【doc】晶状体上皮细胞的容量调节性氯通道

【doc】晶状体上皮细胞的容量调节性氯通道 晶状体上皮细胞的容量调节性氯通道 一 _ 土 ? 32? 晶状体上皮细胞的容量调节性氯通道 /} nOvhfe~R鹧,嘶r[999,VdL1.No5 盂虎军郭守一张作明, 一…,一 Thevolume-regulatedchloridechannelsinlensepithelialcells MengQin目.G?Shou)4,ZhangZuoming.mofClinicalA~ioZionMedicine, FourthMitltaoMedicalUniversity.Xi'.n710032 ? 实验研究? A~lraetObje~:dveToinvestigatethemechanismoflensedemaintermsofionicchart.elleveI andtopmvide dec? p}L0I.calbasisforthesdyoftheefiolo~'ofcataractMethodsCulturedrabbitlensepithelial~A ls(LF~s)wel'e subjectedtowhole-cellpatch— clampingtomessIlr~themembranerestingpotentialandtoobservetheactivityofionicclmr melsRtsulls 1kmenthra~eresti.gpotentialLECs一17.4omV?4.67mV(n:15)WnL,^二 s,orel~exposedtO笛%hyl~tovic solution.awhofo-cellctment?activatedItwaseearl}'voltage.dependentThereversalpotentialofthisectrrent一553mVt】1 svrarcetricalCI—Thespecificblooker0f~'olume~ulatedchio6dechanne1.Tamoxifen(1oo,un~l/L).couldap l::~entlyblockaefi-~时 0fthischatme1.,iIeQulnfo~invasiousconeentratiom?leBiveCmnelus~onTheLECs吕essvolume-regulatedchloride channels.Thedisorderofitsfunctionhavecloserelationshipwithsortiet,.Tesofoparitiesofle ns Keywordspatoh-clattrptechniquelemepithelialcellscNofidechannels 摘要目的从离子通道水平上探讨晶状体水肿的机制,为白内障的病因学研究提供电生理学基础方法培养 兔晶状体上皮细胞(LE).采用全细胞膜片钳技术观察l~Cs静息膜电位和膜上离子通道的活动.结果培养的LEGS 静息膜电位为一l7dOmV?4.67mV(=15);LEGs膜上存在对低渗敏感的通道,在给予25%低渗渡灌流后激活.通道开 放具有明显的电压依赖性.反转电位为一5.53巾v.此电流可被氯通道特异性阻断剂Tan3oxi~n(100~mol/L)明显抑制 结论kEGs膜上存在窖量调节性氧通道.该通道的启闭异常可能与某些类型晶状体混浊的形成有密切关系 关键词膜片钳技术晶状体上皮细胞睾【通道./,二. 分类号R'D6' 晶状体上皮细胞(1ensepithelialcells,LECs)是晶状 体内惟一具有分裂能力的细胞,在维持晶状体水,电解 质平衡,营养物质转运,气体交换等方面具有重要作 用.因此,LECs可作为白内障形成的重要研究对象. LECs膜上离子通道有关功能的异常将会直接影响晶 状体的内外离子平衡,进而导致晶状体水肿,混浊,形 成白内障.在我国,关于晶状体上皮细胞离子通道特 性的研究尚未见报道为此.本文采用膜片钳技术,对 体外培养的LECs膜的电生理特性进行了初步研究 1与方法 1.1主要材料 仪器:CO2孵箱(NU一2500E,NUAIRE),超净工作台 (sw-CJ—IF,苏州安泰空气技术有限公司),膜片钳放大 器(CEZ一2300,NlftONKONDEN),刺激器(SEN一7103, 作者单位:710032西安,第四军医大学空医系航临教研室 NIHONKONDEN),步脉冲发生器(S-8300,NIHON KONDEN).记忆示波器(CS一8010,ICENWOOD),磁带记 录仪(MR一10C,TEAC),微操纵器(NO一103,Narishige), 微电报拉制仪(PP-83,Narishlge),微电极玻璃毛细管 (GG17.中国科学院上海脑研究所),X-Y生理绘图仪 (LY1900PLIANSEIS),倒置生物显微镜(87145,重庆光 学仪器厂). 试剂:M199培养基(Gibeo),新生小牛血清(杭州 四季青生物工程材料研究所),胰蛋白酶(Sigma), EGTA,Na.ATP,HEPES,CsC1(华美公司),Tamoxifen (RBI). 1.2兔晶状体上皮细胞培养及鉴定 选用健康家兔(由第四军医大学实验动物中心提 供),雌雄不限,体重1.5,2.5k耳缘静脉空气栓塞 致死,完整取出眼球.在超净台内用Hanks液冲洗眼 球,70%酒精浸泡1min.沿角巩膜缘剪开眼球,去除 眼科研究1999年】0月第l7卷第5期 角膜和虹膜,用有齿镊撕下晶状体前囊膜.按组毁块法 进行培养培养基用M199(其中加人了20%新生牛 血清),于5.0%c0,.37.C孵箱内培养,3,5天换液1 次待细胞长至亚融台状态时,传代干预置有小盖玻 片的培养皿中培养.培养的晶状体上皮细胞根据来 源,生长特点,形态学特征进行鉴定. 1.3溶液组成(参照文献2]) (1)电极内液(n~nol/L):CsC1105,ML1.2,D一甘 露醇70,HEPES10,EGTAl,Na2ATP2,用Tris碱(1.0 ~ranol/L)将DH值调至7.2.(2)等渗溶液(mmol/L): NaCI105.C~CI:2.Mb0.5.HEPESl0,D一甘露醇70.用 Tds碱(1.0?l/L)将pH值谰至7.4【3)25%低渗溶 液(m10l/L):NaCl105,CaCI:2,MgC0.5,HEPES10,用 Tris碱(10retool/L)将pH值调至7.4..(4)ram~xifen (100g~I/L)系用25%低渗液配制.口H7.4. 1.4电生理实验方法 用两步垂直电极拉制器将玻璃毛细管拉制成微电 极,电极电阻为2,8Mn.倒置显微镜下选定日标细 胞,调节微操纵器使微电极尖端贴至细胞膜L.微加 负压,待电极与细胞间达到巨阻抗(en级)封接后,再 突然增加负压,以吸破电极尖端的胞膜.形成全细胞钳 制状态在电流钳制状态下立即细胞膜破裂时 的膜电位.并将其作为细胞的静息膜电位.然后在 电压钳制下对细胞施以不同的电压刺激产生的电流 经膜片钳放大器放大后,用磁带记录仪记录于磁带上, 实验结束后,将磁带上记录的信号回放到记忆示渡器 上测量,并用x_Y生理绘图仪将电流变化图形绘出. 实验在室温下(22.C?l.C)进行.图中凡电流方向向 下者,为内向电流. 1.5实验步骤 (1)建立全细胞记录,在电流钳制状态下,记录胞 膜破裂瞬间的膜电位.(2)等渗溶液持续灌流细胞(流 速4ml/min),同时给予多步电压脉冲刺激,观察通道 电流变化(3)给予25%低渗液持续灌流(4ml/min), 同上方法进行观察.(4)低渗液激活电流后,给予 Tamoxifen(100tanol/L,pH74)灌流5min,4ml/min,观 测通道阻滞情况. 1.6数据采集与统计方法 实验中电流值均为+40-nY刺激脉冲结束处测得 (钳制电位0mv),数据以同一细胞获得的为准,结果 用x?s表示.统计学采用t检验. 2结果 2.1培养品状体上皮细胞的形态及生长特点 由于取材时操作严格,避免了角膜,虹膜组织的污 染,而晶状体内只有前囊下附着的+层上皮细胞有 分裂增殖能力,故排除了其它细胞生长的可能.原代 培养取材接种后24h.倒置显微镜下可观察到细胞从 植片的周边爬出.7,8天形成贴壁的单层细胞.植 片附近的细胞呈多边形.排列紧密.呈铺路石形态向外 生长,周边细胞形态不甚规则细胞传至四五代后,变 为长梭形,胞浆内出现较多不透明的颗粒(晶状体小 体),且分裂繁殖能力下降.符台晶状体上皮细胞向纤 维细胞转化的规律 2.2钳制电位0mV(氯离子平衡电位),刺激电压从 一 80niV递增至+80m'V,步阶为10mv,电压时程5O 一.在大多数被全细胞钳制的晶状体上皮细胞上成 功记录到低渗敏感的电流活动.在本实验条件下测得 培养的LEC静息膜电位为一l7.40mV?4.67mY(n= l5) 2.3当给予等渗溶液灌流时,多种去极化和超极化电 压作用下.几乎均记录不到明显的通道电流变化.但 给予25%低渗液灌流约3—5rain后,可记录到较明显 的电流恬动.且随时间延长电流逐渐增大,约l0min后 达最大值,平均从低渗液灌流前的28.8pA?7.5增 至154.2pA?36.5pA(P(0.01,n=15).通道激活后 给予氯通道电流阻断剂Tamoxifen(100tmaol/L,pn7.4) 灌流.通道活性被明显抑制(P(0.Ol,n=5)(图1). Tmnoxifen对电流的阻滞百分比l(阻滞前电流一阻滞 后电流)/阻滞前电流x100%],去极化方向为5114% ?9.43%,超极化方向为49.23%?884%.二者问无 明显差异(P>0.05). 2.4该通道电流呈明显的电压依赖性.当膜电位为 0-nv时,未见明显的通遭活动;当分别给予去极化和 超极化刺激电压时,可记录到相应的外向,内向电流, 且电流幅值随电压增加而增大.将其不同电压及相应 的电流变化做成电流一电压关系曲线,可见曲线呈明 显的线性关系,反转电位约为一5.53mV(图2,3). 3讨论 晶状体水肿往往是白内障发生的前奏.在多种病 理情况下如糖尿病,尿毒症等,血中高水平的葡萄糖, 尿素等分子可进人晶状体实质细胞.这些细胞在渗透 压刺激下可发生水肿. Nilius等首先在脐静脉内皮细胞上记录到了一种 低渗激活的氯通道电流,发现该通道的激活可明显减 轻细胞水肿的程度Nilius称此现象为调节性容量 减低(regul~edvolumedecrease,RVD),指出它可能是一 . -nas t," —^ .,,—'一',一.一一一 吾0 , [so 扣 tomcsohtuon , 善_m 罔80mV一 同一.善{ 40mV .1 150 1oo 5O reversalpotentia1 . , )_6OI4O一2q?I2040gO ?一5O_ -一1OO_ _ 图3依据一个有代表性的细胞上测得的电流描绘 出的电流/膜电位关系曲线 . 3Thecurrent/membranep0talrelatior~hlpc?e plottedfromaLypicalcurrentacfivib- 种重要的细胞保护机制,同时将该电流命名为容量调 节性氯电流(, )或水肿激活性氯电流() Nihus等进一步实验证明,该通道在多种内皮,上皮细 胞膜上广泛存在,Tamoxifen和Quinine等药物可阻断该 通道电流活动 Zhmlg和Jacob等在新鲜分离的晶状体纤维细胞 上也记录到这种渗透压激活的氯通道电流Ia Tmnoxifen,NPPB等药物可阻断该通道活动.他们进 一 步将离体的完整晶状体孵育于低渗液中,在组织水 平观察到,低渗液中加入Tamoxifen组的晶状体水肿出 现较快,程度较重不加Tamoxifen组,则水肿较轻,且 水肿过程中有一个明显的容量减低过程.故推测I 1999.Vol17.N05 国1一个代表性的LEC上 _己录到的电流活功(膜电位 分别为?40mV.A代表外向 电流,B代表内向电流,箭头 所指为车实验条件下来能 亢丹补偿的电容电流)国 2低淳灌流lO帅后录 到的电流话功.有明显的电 压依桢性F.1C~ents ~rdedinatZ,'pical.(with ?40?Ha?el:otent[a1. Astandsf~tsidecu—d.B n蛐forinsid~帆e)F.2 Atoltage-dependentnuT ~xm4edlO啪nafterHTS infu~i【1n 对于晶状体的容量河节具有重要意义2 本实验应用全细胞膜片钳技术,在培养的LECs膜 上也观察到了低渗敏感性通道的存在LECs被钳制 在0mV,在胞外等渗液灌流时,各种刺激电压下通道 活动均较微弱但在胞外25%低渗液灌流后可记录 到明显的电流变化,此时镜下可见被钳制细胞胞体水 肿,变大,变圆该通道的激活呈明显的电压依赖性. 在胞内外氯离子浓度对称情况下,反转电位为一5.53 mV,非常接近氯离子平衡电位(E.=0mV).通道活性 可被容量调节性氯通道的特异性阻断剂Tamoxifen(1(30 ~,mol/L)部分抑制上述特征与Nilitts等及Jacob 等报道的容量调节性氯通道特征基本一致,故推测 该电流可能是容量调节性氯电流(Ir=1). Tmnoxifen是一种抗雌激素类药物,国外临床上广 泛用于乳腺癌的治疗许多妇女长期预防性使用此药 物,以减低乳腺肿瘤的发病率现已发现该药物长期 应用有致白内障的副作用.我们推测,当晶状体组 织面临各种渗透压变化时,LEC膜上的容量调节性氯 通道,可能与晶状体纤维细胞膜上的氯通道一起激活, 共同调节晶状体的水台状态,以减轻晶状体水肿程度. 如果长期使用此类药物,由于Eff3阻断了细胞容量调 节这一重要保护机制,此时一旦晶状体再面对渗透压 应激,则更易发生水肿,罹患白内障 4参考文献 l鄂征组织培养技术第2版北京:凡民卫生出版社.1988127 2aJJ,J0b1"1.Volurt~regulationinthebov4nelema?dcm invoLve~ntofc~floridechmmdsJClinInvest,1996.97(4):971 3陈军(译)膜片钳拄术的原理和操作.神经解剖学杂志,1994.10:360 4G.0PK?GatesP,RaeJL,elalElectrophysiolo~ofc~turedhumanlem 眼科研究1999年l0月第l7卷第5期 epithelialcellsJMembrBio1.I99O.I17门):285 5Niliu.~B.OikeM,ZahradnikI.ela1.Activationlachlofid~lonic(bv hv~*0tonic~,ohmeinc.re.sse.inhumanendothelials.Jnnwsio【.】994.103 t5)787 6NiliusB—E嘴tJ,Voe~sT.elalIp…ofhlm陀a【ed… ck~nnelsmman1m…UsPr0gBiophMdBio1.1997.68tI)69 7NilJusB.E骅mnIJ,Vr.eEalVoLume-~tivedchloridech—Gen Ph,.1996.27(7)lI3l 8曲mz,IJ,Job3"J,\:alverdeMA.ela1.T~xlfenbLocksehlofdecb肌nebJ ClinIn,1994,94(4):1690 9Zhang.JacoblrJ,HaSP,da1.L棚s.pcmL硼by跚b艘sI10nsBrJ Ph~meo1.1995.1t5(8)l347 收稿:1998—06—29修阿:1999—05一io 一 次性注射针头致化脓性眼内炎26例分析 李春荣秦玉芝宋绣雯 随着一次性注射器的广泛应用.废弃针头致伤后引起化脓 性眼内炎的发病率明显增高,它亦是儿童眼外伤常见致盲的原 因之一从1999年以来我院收治的402侧眼外伤中,一次性废 针头致化脓性眼内炎26例.现将治疗情况分析讨论如下 1资料与方法 1.1一般资料:本组26例f26眼)全部为一次惶针头致伤,男 2l侧,女5例年龄4,27岁,平均年龄824岁;学龄前儿童I4 例占538%;学龄儿童10例.占38.46%右眼L1例.左眼l5 耐受伤到洽疔时间I,22天,平均107天. 眼部情况:角膜穿通伤l4例,占5384%.巩膜穿通伤l2 例,占4615%就渗时伤眼结膜混合充血,角膜水肿,前房渗 出或积脓.虹膜后牯连,纹理不清,瞳孔区可见厚薄不等的渗出 膜.玻璃体呈黄白色反光,眼底均不可视及.晶状体混浊者12 例 1.2治疗方法 (1)药物治疗:所有病耐人院后一经确诊,立即给1%阿托 品敬瞳,抗生素点眼,结膜下注射庆大霉素或妥布霉索2万单 位,加地塞米松2呜,全身应用大量抗生素(青霉索,氨苄青霉 素,先锋霉素等)并同时加地塞米松5lOmg静脉滴注其中 l3例在用药前抽取房水或玻璃体,行细菌培养及药敏试验,并 及时根据药敏情况调换抗生素.其细菌培养阳性结果者9例, 表皮葡萄球菌3例,金黄色葡萄球菌2例,链球菌2例,绿脓杆 菌L例,棒状杆菌1例.其余6例细菌培养阴性 (2)玻璃体切割治疗:其中l3例人院后第3天行玻璃体切 割治疗.其方法为常规睫状体平坦部三切口=作玻璃体晶状体 切陈.其中11例林格氏液加庆大霉素8?作灌注液:1例 绿脓杆菌及I例棒状杆菌感染者灌注液内使用妥布霉素 8m臣/. 2结果 疗效判定:治疗两周后根据视力盟裂隙灯检查综合判定. 治愈:症状消失,玻璃体少许混浊,视力>005:好转:症状明显 减轻,玻璃体中度或局限混浊,视力为光感005;无效:症状 无改善,视力无光感,眼底不可视及或眼球趋于萎缩. 治疔结果:玻璃体切割组治愈6侧,为462%,好转4例. 作者单位:4:50000郏州市二七区人民医院t李春荣;部州市第』, 民医院(辜玉芝);河南医科学第一附属医院(宋绣雯) ? 临床经验? 为308%.总有救率为77%,无效3倒.为23%;药物组治愈1 例,治愈率为77%,有效5倒,为38.5%,总有效率为462%, 无效7例,为538%;随访2—14个月,14例视力和出院时相比 较,均无明显改善.玻璃体切割组眼球萎缩3例,药物组4例 玻璃体切割组3侧3个月后二期植人人工晶状体,视力达0.5. 药物坦2例困炎症反复发作再救^院行玻璃体切割术: 3讨论 3.1一次性注射器致外伤性眼内炎特点 本文学龄前儿童受伤占53%,由于针头锐利所致伤口小. 短时间可cjj合,可无虹膜脱出,当时不会I起严重反应.因此 延误就谚时间.失去早期治疗的时机本文首诊达?天上 者4例:26例中平均就谚时间为l07天,人院时视力无光感 者占308%: 废弃针头刺伤眼球后,其感染源极为复杂,可引起严重的 虹膜炎症反应,本文治疗无效者占38.5%,最终7例(27%)眼 球萎缩,有的长期反复出现眼部炎症: 3.2病原学及治疔 眼外伤所致的眼内炎革兰氏阳性细菌较多见,据R 报告,革兰氏阳性细菌占70%;革兰氏阴性菌占l5%.其余为真 菌或其它细菌本文15例细菌培养结果与该结果相符.由于 视网膜毛细血管内皮细胞及色素上皮细胞间紧密连接的生理 屏障作用.阻止r药物由血液渗入眼后段.尽管全身或结膜下 注入足够抗生素.但玻璃体内仍达不到有效的浓度,故疔效仍 不满意.本文药物组I3例治愈率仅为77%,无效者为 53.8%.而玻璃体切割组治愈率为462%由此,我们认为玻 璃体切割加上药物的玻璃腔灌注,是治疔外伤性眼内炎行之有 效的方法 3.3玻璃体切割治疔眼内炎 玻璃体切割治疗外伤性眼内炎虽有不同看法,但我们治疗 中体会到它是挽救视力和服球的最佳方法其优点是:可取材 供病原体培养;减少眼内致病菌数量;陈去感染的玻璃体,增加 抗生索在跟内的浓度;清除炎症坏死组织及膜形成的支架组 织,消脒产生视网膜脱离的潜在因素.易于联合多种手术. (收稿:1999—04—10修回:1999—07—10)