氧化三甲胺酶研究进展

氧化三甲胺酶研究进展 氧化三甲胺酶研究进展 3502007,Vo1.28,No.O1茛晶科学※专题论述 氧化三甲胺酶研究进展 宋丹阳1,周德庆:一,杜永芳2,柳淑芳2 (1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083; 2.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071) 摘要:氧化三甲胺酶(trimethylamine-N-oxidedemethylase,TMAOase)~洋鱼类体内存在的产生甲醛的重要 本文对TMAOase的的酶,与水产品甲醛的本底含量和鱼肉的腐败变质密切相关. 分布,活性测定,分离纯化以 及酶学特性等方面研究进行了较为全面的综述. 关键词:氧化三甲胺酶;氧化三甲胺;甲醛;研究进展 ResearchProgressonTrimthylamineN-oxideDemethylase SONGDan-yang.,ZHOUDe-qing,DUYong—fang,LIUShu-fang (1.CofiegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgficultralUnive~ity.Beiji ng100083,China; 2.YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao2 66071,China) Abstract:TMAOdemethylase(TMAOaseortrimethylamine-N-oxideformaldehyde-lyas e)hasbeenproposedtobe 收稿日期:2005.09.26通讯作者 基金项目:国家自然科学基金项目(30471350);国家科技基础平台项目(2004DEA70880) 作者简介:宋丹阳(1968.),男,农艺师,博士研究生,研究方向为食品安全. 产物,选取用相应的底物和指示剂或其它化学法,通 过颜色反应来间接测定菌数,将是未来耐热芽孢杆菌的 快速检测的发展方向. 参考文献: 【1】JAMESTM,ARTHURG.LORNAML.Factorsinfluencingthe recoveryofpsychrotrophic.mesophilicandthermophilicBacillusspp frombulklawmilk[J].JournaloftheSocietyofDairyTechnology. 1994.47(4):l11-l16. 【2】COOKGM.SANDEMANRM.Sourcesanddmm豇iasa士I蚰ofSlXaV.- formingbacteriainrawmilk[j].AustralianJournalofDah'yTechnology. 2O0o.55(3):119-126. 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Keys:TMAOase~TMAO;formaldehyde;advances 中图分类号:Q814文献标识码:A文章编号:1002-6630(2007)01.0350-04 氧化三甲胺(trimethylamine.N.oxide,TMAO)是许 多海洋鱼类肌肉中非蛋白氮的主要组成部分,在冷冻和 冰冻贮存过程中,鱼肉中TMA0在氧化三甲胺酶 (trimethylamine.N.oxidedemethylase,TMAOase)的作 用下分解为二甲胺(dimethylamine,DMA)和甲醛 (formaldehyde,FA)[t_31.FA是一种重要的食品安全危 害因子,食用后可以直接对人体产生毒害作用.同时 FA对许多鱼类产品腐败变质还有重要作用,FA与肌肉 中的蛋白质发生反应导致鱼肉质构变差,疏水性增加, 导致鱼肉质量变差甚至变质[41.TMAOase在国外已经引起 了科学家的广泛关注,开展了一些研究工作,并且把甲 醛的含量和TMAOase的活性作为衡量鱼类产品腐败变质 的指标[51.TMAOase活性主要是通过测定其底物TMAO 的代谢产物DMA和FA来衡量,这在许多鱼类组织中尤 其是在鳕鱼类组织器官中得到检测和证实,但是反应的机 理和TMAOase生理作用还不清楚【6】.在国内该酶的研究 尚未见报道,只见到FA产生机理的综述文章【,1,本文就 近年来TMAOase的研究进展进行全面的综述. 1TMAOaso的种类和来源 nA0ase是可以将TMAO分解为DMA和FA的一 类酶系统,包括trimethylamineoxidealdolase,trimethy— lamine—N—oxideformaldehydelyase,trimethylamine—N—OX— idedemethylase[s_10l.1963年,Amona等【川在研究鱼类 中甲醛时就提出甲醛的产生和代谢可能与某一种酶相 关.l965年,Yamada和Amano[12l发现在Alaska绿鳕 (Theragrachalcogramma)幽门盲肠中存在一种因子可以 分解TMAO,氧气对其活性有很大的抑制作用,pH5. 0时表现出最大活性,此因子具有酶的特性,且与氧化 三甲胺分解有关,所以被称作氧化三甲胺酶.到目前 为止,人们,直认为TMSOase是一种多酶体系,但其 种类和详细组成仍不清楚.l975年,Harada[?1从长舌 鲷(Sauridatumbil)肝脏中部分纯化了TMAOase,研究 发现在pH5.0时表现出最大活性.1982年,Gill等【?1用 不同的等电点(主要是酸性PH范围)从鳕鱼(GaduS morhua)肾脏中分离出四种TMAOase的同工酶,最适 pH为5.0,亚甲基蓝可激活酶使其达到最大活性,但酶 的活性不受氧气浓度影响.1982年Lundstrom[1证实了 红鳕肌肉中存在TMA0ase活性,且该酶活性中心的离 径范围大于0.11.tm.1983年Reece[16i报道了在鳕鱼肌肉 中存在两种有TMAOase活性的酶,其中一种酶受氧 气和氰化钾抑制,而另一种酶不受这两种因子影响. Gill[14l认为TMAOase主要集中在溶酶体膜上,而Parkin 等【l7】从红鳕(Urophycischuss)肌肉微粒体中分离出一种有 TMAOase活性的组分,SDS.PAGE电泳显示该酶由数种 蛋白组成.1992年Joly[ts】等通过阴离子交换层析,从绿 鳕(Pollachiusvirens)肾脏中分离出三种高分子量(200 2000kDa)的独立的酶,它们的等电点不同,分别是4.1, 4.5,5.0. 2TMAOase的分布 TMAOase广泛分布于海产动物组织中,在鱼类中 白肉鱼中的含量比红肉鱼多,而在淡水动物中则没有 TMAOase,即使存在含量也极微.在一些深海鱼类 中,特别是在鳕鱼类中的含量较高,如狗鳕,鳕,黑 线鳕,蓝牙鳕,牙鳕,绿鳕,红鳕等,这些鱼都是 商业价值很高的鱼类.冷冻或者冰冻鳕鱼片是保持鳕鱼 类质量的一种常规贮存方法,但是鳕鱼类体内 TMAOase活性很高,即使在冷冻或冰冻状态TMA0ase 仍然存在活性[191.此外,在贝类【13l,褐虾[201以及长舌 鲷[13l中也发现了TMAOase活性. TMAOase在同一种鱼类各个组织器官中的分布也 不同.GiU等【?l报道TMAOase主要集中在内脏器官和红 肉中;Rehbein等【】报道TMAOase大部分存在于肾脏和 脾中,但是在肌肉中少有发现;Harada[iI从长舌鲷肝脏 中部分纯化了TMAOase;Tomioka等[21l发现Alaska绿 鳕幽门盲肠存在较高的TMAOase活性;红鳕【"?19l和 Alaska绿鳕[221肌肉中存在TMAOase活性.由此可见, TMAOase存在于许多鱼类组织中,尤其是内脏器官如 肾脏,脾,肝脏和幽门盲肠中. 3TMAOase的分离纯化方法 TMAOase的分离纯化是研究酶学性质的前提和基 础,据现有文献报道,不同的学者采用的方法不尽相 同.较为常用的方法有四种:硫酸胺沉淀法[】2J,等电 点分离法[141,离子交换层析法【.I和DEAE纤维素和凝胶 过滤法[221.一般用到的组织材料为幽门盲肠,肝脏, 胆囊,肾脏,肌肉微粒体和血液等.但这些方法得到 的酶的纯度仍然不令人满意.最近又出现了一种利用基 因工程的方法合成TMA0ase[9l,这种方法获得的酶纯度 3522007,VoL28,No.01目品科学※专题论述 高,特异性强,有利于进一步研究酶的性质. 4TMAOase酶学特性的研究 鳕鱼类在冷冻贮存过程中,由于TMAOase的作用 产生了FA,导致了这些鱼类质量严重下降,基于这个 原因,促使许多学者以鳕鱼类为实验材料对TMAOase 进行分离纯化并对其酶学性质进行研究. 4.1酶活测定 综合多位学者的测定方法,TMAOase活性可以 通过测定组织中产生的DMA或FA来衡量,即在有辅 助因子存在的情况下,以TMAO为底物,测定 TMAOase活性,TMAOase一个活性单位(U)可用每 分钟产生的1t.tmolDMA或FA来表示[8,21-22】. 酶的活性在不同品种和同一品种的不同个体之间有 很大差异.Nielsen等【m】对24种鳕鱼类鱼肉样品进行分 析,发现只有9种存在TMAOase活性.冻存试验表明 鳕鱼肌肉中的TMAOase活性与冻存温度和时间有关. TMAOase活性还与不溶性蛋白和高离子浓度的可溶性蛋 白的比例有关【1o】. 4.2TMAOase的辅助因子 Yamada[12】等研究发现亚甲基蓝可增强TMAOase活 性,同时证明了氧气对TMAOase有很大的抑制作用. 1980年,Tokunaga[23]报道TMAOase催化TMAO产生 FA的过程可被肌红蛋白和血红蛋白激活.Benjakul等【s】 发现促进TMAOase活性需要FeCh,抗坏血酸盐和半胱 氨酸等辅助因子.Parkin等[17】认为有两种辅助因子系统 能激活TMAOase的活性:一种是厌氧条件下的NADH 和FMN系统;另一种系统是由铁和半胱氨酸和,或抗坏 血酸盐组成的,在有氧或缺氧时启动.每一种辅助因 子系统内的成分互相作用,且已建立了各自的动力学参 数.作为鱼肉中普遍存在的胺组分之一,TMAO是唯 一 可被TMAOase脱甲基的底物.在TMAO脱甲基的过 程中这两种辅助因子系统共用一个催化单元.Lunds~om 【"】也报道了抗坏血酸盐,亚甲基蓝和少量的Fe2+,半胱 氨酸对红鳕肌肉中的TMAOase活性有促进作用. 4.3TMA0ase的分子量和动力学研究 2000年,Kimura[船等研究发现Alaska绿鳕(Theragra chalcogramma)肌肉粗酶液中TMA0ase的酶活最适pH 为7.0,7.5,在30?以上则检测不到活性,经测定得知 该酶的分子量约为400kDa,底物TMAO的I~=30mmol/ L,活化能为38.4kJ/tool. 1999年,Havemeister[5~研究了牙鳕(Merlangius merlanguS)中TMAOase的活性,他分离出两种 TMAOase组分,其中高分子量(2000kDa)组分是一种膜 蛋白,低分子量(150~600kDa)组分是可溶性的.25? pH4.5,5.0时TMAOase活性最大,40?加热20min两 种组分仍然保持稳定,底物AO的IG,=5.7,11.5mmol/L, 活化能范围是5.2,6.0kJ/mol. 2003年Benjakul[8]等从长舌鲷(Saur/damicropectoralis) 肾脏中部分纯化出TMAOage,其最适pH为7.0,最适 温度为50?,对TMAO的K值为16.2mmol/L,活化能 为30.54kJ/mol,根据SDS—PAGE估测酶的分子量为 128kDa. 2004年MarRey-Mansillat~l等通过离子交换层析从欧 洲狗鳕(Merlucciusmerluccius)肾脏中分离出2种TMAOase 活性蛋白质组分:第一种组分用浓度为0.45mol/L,NaC1 洗脱,其电荷,质量与牛血清蛋白相似,分子量在30, 100kDa之间;第二种组分用浓度为0.7mol/L,NaC1洗 脱,它的电荷,质量很低,可能是由100~2000kDa之 间的高分子量蛋白质聚集形成的.TMAOase形成多聚 体从而构成疏水环境,导致它本身的高疏水性,这与 其低溶解性一致.两种组分中的蛋白质的等电点为pH 为4.55,5.85. 4.4TMAOase的活性部位 2003年,Takeuchi等[91对TMAOase的活性部位进 行研究时,从绿鳕(walleyepollack)中克隆出一组富含天 门冬氨酸的蛋白质.其中一种eDNA被指定为aspolinl, 编码一种富含天门冬氨酸的228个氨基酸的蛋白质,在 Ala42和Asp43之间剪切后为成熟的TMAOase.成熟的 aspolinl/TMAOase蛋白为186个氨基酸,其中含有179 个Asp.另一个eDNA被指定为aspolin2,在5'端与 aspolinl共用一段核苷酸序列,编码的蛋白含有一个附 加的ASP聚合体和一个富含半胱氨酸的C一末端. aspolin2的氨基酸序列与哺乳动物的富含组氨酸的Ca2+结 合蛋白高度同源.Aspolin1/TMAOase和aspolin2的 mRNA在骨骼肌中最丰富,在肾,心,脾和脑中可检 测到较低水平的mRNA.人工合成Asp聚合体表明,有 Fe+存在时TMAOase的活性显着增强,但是单体和寡 聚体却没有活性.纯化的TMAOase蛋白与Fe2+结合能 力较低,这可能是造成催化活性较低的原因.当鱼死 后在贮存过程中,天门冬氨酸和Fe2+形成复合体,参 与TMAO去甲基化生成甲醛. 4.5去污剂对TMAOase活性的影响 Parkin等[17】研究了从鱼肉微粒体纯化TMAOase的过 程中去污剂对其活性的影响.当每mg蛋白质中去污剂 的浓度低于10mg时,TritonsX.100和X.45, deoxycholate,Brijs,Tweens20,65和80,以及SDS 等去污剂对从膜上分离到的可溶性TMAO成分几乎没有 影响,但对颗粒部分的活性影响很大.如在5mmol/L组 氨酸,pH7.010,14?的环境下,每mg蛋白中添加10mg SDS,可以将酶高度浓缩.在此SDS含量下,酶的活 性也相对稳定.用SDS处理后,如果再同时用抗坏血 ※专题论述品科学2007,Vo1.28,No.01353 酸和FMN—NADH分别处理,TMAO的活性可以分别提 高28到58倍.如果在纯化时添加尿素或2一巯基乙醇, 或用超声波处理SDS一微粒体悬浮液,则上述活性就会 显着下降.这些TMAOase纯化物只有原来微粒体蛋白 质中的1%.纯化物的活性与铁离子呈曲线关系,与半 胱氨酸呈S形关系.与微粒体相比,TMAOase纯化物 利用NADH,FMN和抗坏血酸的能力各不相同. 5展望 对于TMAOase国外已经以鳕科鱼类为试材进行了 大量的研究,发现不同鱼类,不同方法提取的 TMAOase物理化学性质存在很大差异,而国内对该酶 研究的还未见报道.我国是世界上最大的水产大国,水 产品在我国国民经济中占有很重要的地位,水产品蛋白 质很丰富,蛋白质变性是水产品贮存常常遇到的一个问 题,而TMAOase分解TMAO形成DMA和FA,不仅 易引起鱼类组织变差,而产生的FA对水产品的质量安 全是一个不容忽视的问题.为了防止TMAOase活性和 产生甲醛对水产品品质造成影响,我们需要了解不同种 类的鱼和同一种类鱼的不同组织器官中TMAOase分布 及活性的基本信息.因此,必须进一步对TMAOase的 作用机理和性质进行研究,从而提出抑制甲醛产生技术 和办法,保证水产品的质量安全. 参考文献: 【1】 【4】 [5】 【6】 CASTELLCH.sMITHB,NEALW.Productionofd~methyhminein muscleofseveralspeciesofgadoidfishduringfrozenstorage,especially inrelationtopresenceofdarkmuscle叨.JFishRes,1971,28:1-5. 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