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小鼠播散性巨细胞病毒感染的免疫应答和致病机制研究1)小鼠脾巨噬

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小鼠播散性巨细胞病毒感染的免疫应答和致病机制研究1)小鼠脾巨噬小鼠播散性巨细胞病毒感染的免疫应答和致病机制研究1)小鼠脾巨噬 分 类 号 学号 D200978329学校代码 10487 密级 博士学位论文小鼠播散性巨细 胞病毒感染的免疫应答和致病机制研究1)小鼠脾巨噬细胞 DNA 感受器 AIM2 识 别 MCMV DNA 激活 其炎性体通路的整体研究2)Th17 细胞在急性播散性 MCMV 感染致病机制中的作用 学位申请人: 李旭芳 学 科 专 业 : 儿科学 指 导 教 师 : 方 峰 教授 答 辩 日 期 : 2012 年 5 月 A dissertation submitt...
小鼠播散性巨细胞病毒感染的免疫应答和致病机制研究1)小鼠脾巨噬
小鼠播散性巨细胞病毒感染的免疫应答和致病机制研究1)小鼠脾巨噬 分 类 号 学号 D200978329学校代码 10487 密级 博士学位论文小鼠播散性巨细 胞病毒感染的免疫应答和致病机制研究1)小鼠脾巨噬细胞 DNA 感受器 AIM2 识 别 MCMV DNA 激活 其炎性体通路的整体研究2)Th17 细胞在急性播散性 MCMV 感染致病机制中的作用 学位申请人: 李旭芳 学 科 专 业 : 儿科学 指 导 教 师 : 方 峰 教授 答 辩 日 期 : 2012 年 5 月 A dissertation submitted to Huazhong University of Science and Technology for the Degree of Doctor of Medicine The Studies on Immune Responses and Pathogenesis of Mice with Disseminated Murine Cytomegalovirus Infection:1 Recognition of MCMV DNA by AIM2 as DNA sensor and activation of AIM2 inflammasome pathway in spleen macrophages of mice with disseminated MCMV infection in vivo2 Roles of Th17 cells in the pathogenesis of the acute disseminated MCMV infection D.Candidate: Li Xufang Major: Pediatrics Supervisor: Fang Feng Huazhong University of Science amp Technology Wuhan 430074 P. R. China May 2012 独创性声明 本人郑重? 鳎 狙 宦畚氖潜救嗽诘际χ傅枷陆 械难芯抗ぷ骷叭〉玫难芯砍晒 淖芙帷,?宜 闹幸丫 昝饕 玫哪谌萃 猓 韭畚牟话 魏纹渌 鋈嘶蚣 逡丫 ?砘蜃 垂 难芯砍晒 ,员疚牡难芯 孔龀龉毕椎母鋈撕图 澹 言谖闹幸悦魅贩绞奖昝鳌,救送耆 馐兜奖救私 械 ,旧 饕 鸬囊磺蟹 珊蠊 ?学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版 权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即: 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查 阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保 密? ,在_____年解密后适用本授权书。本论文属于 不保密?。(请在以上方框内 打“?” )学位论文作者签名: 指导教师签名:日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 基 金项目——教育部博士点基金项目《CMV 激活天然免疫细胞 dsDNA 感受器相关 炎性体通路对抗 CMV 免疫的指导作用》,项目编号:2009014211007 目 录缩略 3英文摘要7前 言 13一、 小鼠脾巨噬细胞 DNA 感受器 AIM2 识词1中文摘要 别 MCMV DNA 激活其 炎性体通路的整体研究 20 材料和方法 21 结 果 29 讨 论 33 参考文献 37二、Th17 细胞在急性播散性 MCMV 感染致病机制中的作用实 验一 MCMV 体外诱导 Th17 细胞分化方法的探索 40 材料和方法 40 结 果 46 讨 论 50 参考文献 51实验二 Th17 细胞在急性播散性 MCMV 感染致病机制中 的作用 54 材料和方法 54 结 果 61 讨 论 69 参考文献 72全文小结 74综 述 75 附 录 87致 谢 88 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 缩略词表英文缩写 英 文全名 中文名AIM2 absent in melanoma 2 黑色素瘤缺失基因 2ASC apoptosis-associated speck-like protein 包含 CARD 结构域的 containing a caspase recruitment CARD 凋亡相关点样蛋白 domaincaspase-1 cysteine-aspartic protease-1 半胱氨酸天冬氨酸蛋白 酶1CIA collagen-induced arthritis 胶原诱导的关节炎CMV cytomegalovirus 巨细胞病毒DAI DNA-dependent activator of IRF DNA 依赖性 IRF 激活因 子dsDNA double stranded DNA 双链 DNAdsRNA double stranded RNA 双 链 RNAEAE Experimental autoimmune encephalomyelitis 实验诱导的自身免疫性 脑 脊髓炎ELISA enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验GAPDH Glyseraldehyde-3- phosphate dehydrogenase 3-磷酸甘油醛脱氢酶HBV hepatitis B virus 乙型肝炎病毒HCMV human cytomegalovirus 人巨细胞病毒HCV hepatitis C virus 丙 型肝炎病毒HIV human immunodeficiency virus 人免疫缺陷病毒HSV herpes simplex virus 单纯疱疹病毒IFN interferon 干扰素IRF interferon regulation factor 干扰素调节因子IL-1β interleukin-1β 白细胞介素 1βIL-17 interleukin-17 白细胞介素 17 1 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文IL-18 interleukin-18 白细胞介素 18IL-21 interleukin-21 白细胞介素 21IL-23 interleukin-23 白细胞介素 23MCMV murine cytomegalovirus 小鼠巨细胞病毒MyD88 myeloid differentiation factor 88 髓系分化蛋白 88MOI multiplicity of infection 感染复数MEF mouse embryonic fibroblast 小鼠胚胎成纤维细胞NF-κB nuclear factor-kappa B 核因子 κBNK natural killer cell 自然杀伤细胞NLR Nucleotide-binding oligomerization NOD 样受体 domain-like receptorNALP3 NACHT LRR and PYD domain-containing 包含 NACHT、LRR 和 protein 3 PYD 结构域的蛋白 3PAMP pathogen-associated molecular pattern 病原相关的分子模式PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液pro-caspase-1 pro- cysteine-aspartic protease-1 半胱氨酸蛋白酶 1 前体pro-IL-1β pro-interleukin-1β 白 -IL-18 pro-interleukin-18 白细胞介素 18 前体PFU plaque 细胞介素 1β 前体pro formation unit 空斑形成单位PMA Phorbol-12-myristate-13-acetate 佛波酯Th1 T helper 1 cell 辅助性 T 细胞 1 型Th2 T helper 2 cell 辅助性 T 细胞 2 型Th17 T helper 17 cell 辅助性 T 细胞 17 型TLR toll-like receptor Toll 样受体TMEV Theiler’s murine encephalomyelitis virus 泰勒虫属鼠脑脊髓炎病 毒 2 华 中 科 技 博 士 学 位 论 文 小鼠播散性巨细胞病毒感染的免疫应答和致病机制研究 大 学 1)小鼠脾巨噬细胞 DNA 感受器 AIM2 识别 MCMV DNA 激活其炎性体通路的整体研究 2)Th17 细胞在急性播散性 MCMV 感染致病机制中的作用 中文摘要【目的】1 在整体水平观察小鼠 MCMV 感染后脾巨噬细胞内 AIM2 炎性体各组分蛋白及其 下游促炎因子 IL-1β 和 IL-18 的时序性表达变化,证实 AIM2 对 MCMV DNA 的 识别并探讨其炎性体通路在抗 MCMV 天然免疫与获得性免疫机制中的作用;2 在整体水平观察 MCMV 播散性感染急性期脾 Th17 细胞的分化及其细胞因子 IL-17A 在不同脏器内的表达变化,分析 Th17 细胞和 IL-17A 表达与 MCMV 载量 及脾和唾液腺病理改变的相关性,探讨 Th17 细胞在急性播散性 MCMV 感染致病 机制中的作用。【方法】1 建立动物模型:45只4.5周龄BALB/c小鼠,腹腔接种(5×103)PFU MCMV Smith 株,建立播散性感染模型,另45只小鼠模拟感染做为对照。 7 于病毒接种后3 d、 d、 14 d、28 d(急性期末)和45 d,收集小鼠静脉血和无菌分离脾、唾液腺、肝和肺 组织。为获取足够的脾巨噬细胞和血清样本量,各组每个时间点随机抽取3只小鼠 为1小组,其静脉血予以混合,脾脏各取2/3加以混合富集巨噬细胞,其余组织样 本随机抽取3份,故每个时间点的样本数为3;2 AIM2炎性体通路蛋白表达:分离小鼠脾脏中巨噬细胞,提取蛋白,用Western blot 法检测AIM2炎性体通路蛋白包括AIM2、ASC、pro-caspase-1和caspase-1的表达强 度,设GAPDH为内参蛋白,以各目的蛋白与GAPDH蛋白积分光密度比值(K 值) 进行半定量分析; 3 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文3 血清IL-1β和IL-18水平:用双抗体夹心ELISA法检测血清中AIM2炎性体通路下游 细胞因子IL-1β和IL-18水平的变化;4 优化Th17细胞分化诱导:分离3只正常小鼠的脾脏淋巴细胞;分别应用无刺 激、灭活MCMV、PMA/Ionomycin、灭活 MCMVPMA/Ionomycin刺激方法;在脾 脏淋巴细胞培养刺激不同时间后,采用流式 细胞术检测CD3CD4IL-17A细胞比 率;并用双抗体夹心ELISA法检测培养上清中IL-17A蛋白浓度,观察分析不同方 法诱导Th17细胞分化的效应,选择最佳的分化诱导方法;5 脾Th17细胞比率和病毒特异性IL-17A表达水平:取急性期阶段即感染后3 d、7 d、 14 d和28 d 的脾组织,分离脾脏淋巴细胞。采用灭活 MCMVPMA/Ionomycin刺激 方法诱导Th17细胞分化,用流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中CD3CD4IL-17A细 胞 比 率 。 用 双 抗 体 夹 心 ELISA 法 检 测 培 养 上 清 中 IL-17A 浓 度 时 , 设 立 单 独 PMA/Ionomycin刺激组作为基础刺激对照,计算灭活MCMV/PMA/Ionomycin刺激 和单独PMA/Ionomycin刺激脾淋巴细胞培养上清中IL-17A浓度之差值来评估病毒 特异性IL-17A表达水平。对比分析两组之间的差异;6 不同脏器组织中IL-17A蛋白表达:用免疫组织化学染色法检测急性期试验小鼠脾、 唾液腺、肝、肺组织中IL-17A蛋白的表达分布情况,对比分析不同脏器组织的局 部免疫特征;7 脾和唾液腺病理变化:取脾和唾液腺组织切片行HE染色,半定量评估急性期试验 小鼠脾和唾液腺组织的病理变化;8 MCMV病毒载量:用空斑试验检测急性期各脏器组织内感染性病毒滴度;9 相关性分析:对脾细胞培养上清中病毒特异性IL-17A和组织中IL-17A蛋白表达水 平与脾和唾液腺组织病理损伤程度及病毒载量进行相关性分析。【结果】1 AIM2炎性体通路蛋白表达:MCMV感染后的脾巨噬细胞提取蛋白中,AIM2炎性 体通路各组分包括AIM2、ASC、pro-caspase-1和caspase-1蛋白表达呈现一致性变化, 均在感染后3 d 意 义 , K (感染早期)显著升高达峰值,与模拟感染对照组相比差异有统计 学值 分 别 为 1.120 ? 0.243 vs 0.230 ? 0.046 ; 1.318?0.333 vs 4 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 0.248?0.090;2.049?0.401 vs 0.390?0.120;1.483?0.420 vs 0.176?0.045,均 Plt0.01;其后表达均下降,与对照组水平相当;2 血清IL-1β和IL-18水平:MCMV感染组血清IL-1β和IL-18浓度于感染后3 d 明显高 于模拟感染对照组,IL-1β浓度为(111.050?28.500)vs(55.858?2.983)pg/ml, Plt0.05;IL-18浓度达(99.911?2.222)vs(57.206?6.228)pg/ml,Plt0.01;3 优化Th17细胞分化诱导方法:无刺激组和灭活MCMV刺激组均不能有效诱导 Th17细胞表达。与应用相同方法培养刺激1 d6 h组及应用PMA/Ionomycin培养刺 激6 h组相比,灭活 MCMVPMA/Ionomycin培养刺激6 h组能够有效诱导Th17细 胞分化 Th17细胞比率分别为 0.163 ? 0.035 vs 0.083 ? 0.032,Plt0.05; 0.163 ? 0.035 vs 0.033 ? 0.015 ,Plt0.01;同时,脾淋巴细胞培养上清中IL-17A 浓度也明显升高分别为67.246 ? 4.578 vs 45.317 ? 8.793 pg/ml,Plt0.05; 67.246 ? 4.578 vs 24.474 ? 5.134 pg/ml,Plt0.01;4 脾Th17细胞比率和病毒特异性IL-17A表达水平:MCMV感染后3 d,7 d,14 d, 28 d,小鼠脾淋巴细胞体外经优化方法诱导分化,Th17细胞比率均高于模拟感染 对照组分别为 0.67?0.13 vs 0.22?0.02,P0.004;0.82?0.02 vs 0.18? 0.06,P0.004;1.14?0.09 vs 0.19?0.04, (0.47?0.11) (0.20 P0.000; vs ?0.06),P0.017。MCMV感染组脾淋巴细胞培养上清中病毒特异性IL-17A 蛋白浓度在感染后3、7 d虽有升高,但与模拟感染对照组相比无统计学差异 (Pgt0.05) 而感染后14 d达峰值, ; 明显高于对照组81.98?12.37 vs 44.96?8.44 pg/ml,Plt0.01;至感染后28 d 虽有下降,但仍高于对照组57.58?8.14 vs 35.10 ?10.41 pg/ml,Plt0.05;5 不同脏器组织中 IL-17A 蛋白表达:MCMV 感染鼠的肝、肺组织中仅于感染后 3d 可见少量 IL-17A细胞;脾和唾液腺组织中可见明显增多的 IL-17A细胞,并 于感染后 14 d 达峰值,且部分 唾液腺分泌管上皮细胞也表达 IL-17A; 5 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 6 脾和唾液腺病理变化:MCMV 感染后 14 d 脾组织病理损伤程度最重:白髓结构 明显破坏,可见大量吞噬细胞、出血坏死及纤维条索增生;MCMV 感染后 14 d 唾 液腺组织病理损伤程度也最严重:出现大量炎性浸润灶,组织结构明显破坏; 7 MCMV 病毒滴度:肝和脾组织病毒滴度于感染后 3 d 升高,其后迅速下降,14 d 检 测不到;肺组织病毒滴度低于检测低限,而唾液腺组织病毒滴度呈逐渐增高趋 势, 于感染后 14 d 达峰值; 8 相关性分析:脾淋巴细胞培养上清中病毒特异性 IL-17A 蛋白浓度与唾液腺组织 病毒滴度呈正相关(r0.74,Plt0.01);脾和唾液腺组织病理 损伤越重,脾细胞 培养上清中病毒特异性 IL-17A 蛋白浓度越高(r0.78 Plt0.01); 唾液腺组织内 的 IL-17A 蛋白表达与 MCMV 滴度变化呈正相关(r0.63,Plt0.05), 并与脾和 唾液腺组织病理损伤程度也呈正相关(r0.68,Plt0.01)。【结论】 1 在 MCMV 感染早期,小鼠脾巨噬细胞 AIM2 感受器能够识别胞内 MCMV DNA; AIM2 炎性体参与 MCMV 感染早期的抗病毒天然免疫应答;同时,通过其下游 细 1β 和 IL-18 在启动获得性免疫应答过程中发挥重要作用。 2 MCMV 感胞因子 IL- 染急性期 IL-17A 蛋白表达呈现明显组织差异性分布,其在唾液腺中高 表达的局部 免疫特征可能是 MCMV 能够在唾液腺中长期持续复制的关键免疫因 素之一; Th17 细胞可能通过 IL-17A 参与 MCMV 持续性感染及组织免疫病理损 伤机制。 【关键词】DNA 感受器;AIM2 炎性体通路;IL-1β;IL-18;天然免疫;小鼠巨细 Th17 细胞;IL-17A 6 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 The 胞 病毒; Studies on Immune Responses and Pathogenesis of Mice with Disseminated Murine Cytomegalovirus Infection1 Recognition of MCMV DNA by AIM2 as DNA sensor and activation of AIM2 inflammasome pathway in spleen macrophages of mice with disseminated MCMV infection2 Roles of Th17 cells in the pathogenesis of the acute disseminated MCMV infection AbstractObjectives:1 To observe the time courses of expression of AIM2 inflammasome in spleen macrophages and its downstream cytokines IL-1β and IL-18 in sera from mice with acute disseminated murine cytomegalovirus MCMV infection in order to demonstrate whether AIM2 could recognize MCMV DNA and explore the role of AIM2 inflammasome pathway in innate and acquired immune responses against MCMV in vivo.2 To investigate the differential levels of T helper 17 Th17 cells and expression of cytokine IL-17A in the different organs during the acute stage of disseminated MCMV infection and to analyze the relationship between expression of IL-17A and MCMV titers or pathological changes in the tissues for further understanding the role of Th17 cells in the pathogenesis of the acute disseminated MCMV infection in vivo.Methods: 1 Development of the mouse model: Fory-five BALB/c mice aged of 4.5-week-old were inoculated intraperitoneally with salivary gland homogenates containing 5×103 PFU of MCMV Smith strain to establish the model with the disseminated MCMV 7 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 infection another 45 mice injected with normal salivary gland homogenates served as mock-infected controls. On the 3d 7d 14d 28d the end of acute infection and 45d of post infection PI nine mice were sacrificed and their venous blood spleens salivary glands livers and lungs were obtained respectively. In order to get enough volume of sera and number of macrophages from spleen every 3 mice as one subgroup were randomly selected and their blood samples and the two to third of spleens in size were mixed up as one sample and the rest spleens and other tissues were randomly selected from 3 mice so that there were 3 samples at each time point.2 Expression of AIM2 inflammasome proteins: Macrophages were isolated from spleens and their proteins were extracted then the expression of AIM2 inflammasome proteins including AIM2 ASC pro-caspase-1 and caspase-1 were detected by using Western blot assay. GAPDH protein served as the internal control. The expressing .
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