.77%). 1.3外用皮质类固醇制剂情况见表1. 以上结果表明,引流淋巴结DC能提高效应细 胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性,自身肿瘤抗原负载 DC能进一步增强CIK细胞杀伤自身肿瘤细胞.这 一 结果为自身肿瘤抗原负载DC诱导的CIK细胞的 临床免疫治疗提供了一定的理论依据. 参考文献 lHartDN.Dendriticcells:Uniqueleukocytepopulationswhichcontrol theprimaryimmunercsponse.Blood,1997.90(9):3245.3287. 2刘军权,韩慧敏,陈复兴.用乳酸脱氢酶试剂盒检测LAK细胞活 性.临床医学检验.1995,l3(2):83. 3曹雪涛.树突状细胞的基础与临床研究新进展.中国免疫学杂志, l998,14(3):l61.165. 4SchulerG.SteinmanRM.DendriticCellasadjuvantsforimmune-me— diatedresistancetotumors.JExpMed,1997,186(8):l183.1187. 5王玮,孙秉中.树突状细胞与恶性血液病的免疫治疗.细胞与免疫 学杂志,2000,16(2):553.555. 6ThomaS,LuliaEW,AlanRS,eta1.Expre~ioncellinfiltrationin coloncancer.Immunotherapy,2001.24(2):138?143. 7MartenA,SchotterB,ZiskeC,eta1.Increaseoftheimmunostimula— toryeffectofdendriticcellsbypulsingwithCA19—9protein.1m? munotherapy,2000,23(4):464?469. (收稿日期:2004—09—03)