沙苑子黄酮对MCF

沙苑子黄酮对MCF word格式论文 沙苑子黄酮对MCF 作者,韦翠萍,王建梅,顾振纶 【摘要】 目的 研究沙苑子总黄酮(FAC)对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用、诱导凋亡作用以及其对NF-кB表达作用影响。方法以不同浓度(0.5,0.25,0.125,0.062 5 mg/ ml) 处理MCF-7细胞6,12,24,48,72 h后,SRB法测定细胞增殖抑制,FITC-Annexin?/PI 双染法检测凋亡率变化,用Western blot法检测NF-кB蛋白表达。结果SRB法显示, 0.5,0.25 mg/ml浓度沙苑子黄酮作用24,48 72 h以及0.125 mg/ml作用48,72 h后MCF-7细胞增殖抑制作用与对照组相比差异具有显著性,P0.01,,0.062 5 mg/ml作用48,72 h后以及0.125 mg/ml作用24 h后对MCF-7的增殖抑制作用与对照组相比也有差异性,P0.05,。FITC-Annexin?/PI 双染法FCM,flow cytometry,检测显示,不同浓度沙苑子黄酮(0.5,0.25,0.125,0.062 5 mg/ ml)作用72 h后,MCF-7细 60.34%,51.27%,46.83%, 晚期凋亡率分别为胞早期凋亡率分别为71.46%, 4.12%,3.27%,2.59%,1.26%。与对照组比较0.5,0.25,0.125 mg/ml组早、 word格式论文 晚期凋亡率差异具有显著性,P,0.01,,0.062 5 mg/ml组的早、晚期凋亡率也有差异性,P,0.05,,0.5 mg/ml剂量组的早、晚期凋亡率与5-Fu组比较差异无显著性,P,0.05,。Western blot 检测NF-κB表达,再用 Band Leader软件。结果0.125,0.25,0.5mg/ml浓度组与对照组相比NF-кB表达减少差异具有显著性,P0.01,,0.062 5 mg/ml组与对照组相比NF-кB表达也有差异性,P0.05,。结论沙苑子黄酮对MCF-7具有增殖抑制和诱导凋亡作用,其作用可能与其下调NF-кB表达有关。 【关键词】 沙苑子总黄酮, MCF-7, NF-кB, 5-Fu, 凋亡 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,初氏,1, 与石氏,2,对北京西城区近四年的居民疾病死因分析显示,居民死亡的第1位原因是恶性肿瘤,而乳腺癌居女性恶性肿瘤死亡原因的第3位。上海地区XXXX年乳腺肿瘤是第1位死因,上海市疾病控制中心统计,。乳腺癌与其他恶性肿瘤一样,药物 治疗 不良反应比较严重,甚至有些癌症病人最后死于药物的不良反应而不是疾病本身。因此,寻找一种对乳腺癌有效,而不良反应比较小的药物是十分有意义的。中医中药是世界医药宝库中的瑰宝,有很多值得我们探讨研究,也是药物开发的不竭的宝库。前期研究显示,沙苑子黄酮对S180荷瘤小鼠以及H22荷瘤小鼠的肿瘤均有增殖抑制作用,3,4,。本文用SRB法研究MCF-7对沙苑子黄酮的敏感性,FITC-Annexin?/PI 双染法FCM,flow cytometry,法研究沙苑子黄酮对MCF-7 word格式论文 诱导凋亡作用,用Western blot法检测NF-kB的表达,探讨沙苑子黄酮对人乳腺癌细胞株的作用,以期能为乳腺癌的治疗开辟一条新的途径。 1 材料与仪器 1.1 药物沙苑总黄酮由苏州中药研究所顾振纶教授提供,比色法检测质量分数为80%。RPMI 1640培养基、MEM培养基,Gibco产品,超级新生小牛血清,FBS,,杭州四季青生物工程材料研究所生产。PMI1640培养基稀释成浓度为以0.5 mg/ml,4?保存备用。 1.2 细胞株人乳腺癌细胞株MCF-7,购于中科院上海细胞生物研究所( 中国 上海)。 1.3 其它试剂FITC-Annexin ?/PI 双染试剂盒(Medsystems, Austria ),兔抗NF-κB p65多克隆抗体、批号为J119,购自Santa Cruz公司,Biotinylated 兔抗羊IgG自北京中山生购物技术有限公司,胰酶,AMRESO产品,胰岛素,上海第一生化药业有限公司生产,SRB,美国,Sigma公司,,上海化学试制公司进口分装、L-谷氨酸,L-Glu,、碘化丙啶,PI,,Sigma产品,十二烷基磺酸 word格式论文 钠,SDS,,上海化学试剂厂生产,其余试剂均为国产分析纯。 1.4 仪器 CO2孵箱,Napco 5410型,美国Napco公司,倒置显微镜,XD-20型,重庆光学仪器厂产品,酶联免疫检测仪,DG3002型,国营华东 电子 管厂产品,流式细胞仪,德国ZEis公司,,电热恒温水浴锅,H.H.S型,上海医疗器械厂产品,光栅分光光度计,722型,江苏科达智能仪器厂产品。 2 方法 2.1 细胞培养用含10%FBS、200 U/L胰岛素的MEM培养液,另加Glu 0.03,,hepes0.06,,NaHCO3 0.2%,于37?、5%CO2条件下培养,3d传代。取对数生长期细胞进行实验。以1 ×106/ml的细胞浓度,分别接种于含FAC浓度为0.5,0.25,0.125,0.062 5 mg/ml的RPMI1640培养体系中,置于37?、5%CO2条件下培养,24 h后收集细胞,以1×PBS 洗涤2次并重悬细胞,备用。 word格式论文 2.2 SRB法测定细胞活力,5,6, 取生长期MCF-7细胞接种于96孔培养板中,调整细胞浓度为4×105/孔,100 μl,,次日进行分组。实验组分为不同浓度,0.5,0.25,0.125,0.062 5 mg/ml,FAC,阴性对照组加入等体积培养液, 阳性对照组加5-Fu,每组均设4个平行孔。分别置37?、5% CO2条件下培养培养,分别于6,12,24,48,72 h后每孔加入预冷的80%三氯醋酸,TCA,50 μl使TCA终浓度为10%,固定0.5 h,加TCA时必须轻轻地加在培养液的表面,静置5 min后再将平板移至4?放置1 h,倒掉固定液,去离子水洗5遍后,晾干,每孔加入100 μl的SRB,室温放置15 min,1%醋酸洗5次,晾干,加入10 mmol/L Tris液150 μl,振荡2 min以溶解SRB。用酶标仪在波长531 nm处测定A值。 计算 肿瘤细胞增殖抑制率(IR)。 增殖抑制率,,,= ,,A对照组-A实验组,/ A对照组,×100% 2.3 双染法流式细胞术检测凋亡细胞率,7,采用FITC-Annexin V/ PI 双染法FCM,flow cytometry, 检测MCF-7细胞凋亡:4?,1×PBS 洗涤细胞2 次,调整细胞浓度至5×105/ml,每100 μl细胞悬液加入FITC-Annexin V 5 μl和PI 染液2.5 μl,轻轻混匀,避光置冰上反应10 min,入400 μl 1×PBS,混匀,备用。 word格式论文 2.4 用Western blot法检测NF-кB蛋白表达并进行定量分析,8, MCF-7细胞经不同浓度沙苑子黄酮,0.032,0.063,0.125,0.25,0.5 mg/ml,分别处理24,36,48,72 h后,用传统Western blotting方法,7,检测NF-кB表达,并用Band Leader软件分析所得的结果。 2.5 数据处理数据以 ?s表示,采用SPSS11.5统计软件进行单因子方差分析处理,组间采用Dunnett方法比较。 3 结果 3.1 抑制MCF-7细胞增殖SRB法显示,0.5,0.25,0.125,0.062 5 mg/ml浓度的沙苑子黄酮作用后, 0.5,0.25 mg/ml浓度沙苑子黄酮作用24,48,72 h以及0.125 mg/ml作用48,72 h后MCF-7细胞增殖抑制率与对照组相比差异具有显著性,P0.01,,0.062 5 mg/ml作用48,72 h后以及0.125 mg/ml作用24 h后对MCF-7的增殖抑制作用与对照组相比也有差异性,P0.05,。结果见表1及图1。表1 不同剂量的FAC作用于MCF-7不同时间后对细胞的增殖作用的影响(略) word格式论文 3.2 流式细胞术检测细胞凋亡率FITC-Annexin ?/PI 双染法FCM 检测显示,不同浓度的FAC诱导MCF-7 细胞发生凋亡,在一定范围内呈浓度依赖性,随药物浓度的增加,细胞凋亡率增加。FITC-Annexin?+/PI- 细胞为正常活力细胞,FITC-Annexin?+/PI-细胞为早期凋亡细胞,FITC-Annexin?-/PI-细胞为晚期凋亡和死亡细胞。0.5,0.25,0.125,0.625 mg/ml沙苑子黄酮作用MCF-7细胞72 h后细胞早期凋亡率分别为71.46%,60.34%,51.27%,46.83%,晚期凋亡率分别为4.12%,3.27%,2.59%,1.26%。0.5,0.25,0.125 mg/ml各组与对照组比较差异均有统计学意义(P0.01),0.062 5 mg/ml组作用72 h后对MCF-7的诱导凋亡率与对照组比较也有差异性(P0.05)。结果见图2。 与对照组比较,**P0.01,差异具有显著性, 与对照组比较,*P0.05,具有差异性 3.3 Western blot研究结果提示NF-κB表达减弱MCF-7细胞经不同浓度沙苑子黄酮,0.032,0.063,0.125,0.25,0.5 mg/ml,分别处理24,36,48,72 h后NF-κB蛋白的表达量呈下降趋势,而且这种下降趋势与作用时间以及药物浓度成依赖关系。结果见图3。根据前面的实验选取作用比较强的时间点72 h作为作用点,以不同浓度沙苑子黄酮分别作用MCF-7,72 h后用Western blot法检测NF-κB表达情况。再用 Band Leader软件分析,结果显示,0.062 5,0.125,0.25,0.5 mg/ml浓度组与对照组相比NF-кB表达减少差异具有显著性,P0.01,,0.062 5 mg/ml组与对照组相比NF-кB表达也有差异性,P0.05,。见 word格式论文 图4。 4 讨论 沙苑子为豆科植物扁茎黄芪Astragalus complanatus R.Br干燥成熟的种子,性温味甘,归肝、肾,始见于《临证指南医案》,曾以白蒺藜、沙苑蒺藜、沙苑白蒺藜、潼蒺藜等名称收入历代诸家本草。沙苑子具有温补肝肾,固精,缩尿,益肝明目的功能。自20世纪80年代开始,有不少药学工作者对沙苑子进行了较为集中的研究,并发现其对循环系统、肝、肾、免疫系统等有一定的药理作用,9,10,。沙苑总黄酮,Flavonoids of Astragalus Complanatus,FAC,是沙苑子的乙醇提取物,主要成分是黄酮。先前的药理研究表明,沙苑子黄酮具有改善血液流变学指标、抗肝纤维化、诱导白血病细胞凋亡、调节免疫功能等作用,2,3,。根据中医理论认为,乳腺癌的发病与肾虚有一定关系,而沙苑子黄酮具有益肾的作用。因此,本文推测沙苑子黄酮具有抗乳腺癌的作用,以人乳腺癌细胞株MCF-7作为研究对象,探讨沙苑子黄酮对人乳腺癌的作用及其机制。 近年来研究表明,11,13,,核转录因子кB (nuclear factor-кB, NF-кB) 是一种重要的转录因子蛋白, 对多种基因表达上调起关键作用,在肿瘤的发病机制中发挥重要作用。NF-кB有抑制细胞发生凋亡的作用, 而许多抗肿瘤药的作用机理 word格式论文 正是诱导了肿瘤细胞凋亡。沙苑子黄酮作用之前,MCF-7细胞中NF-кB表达呈阳性,主要定位于癌细胞的细胞核中,沙苑子黄酮作用之后,NF-кB阳性的表达显著降低,主要定位于MCF-7细胞的胞质。因此沙苑子黄酮具有抑制NF-кB在MCF-7种表达的作用,因此可以诱导细胞凋亡。 本文首先通过SRB法筛选法,确定对MCF-7增殖抑制作用最佳浓度梯度以及最佳时间点。再用最佳浓度梯度和作用时间点处理MCF-7细胞,检测细胞凋亡、凋亡相关基因以及蛋白表达。结果显示,沙苑子黄酮对MCF-7具有明显的增殖抑制作用,最高增殖抑制率达到87.73%。沙苑子黄酮具有显著的诱导MCF-7凋亡的作用,早期凋亡率达71.46%,晚期凋亡率为4.16%。通过最佳作用浓度沙苑子总黄酮作用有效时间后,NF-κB表达与浓度梯度及作用时间呈负相关。令人感兴趣的是这种基因表达结果正好与流式细胞分析结果相吻合,提示沙苑子黄酮作为 治疗 乳腺的药物之一,值得进一步研究。 【 参考 文献 】 ,1,初里楠,李 竹,张 燕,等. 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