清开灵干预新生大鼠缺氧缺血脑皮质白介素6及fasl蛋白的实验研究

清开灵干预新生大鼠缺氧缺血脑皮质白介素6及fasl蛋白的实验研究 清开灵干预新生大鼠缺氧缺血脑皮质白介 素6及FasL蛋白的实验研究         &nb sp;  作者:陈敬国～方慧云～蒋犁～程敏婷 【关键词】  脑缺氧,,,脑缺血,,,新生大鼠,,,清开灵,,,白介素-6,,,Fas-L蛋白 摘要:目的探讨缺氧缺血脑损伤对新生大鼠HIBD脑皮质IL-6放射免疫浓度～Fas-L蛋白达的影响～及清开灵对新生大鼠HIBD的干预治疗作用以及有关分子机制。建立HIBD动物模型后分为放射免疫法测定组和免疫组化测定组～每组又分为清开灵干预组、生理盐水对照组、假手术组～根据检测需要～在缺氧缺血后24 h～3 d～7 d作IL-6脑皮质匀浆放射免疫浓度测定、Fas-L蛋白免疫组化SP法测定。结果?脑皮质组织匀浆IL-6放射免疫浓度,pg/ml,假手术组、生理盐水组、清开灵干预组:24 h依次为50.1〒6.2,56.3〒7.1,51.3〒6.8;3 d依次为50.6〒6.4,250.3〒11.2,78.1〒8.3;7 d依次为51.4〒6.6,345.7〒12.3,81.2〒9.2,生理盐水组与另两组分别比较,24 hP均,0.05,无明显变化;3,7 d生理盐水组增加明显P<0.05)清开灵干预组降低明显P<0.05)。???左脑皮质Fas-L蛋白表达阳 性率假手术组、生理盐水组、清开灵干预组:24 h依次为 8.04〒3.50,120.20〒6.10,21.10〒5.10;3 d依次为8.20〒 3.10～87.6〒5.90,13.40〒4.20;7 d依次为8.01〒 2.80,8.32〒2.90,8.26〒2.83;生理盐水组与另两组分别比 较～7 dP均,0.05～无明显变化,24 h,3 d增多明显 ,P<0.05,～清开灵干预组降低明显,P<0.05,。结论 ?新生大鼠HIBD后24 h～3 d,7 d脑皮质IL-6含量逐渐增 高。?清开灵能降低新生大鼠HIBD脑皮质IL-6的产生量。 ?新生大鼠HIBD后～结扎侧脑皮质fas-L蛋白表达增高。 ?清开灵能抑制新生大鼠HIBD结扎侧脑皮质fas-L蛋白的 高表达。 关键词:脑缺氧,  脑缺血,  新生大鼠,   清开灵,  白介素-6,  Fas-L蛋白 Effects of QingKaiLing on the Radioimmunologic Concentrations of IL-6, the Expression of Fas-L Protein in the Cortex in Neonatal Rats after Hypoxic-ischemic Brain Damage Abstract:ObjectiveTo explore the immunologic changes of interleukin-6(IL-6), the expression of fas-L protein of cortex in newborn rats after HIBD and the effects of QingKaiLing on them.MethodsTo divide animals for experiment into groups: IL-6 test group: Animals were divided into sham group, NS group and QingKailing group, IL-6 radioimmunologic concentrations of cortex were measured at 24 h, 3d and 7d after hypoxia ischemia by radioimmunoassay. Immunohistochemistry group: Animals were divided into sham group, NS group and QingKaiLing group. The changes of expression of fas-L protein were detected at 24h, 3d and 7d after hypoxia ischemia by immunohistochemistry.ResultsComparing with the sham group, the concentration of IL-6 and the expression of fas-L protein (at 24h, 3d and 7d) increased obviously in the ligated side of the brain cortex in NS group (P,0.05 . Comparing with NS group, they were on the contrary in QingKaiLing group(P,0.05,.ConclusionThe concentration of IL-6, the expression of fas-L protein become higher rapidly after HIBD. QingKaiLing can inhibit the production of IL-6 and the expression of fas-L protein. Key words:Cerebral-hypoxia;  Cerebral-ischemia;  Neonatal rats;  QingKaiLing;  IL-6;  Fas-L protein     新生儿缺氧缺血性脑损伤,neonatal hypoxic-ischemic brain damage～HIBD,是围生期中的胎 儿或新生儿由于各种因素引起的缺氧缺血～脑血流减少或暂 停而导致的一种疾病～是窒息后的严重并发症～是导致儿童 神经系统伤残的常见原因之一～严重的缺氧缺血性脑损害可 产生永久性神经系统缺陷～如脑瘫～智力低下～学习障碍～ 癫痫等,1,。由于西药毒性作用大～疗效不肯定。我们试图 从我国中药宝库中寻找治疗HIBD的有效药物～观察其疗效 和作用机制～现将研究如下。 1  材料与方法 1.1  动物由东南大学医学院实验动物中心提 供同窝7日龄Sprague-Dawley大鼠～雌雄不限～平均体重 约12.0~15.8 g。 1.2  试剂 1.2.1  IL-6放射免疫检测试剂盒:购自天津九鼎生物工程有限公司。 1.2.2  Fas-L免疫组化染色试剂盒:由武汉博 1士德生物工程有限公司提供。 1.2.3  清开灵注射剂:购自山西太行山制药厂。 1.3  方法 1.3.1  围生期HIBD动物模型的制作按照Rice方法～取出生7日龄的SD大鼠。乙醚吸入麻醉1~2 min后仰卧～四肢固定于手术板上～做颈正中切口游离左侧颈总动脉～4号手术线结扎左颈总动脉～缝合切口～于原饲养环境恢复2.5 h后放入缺氧舱容器中～该容器中连续灌入37?恒温水～以1.5 l/min的速度输入8%O2～92%N2混合气体～持续2.5 h。 1.3.2  实验动物分组处理72只新生大鼠,7日龄,随机分为3大组～每组24只～每大组分为3个时间点小组:24 h～3 d和7 d～每小组8只～一大组为清开灵干 预组～首先用Rice方法建立新生大鼠HIBD模型～于结扎左侧颈总动脉后恢复2.5 h～缺氧后腹腔注射清开灵10 ml/kg/d～分别于24 h～3 d和7 d断头取脑～用左侧脑皮质匀浆作IL-6放射免疫浓度测定～二大组为生理盐水对照组～基本方法如上～生理盐水腹腔注射剂量为10 ml・kg-1・d-1～3大组为假手术组～单纯游离左侧颈总动脉不结扎～不缺氧～其余方法如上。免疫组化测定:72只7日龄新生大鼠分组实验方法如上～于每一时间点取脑～中性甲醛固定脱水～透明～包埋和切片～采用免疫组化SP方法染色～检测各组皮质部位fas-L蛋白的表达。 1.4  结果统计各项检测指标均以〒s表示～采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析～和q检验～结果P,0.05为差异有统计学意义。 2  结果 2.1  脑皮质IL-6放射免疫浓度测定结果在实验中观察到:与假手术组相比～生理盐水对照组脑皮质组织匀浆IL-6的放射免疫测定浓度在24 h无明显变化～3 d～7 d～IL-6增高明显(P<0.05),与生理盐水对照组相比～清开灵干预组脑皮质组织匀浆IL-6的放射免疫测定浓度在24 h无明显变化～3 d～7 d IL-6的放射免疫测定浓度降低明显(P<0.05)。结果见表1。 表1  3组新生大鼠HIBD脑组织皮质部位IL-6放射免疫浓度(略) 与假手术比较～*P,0.05～与生理盐水对照组比较～?P,0.05,n=8 2.2  脑组织皮质部位Fas-L免疫组化检测结果染成棕黄色的细胞为阳性细胞～实验中观察到～与假手术组相比～生理盐水对照组结扎侧脑皮质部位Fas-L在蛋白水平上在7 d变化不大～24 h,3 d表达明显增高,P<0.05〉～与生理盐水对照组相比～清开灵干预组在24 h,3 d表达增高不明显,P<0.05,～在7 d变化不大,P>0.05,。结果见表2。 表2  3组新生大鼠HIBD脑组织皮质部位Fas-L蛋白表达阳性率(略) 与假手术比较～*P,0.05～与生理盐水对照组比较～?P,0.05,n=8 3  讨论 在中枢神经系统内～IL-6主要由胶质细胞产生～包括小胶质细胞和星形胶质细胞。脑缺血及缺血再灌注后小胶质细胞迅速激活～增殖～并聚集于损伤部位。小胶质细胞激活在脑缺血再灌注中的作用具有双重性。一是神经营养作用～可转化为吞噬细胞～吞噬死亡神经细胞残骸和变性的神经突触～合成新的神经结构,分泌IL-6～α干扰素～转化生长因子,TGF,β～胰岛素样生长因子-1和碱性成纤维细胞生长因子等神经营养因子～促进组织修复～支持神经元的存活。二是神经细胞毒性作用～通过与神经细胞的直接接触～胞内吞噬神经细胞～另外释放～分泌一系列潜在的神经毒性物质和炎性因子～如氧自由基、超氧化物等而致脑损害,2,。星形胶质细胞具有抗原呈递和分泌细胞因子等作用。最新研究表明缺血可诱导星形细胞的坏死与凋亡～正常情况下星形细胞IL1α～IL6与TNFα等细胞因子的mRNA表达水平很低～但在缺血时则表达显著增加,而且这些细胞因子的表达水平与缺血时间有关～在脑缺血后IL1α最先表达～TNFα次之～IL6表达最晚,3～4,。此前国外已有人作过脑组织IL-6 mRNA及其蛋白表达的研究与此结论相符。IL6是一种重要的细胞因子。有实验,5,将IL6直接注射至大鼠脑内～可明显减 轻缺血性脑损害的体积～表明IL6对HIBD脑组织有保护作用。 有研究,6,表明～缺氧缺血可导致神经细胞的坏死～ 亦存在凋亡过程发生～有关“凋亡基因”的改变已引起人们的关注～Fas及其Fas-L就是其中的“凋亡基因”的一部分。Fas-L多肽是一种35KD膜表面受体蛋白～由319个氨基酸组成～Fas-L蛋白胞浆区的一段60~70个氨基酸序列与TNF受体高度同源～对介导细胞死亡是必须的～称为死亡域,Fas-L蛋白复合三聚体具有诱导凋亡的能力～并通过死亡域间的相互作用促进Fas-L蛋白聚合而传导死亡信号～激活转录因子NF-KB～启动靶细胞内的凋亡程序。实验显示Fas-L蛋白表达增多时～凋亡明显可见～干预治疗后Fas-L蛋白表达减少～说明Fas-L与凋亡密切相关。还观察到Fas-L蛋白表达高峰时间较前～后逐渐减少～这说明它引起凋亡的作用时间较早。本实验研究表明Fas-L蛋白在正常新生大鼠脑内弱表达～缺氧缺血后病变部位出现散在分布的强阳性细胞～多是凋亡脑细胞～表明Fas-L与脑细胞凋亡有直接的关系～Fas-L参与了脑细胞凋亡的过程～Fas-L的作用是HIBD的发病机制之一。经干预治疗后～Fas-L的蛋白表达减少。说明早期干预阻抑了脑细胞的凋亡进程～对神经组织有明显的修复保护作用。另外在实验结果中～我们观察到脑损伤后随着时间的推移～Fas-L的蛋白表达明显减少～显示Fas-L参与凋亡的作用时间较早。中药清开灵注射液是在《温病条辨》安宫牛黄丸的 基础上研制而成的一种纯中药复方针剂～其主要成分有:牛黄、水牛角、珍珠母、黄芩、栀子、金银花、板蓝根等。研究表明～清开灵注射液具有改善脑循环～抑制血小板聚集～降低血黏度抑制过氧化脂生成～抗自由基,7,～对抗兴奋性氨基酸对脑组织损伤,8,等作用。动物实验也证实～清开灵对缺血性,9,及感染性 ,10,脑损伤均有保护作用。但其抗脑损伤的具体机制尚未完全清楚～有动物实验显示清开灵可影响脑内乙酰胆碱酯酶活性和谷氨酸含量,11,～提示清开灵的作用机制可能与脑内中枢神经递质有关。本实验结果显示～清开灵它能明显减少脑组织IL-6的分泌～能抑制新生大鼠HIBD结扎侧脑皮质fas-L蛋白的高表达～对缺氧缺血脑损伤有重要康复作用。 参考文献: ,1,  金汉珍～黄德珉～官希吉.实用新生儿学～第2版,M,.北京:人民卫生出版社～2000:624. , 2,  刘  敬～秦振庭.新生儿缺氧缺血性脑病的免疫学机制,J,.国外医学儿科学分册～2001～28,4,:175. ,3,  Yu AC, Lan LT. 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