电喷雾质谱法测定牛血清白蛋白相对分子质量及测定结果的不确定度评估_cropped

电喷雾质谱法测定牛血清白蛋白相对分子质量及测定结果的不确定度评估_cropped 电喷雾质谱法测定牛血清白蛋白相对分子质量 及测定结果的不确定度评估 武利庆王 晶 ()中国计量科学研究院 ,北京 100013 摘要 对直接流动注射电喷雾质谱法和 LC - M S联用电喷雾质谱法测定牛血清白蛋白相对分子质量的测定结 果进行比对 ,并评估了测定结果的不确定度 。直接流动注射法和 LC - M S联用法测定牛血清白蛋白相对分子质量的 扩展不确定度分别为 20. 8和 12. 0, LC - M S联用电喷雾质谱法具有较小的 A 类不确定度并且测定结果的中心值与 理论值更为接近 。两种方法均可以用于相对分子质量在 10 000,80 000蛋白质的相对分子质量的测定 。 关键词 电喷雾 质谱 蛋白质 相对分子质量 不确定度 相对分子质量是蛋白质的基本参数 ,当发现或A lfa A e sa r公司 。国 鉴定一种蛋白质时 ,首先要测定蛋白质的相对分子 实验用水 : 超纯水 ,经 M illipo re 纯水系统纯化 ,质量 。常规的蛋白质相对分子质量测定方法主要有 Ω 电导率达到 18. 2 M. cm; 渗透压法 、光散射法 、超速离心法以及聚丙烯酰胺凝 1. 2 牛血清白蛋白样品溶液的配制 [ 1 ] 胶电泳法等 , 这些方 法存 在样 品消 耗 量大 , 精 确 用 0. 1 %甲酸溶液将经过脱盐的牛血清白蛋白 - 6 度低 、易受蛋白质形状影响等缺点 。随着质谱技术 () 配成 0. 2 m g /mL 约 3 ×10 mo l /L 的溶液用于流 的飞速发展 ,电喷雾 、基体辅助激光解吸 - 飞行时间动注射分析 。用于 LC - M S分析的牛血清白蛋白样 等蛋白质相对分子质量质谱测定技术因具有极高的 品中不含有甲酸 ,直接用超纯水配制 。 灵敏度和精确度而在生物 、医学等领域得到了广泛 1. 3 质谱条件 ( ) 的应用 。电喷雾质谱 ES I - M S是 20 世纪 80 年代( ) 1 流动注射分析的质谱条件[ 2 , 3 ] 末发展起来的一种“软 ”电离质谱技术 ,它不仅 喷雾电压 : 4. 5 kV; 鞘气压力 : 138 kPa; 辅助气 可以测定各种亲水性 、疏水性及糖蛋白的相对分子 流速 : 1. 7 L /m in;毛细管温度 : 350 ?; 扫描范围 : 500 质量 ,也可以直接测定蛋白质混合物的相对分子质 ,2 000;正离子模式检测 。 量 。笔者探讨了直接流动注射和 LC - M S联用电喷 ( ) 2 LC - M S联用分析的质谱条件 鞘气压力 :雾质谱不同测定模式对蛋白质相对分子质量测定结 345 kPa;辅助气流速 : 3. 3 L /m in, 其它条件与流动 果的影响 ,并评估了测定结果的不确定度 。 注射分析时的条件相同 。 1 实验部分 1. 4 色谱条件 1. 1 主要仪器与试剂μ每次进样 10 L ,采用 A glien t 300 SB - C液相 18 液 相 色 谱 质 谱 联 用 仪 : The rmo -F inn igan L TQ (色谱柱进行梯度洗脱 ,在 5. 5 m in内水 - 乙腈 体积 型 ,美国热电公司 ;) 比为 80 ?20 , 分别含有 0. 1 %的甲酸 变成 100 %的 公司 ;IKA 漩涡混合器 : M S2 型 ,德国 () 乙腈 含有 0. 1 %的甲酸 ,流速 0. 4 mL /m in保持 25 移液器 :法国 Gilson公司 ;m in,柱温控制在 25. 0 ?。 Sa to riu s 天平 : M E235 S型 , 感 量 0. 01 m g, 德 国 1. 5 质谱仪质量轴的校准 公司 ;按 The rmo - F inn igan L TQ 仪器说明书配制含有 乙腈 :色谱纯 ,德国 M e rck公司 ;咖啡因 、MR FA 四肽和 U ltram a rk 1621的质量轴校准 甲酸 :分析纯 ,北京化学试剂公司 ; 液并完成质量轴的校准 。 牛血清白蛋白 :北京拜尔迪生物技术有限公司 ; 1. 6 牛血清白蛋白相对分子质量测定 咖啡因 :分析纯 ,美国 Sigm a - A ld rich公司 ;( ) 1 流动注射测定 MR FA 四 肽 : 纯 度 为 98. 5 % 。美 国 R e sea rchμ 用 250 L 微量注射器吸取蛋白质样品 ,设定流 P lu s, INC公司 ; U ltram a rk 1621: 质谱专用 ,分子量为 2 120。美收稿日期 : 2006 210 214 μ11 m in,将多电荷的质谱图去卷蛋白的出峰时间为 速 5 L /m in,按 1. 3 质谱条件采集质谱信号 , 采集 时间 2 m in。积以后可以得到蛋白质的相对分子质量 。 5 次重复 ( ) 2 LC - M S测定样品测定结果列于 2。 按 1. 3和 1. 4 中的质谱条件和色谱条件采集总 离子流信息 。 1. 7 蛋白质样品相对分子质量解析 由流动注射或 LC - M S分析得到的多电荷谱图 经 P roM a ss软件去卷积后得到样品相对分子质量信 息 。 2 结果与讨论 2. 1 直接流动注射分析结果 将 2 m in内采集到的质谱信号进行平均 ,得到 牛血清白蛋白的多电荷谱图 ,如图 1所示 。 a—液相色谱图 ; b—质谱图 图 2 LC - M S联用测定牛血清白蛋白相对分子质量的谱图 表 2 牛血清白蛋白相对分子质量 LC - M S联用测定结果 测定值平均值变异系数 图 1 流动注射后形成的牛血清白蛋白多电荷谱图 66 441. 7 66 439. 2 66 441. 5 66 440. 2 0. 002 % 经 P rom a ss软件去卷积处理后可求得样品中牛 66 440. 2 66 438. 5 血清白蛋白的相对分子质量 。 5 次重复测定结果列 比较直接流动注射和 LC - M S联用 5 次测定蛋 于表 1。 白质相对分子质量的变异系数可以看出 LC - M S方 表 1 牛血清白蛋白相对分子质量流动注射测定结果法具有更低的变异系数 ,这主要是因为在直接流动 测定值平均值变异系数 注射分析时样品中残留的缓冲盐以及少量的多肽等 66 474. 7 66 472. 0 66 499. 2 66 472. 7 0. 03 % 66 472. 5 66 445. 3 杂质可能与牛血清白蛋白形成加合物 ,从而使得牛 血清白蛋白的相对分子质量发生改变 ;而在使用 LC 2. 2 LC - M S联用分析结果 - M S联用测定蛋白质相对分子质量时由于经过了 ( ) 1 鞘气压力对质谱信号的影响 色谱柱的充分分离和脱盐 ,杂质对相对分子质量测 在使用 LC - M S方法测定蛋白质相对分子质量 定的影响也就大大降低了 。所以使用 LC - M S测定 时 ,由于流动相的流速较高并且没有分流 ,鞘气的压 牛血清白蛋白相对分子质量在精密度方面优于直接 力直接影响雾化程度和电喷雾离子化的效率 ,进而 流动注射分析法 。经过检索数据库 ,根据牛血清白 影响质谱信号的强度和分辨率 。为了得到较好的电 蛋白的氨基酸序列计算出牛血清白蛋白的理论单同 喷雾信号 ,首先考察鞘气压力对去卷积后质谱信号 位素相对分子质量为 66 389. 9 ,以此作为衡量方法 强度的影响 ,由鞘气压力对质谱信号强度曲线可知 , 准确度的依据 ,计算出直接流动注射分析法和 LC - 随着鞘气压力的增加 ,质谱信号的强度也随之增大 , M S法测定牛血清白蛋白相对分子质量的相对误差 当鞘气压力达到 345 kPa 后随鞘气流速的增加 , 信 分别为 0. 1 %和 0. 08 % ,由此可见 LC - M S测定牛 号强度增加变得缓慢 ,说明当鞘气压力达到 345 kPa 时 ,样品已经基本完全雾化和离子化 ,所以鞘气压力 血清白蛋白相对分子质量的准 确度 优 于流 动注 射 选择为 345 kPa。 法 。 ( ) 2 LC - M S谱图2. 3 相对分子质量测定结果的不确定度评定 图 2为 LC - M S联用测定牛血清白蛋白的相对 2. 3. 1 A 类不确定度评定 相对分子质量测定结果分子质量的谱图 。在 1. 4 的色谱条件下 ,牛血清白 的不确定度包括 A 类 [ 4 ] () 不确定度和 B 类不确定度 , A 类不确定度通过实 M + n / n ,可以推出 : [ 5 ] () ( ) ( )( ) 验结果统计的偏差进行表征 , 1 、2 式分 3 M = n ×m / z- n 式中 : m / z———是多电荷离子的质荷比 ;别为流动注射模式和液质联用模式 A 类不确定度 M ———蛋白质的相对分子质量 ;计算公式 : n ———多电荷离子所带的电荷数 。 由质荷比. 1 19( )u8. 55 = = 1 A , FL5 不确定度引入的相对分子质量测定不 1. 4 确定度可以表示为 :( )= 0. 63 2 u= A , LC - M S 5 5Mu = u ′ M M ()5 m / z2. 3. 2 B 类不确定度评定 在实验条件下 ,牛血清白蛋白平均带有 50个电 ( )1 仪器常数引起的质荷比测定不确定度 , 它 荷 ,由此可以计算得到 :表示仪器对同一离子质荷比测定的偏差范围 ,根据 u= 50 ×0. 12 = 6. 0 M , FLL TQ 对 MR FA 多肽相对分子质量测定的重复性 ,该 u= 50 ×0. 12 = 6. 0 M , LC - M S 值估计在 ?0. 2 , 按矩形分布 计 算标 准不 确 定度 为 ( )3 由溶液浓度 、温度 、湿度等引入的测量不确 0. 2 / 3 = 0. 12。 定度忽略不计 。 ( )2 校准物相对分子质量的不确定度 在质量轴 ( ) 4 合成不确定度的校准过程中 ,使用了咖啡因 、MR FA 2 2 四肽和 U ltram a rk 1621 三种 质量 轴校 准 品 , 以咖 啡 = 8. 55 + 6. 0 = 10. 4 uFL 2 2 因为例 ,化学式为 CHNO,各元素最大丰度同位 8 10 4 2 u=0. 63 + 6. 0 = 6. 0 LC - M S 素的原子量及不确定度分别为 : 取包含因子 k = 2 ,则扩展不确定度 : 12 )( C: 12 定义值 U = 10. 4 ×2 = 20. 8 FL 1 H: 1. 007 825 031 9 ?0. 000 000 000 6= 6. 0 ×2 = 12. 0U LC - M S 16 O: 15. 994 914 622 3 ?0. 000 000 002 5因此直接流动注射和 LC - M S联用电喷雾质谱 14 N: 14. 003 074 007 4 ?0. 000 000 001 8法测定牛血清白蛋白相对分子质量的结果可以分别 所以咖啡因相对分子质量的不确定度为 :表示为 : 66 472. 7 ?20. 8和 66 440. 2 ?12. 0。 2 2 2 3 结语() ( ) ()10× u/ 3 + 4 ×u/ 3 + 2 ×u/ 3 u=H N O caffe in 直接流动注射和 LC - M S联用电喷雾质谱方法 - 10 2 - 9 2 - 9 2() () () 10 ×6 × 1 0/ 3 + 4 ×2. 5× 1 0/ 3 + 2× 1. 8× 1 0/ 3 = 都可以用来测定牛血清白蛋白的相对分子质量 。但 - 9=6. 3× 1 0 LC - M S联用电喷雾质谱法与直接流动注射电喷雾 同理可以计算出 MR FA 四肽相对分子质量的质谱法相比具有较小的 A 类不确定度 ,测定结果的 - 8 不确定度为= 8. 8 ×10 , U ltram a rk 1621 没有 uM R FA 中心值与理论值更为接近 ,是一种更好的蛋白质相 提供结构式 ,因此其相对分子质量的不确定度估计 对分子质量测定方法 。该方法可以用于相对分子质- 7 为。所以校准品相对分子质量u= 1. 0 ×10 U ltram a rk 量在 10 000 ,80 000蛋白质相对分子质量的测定 。 的总不确定度为 : 参 考 文 献 2 2 2 () [ 1 ] 王镜岩 , 朱圣庚 , 徐长法. 生物化学 [ M ]. 第 3 版 上冊 . 北 u=u+ u + u Ca lib ra to r caffe in M R FA U ltram a rk京 : 高等教育出版社 , 2005. - 9 2 - 8 2 - 7 2( ) ) ) ((6. 3 ×10 + 8. 8 ×10 + 1. 0 ×10 = Ka tta V , Cha it B T. O b se rvation of the hem e - glob in comp lex in [ 2 ] - 7na tive m yoglob in by e lec tro sp ray - ion iza tion m a ss sp ec trom etry = 1. 3 ×10 [ J ]. J Chem Soc, 1991 , 113: 8 534 - 8 537. 校准物相对分子质量的不确定度远远超出了质 杨芃原 ,钱小红 ,盛龙生 ,等. 生物质谱技术与方法 [ M ]. 北京 : [ 3 ] 谱仪的质量分辨能力 ,可以忽略不计 。 科学出版社 , 2002. 由校准品相对分子质量不确定度和仪器常数引 中国实验室国家认可委员会. 化学分析中不确定度的评估指 [ 4 ] 南 [M ]. 北京 :中国计量出版社 , 2002. 入的质荷比测定不确定度合成后的总不确定度为 : 倪育才. 实用测量不确定度评定 [ M ]. 北京 : 中国计量出版社 , - 7 2 2 ( 1. 3 ×10 ) + 0. 12 = 0. 12u ′= [ 5 ] M 2004. ()由蛋白质相对分子质量的基本计算公式 m / z =下转第 25 页 泡时红茶和绿茶茶水中铜的浸出率仅为 2. 97 %和 4. 86 % , 而 在 100 ?冲 泡 时 铜 的 浸 出 率 达 到 了 13. 62 %和 17. 91 % 。红 茶和 绿 茶茶 水中 锌 的含 量 也是随温度的升高而增大 。铅 、铜 、锌 3 种重金属元 素在各个温度下的浸出率由大到小的顺序为铅 、铜 、 锌 。 2. 5 浸泡时间对重金属元素浸出率的影响 不同浸 泡时 间 下铅 、铜 、锌 的浸 出率 如 图 2 所 示 ,红茶和绿茶两种茶水中铅 、铜元素的含量 30 m in 前上升快 ,但 30 m in 后曲线趋于平缓 ,锌元素浸泡图 2 不同浸泡时间下铅 、铜 、锌的浸出率 [ 4 ] 10 m in后浸出率基本不变 。素的限量标准分别为 50、1 000、1 000 ng /mL, 因 3 结论此 ,茶水中的铅 、铜 、锌含量远远低于我国饮用水标 ( )1 在常规的泡茶条件下 , 茶叶中铅 、铜 、锌的 准 ,符合饮用水标准的要求 。 浸出率随浸泡次数的增多而减少 , 30 m in前随浸泡 参 考 文 献 [ 1 ] 丁航. 茶叶中微量元素的溶出规律 [ J ]. 广东微量元素科学 , 时间的延长而增大 。 ( ) 2003 , 10 5 : 56 - 57. ( )2 以人们通常的饮茶习惯 ,采用沸水冲泡茶 罗晓薇. 火焰原子吸收光谱法测定茶叶中铅铜 [ J ]. 现代仪器 , [ 2 ] 叶 ,冲泡时间为 10 m in,则茶水中铅 、铜 、锌的含量分 ( ) 2004 , 10 3 : 30 - 32. GB 2762 - 2005 食品中污染物限量 [ S ]. 别为 6. 8、36. 8、20. 8 ng /mL 左右 。我国生活饮用水 [ 3 ] GB 5749 - 1985 生活饮用水卫生标准 [ S ].卫生标准 GB 5749 - 1985 规定铅 、铜 、锌 3种金属元 [ 4 ] EXTRAC T IO N RA TE O F HEA VY M ETAL EL EM ENT IN TEA Xu J ie, Ye Zh ixiang, Zhang L i, Yang Yingchun, X iao Ying ()D ep a rtm en t of Environm en t Techno logy, Chengdu U n ive rsity of Info rm a tion Techno logy, ChengD u 610225 , Ch ina A BSTRAC T The con ten ts of lead, copp e r, zinc in the b lack tea and green tea we re de te rm ined by flam e a tom ic ab so rp tion sp ec trom e try. The extrac tion ra te of tea wa s stud ied by changing the d ip degree, d ip tim e and d ip temp e ra tu re. The re su lt showed tha t ( ) the extrac tion ra te of Pb, Cu, Zn in tea wa s inc rea sed w ith d ip temp e ra tu re and d ip tim e befo re 30 m in, and dec rea sed w ith d ip de2 gree. KEYW O RD S flam e a tom ic ab so rp tion sp ec trom e try, tea, heavy m e ta l e lem en t, extrac tion ra te ()上接第 22 页 D ETERM INA T IO N O F BO V INE SERUM AL BUM IN REL A T IVE M OL EC UL A R M A SS BY EL EC 2 TRO SPRAY M A SS SPEC TROM ETRY A ND EVAL UT IO N O F UNC ERTA INTY O F M EA SUREM ENT W u L iq ing, W ang J ing ()N a tiona l In stitu te of M e tro logy, P. R. , B e ijing 100013 , Ch ina A BSTRAC T The mo lecu la r we igh t of bovine se rum a lbum in wa s m ea su red by bo th d irec t in jec tion e lec tro sp ray M S m e thod and LC - M S m e thod. The unce rta in ty of the re su lt wa s eva lua ted in de ta il. It showed tha t the exp and unce rta in ty of the re su lt by d irec t in2 jec tion m e thod and LC - M S m e thod we r 20. 8 and 12. 0 re sp ec tive ly. The re su lt of LC - M S m e thod showed sm a lle r typ e A unce rta in ty and wa s m uch nea re r the theo re tica l mo lecu la r we igh t comp a red w ith tha t by d irec t in jec tion m e thod. Bo th m e thod s can be app lied in re la tive mo lecu la r m a ss de te rm ina tion of p ro te in ranged from 10 000 - 80 000. KEYW O RD S e lec tro sp ray, m a ss sp ec trom e try, p ro te in, re la tive mo lecu la r m a ss, unce rta in ty ,围绕海洋及相邻陆区的海洋战略需求与学科发展前沿趋势 ()海洋地质国家重点实验室 同济大学 顺利通过验收 环境演变与海底资源的总目标 ,通过研究方向 、学术目标和 科技部基础研究司组织以秦蕴珊院士为组长的专家组 研究重点的进一步凝练 ,形成了“古海洋学与古环境研究 ”、 在同济大学对海洋地质国家重点实验室的建设进行了验收 。 “大陆边缘演化与海洋沉积学研究 ”、“海底资源研究 ”、“深海洋地质国家重点实验室是科技部 2005 年 3 月正式批 ()海生物地球化学研究 ”等四个研究方向 。 志 准立项建设的 22个国家重点实验室之一 。实验室根据国家