大口径毛细管气相色谱法快速测定MRS肉汤培养基中水溶性胆固醇

大口径毛细管气相色谱法快速测定MRS肉汤培养基中水溶性胆固醇 大口径毛细管气相色谱法快速测定MRS肉 汤培养基中水溶性胆固醇 第39卷 2011年6月 分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 第6期 894,897 DOI:10.3724/SP.J.1096.20l1.00894 大口径毛细管气相色谱法快速测定 MRS肉汤培养基中水溶性胆固醇 郭春锋张兰威李婧妍张英春易华西杜明韩雪 (哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,哈尔滨150090) 摘要建立了MRS肉汤培养基中水溶性胆固醇的气相色谱测定法.1mL样品(含水溶性胆固醇的MRS 然后于60?水浴皂化30min.肉汤培养基)与5mL0.5mol/LKOH一甲醇溶液混合, 产物游离胆固醇经5mL 甲苯萃取后,采用HP-5大口径石英毛细管柱(30m×0.53mmi.d.×1.5?m)进行分离,FID检测器进行检测,外 标法进行定量分析.本方法分析一个样品仅需45min;在5,250mg/L浓度范围内线性关系良好;回收率为 95.6%,98.0%;日内与日间相对偏差分别为1.6%和1.9%.本方法具有快速,简便,准确等优点. 关键词大口径毛细管;气相色谱;水溶性胆固醇;MRS肉汤培养基 1引言 水溶性胆固醇是一类由人工合成的化学物质,在自然界中并不存在.Proksch等于1978年首次报 道了以胆固醇,二元酸和聚乙二醇为原料合成水溶性胆固醇的工艺路线.水溶性胆固醇最初被用于质 控血清中的胆固醇源,后来其应用范围逐渐扩展.在微生物学领域,水溶性胆固醇主要用于研究乳酸菌 体外对培养基中胆固醇的脱除作用B.由于胆固醇本身不溶于水,因此在添加到培养基之前必须进行 乳化处理,以使其在水相中能稳定存在.而水溶性胆固醇在水中则具有高达60g/L的溶解度,无需乳 化便可直接添加到培养基中,因而被广泛应用. 为了模拟肠道环境,培养基中水溶性胆固醇的添加量通常为100mg/L左右】.不同乳酸菌对培养 基中水溶性胆固醇的脱除能力有很大差别.某些乳酸菌对培养基中水溶性胆固醇的脱除能力可高达 80%[6_.这表明当培养结束后,培养基上清液中的水溶性胆固醇的浓度可降低至20mg/L左右.硫酸一邻 苯二甲醛比色法是目前唯一能够对如此低含量胆固醇进行检测的比色法,因而被广泛应用】.然而, 该方法偶尔会出现原因不明的实验结果不可重复的现象1.因此,有必要开发一种稳定性更好的检测 方法.本研究对气相色谱测定培养基中水溶性胆固醇的方法进行了研究,获得了较满意的结果. 2实验部分 2.1仪器与试剂 7890A型气相色谱仪配FID检测器(美国安捷伦公司);5型石英毛细管柱(30m×0.53rnlni.d.× 1.5ktm,美国安捷伦公司);DK-98-1型数显恒温水 浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司). 胆固醇标准品(纯度99.5%),水溶性胆固醇 (纯度20%(以游离胆固醇计),分子结构见图1) 及牛胆盐(牛胆汁冻干粉)购自美国Sigma化学品 公司;MRS肉汤(deMan-rogosa-sharpe)培养基购自 英国Oxoid公司,MRS肉汤培养基的配方为:蛋白 c rc 7 cc 图1水溶性胆固醇的分子结构 Fig.1Molecularsncnlreofwater-solublecholesterol 胨10g/L,牛肉粉8g/L,酵母浸粉4g/L,葡萄糖20g/L,K2HPO42g/L,三水醋酸钠5g/L,柠檬酸三铵2g/L, 七水硫酸镁0.2g/L,四水硫酸锰0.05g/L,吐温801mL/L. 2010-08—03收稿;201卜叭一17接受 本文系国家高技术研究发展计划(No2007AAZ354)及国家科技支撑计划"十一五"奶业重大专项(No.2006BAD04A09)资助 E—mail:lanweizhang@yahoo.com.cn 第6期郭春锋等:大口径毛细管气相色谱法快速测定MRS肉汤培养基中水溶性胆固醇895 2.2实验方法 2.2.1含水溶性胆固醇的MRS肉汤培养基的制备参照文献[5]的方法配制.将水溶性胆固醇原始 样品用蒸馏水稀释至10g/L,然后将该稀释液以1%(V/V)的添加量加至含0.3%(m/V)牛胆盐的MRS 肉汤培养基中,漩涡混匀,即制备成含100mg/L水溶性胆固醇的MRS肉汤培养基. 2.2.2样品前处理条件优化采用L(4)正交设计对前处理过程中的5个潜在的影响因素进行优 化.正交设计的因素水平表如表1所示. 表1因素水平表 TableIFactorsandlevelsforLl6(4)orthogonaldesign 1mL样品与5mL皂化溶液分别添加到玻璃螺口试管内,漩涡混匀,然后依照正交表的条件进行皂 化.皂化结束后,用自来水将试管内液体冷却至室温,然后加入适量萃取剂,漩涡混合60s,3000×g离 心5min.吸取1mL上层有机相,用氮气吹干,用1mL正己烷将其重新溶解,然后进行色谱分析.最 终结果以每微升培养基中所含游离胆固醇的峰面积表示.每组实验重复一次. 2.2.3色谱分析条件氢气作载气,恒流12mL/min;不分流进样模式,不分流时间1min,进样量 1.0gL;检测器为FID;温度300?;空气400mL/min,氢气40mL/min;补充气为氮气,流速20mL/min;程序 升温条件:起始温度160?,以40?/min升至280?,并保持7min;采用峰面积外标法进行定量分析. 3结果与讨论 3.1前处理条件优化 水溶性胆固醇无法气化,并且水溶性胆固醇在目前色谱柱能够耐受的温度范围内, 的分子量也不 恒定,因而无法直接采用气相色谱法对其进行定量分析.然而,水溶性胆固醇是一种酯化形式的胆固 醇,其经皂化处理后可转变成游离胆固醇,后者便可以直接利用气相色谱法进行检测.因此,皂化是影 响水溶性胆固醇气相色谱法测定的关键步骤.目前,常用的皂化试剂主要有KOH-甲醇溶液和KOH- 乙醇溶液叫;皂化时间从15min到60min不等;皂化温度在50,80?变化.皂化完成后,产物游离胆 固醇必须经有机溶剂萃取后才能进行气相色谱分析.因此,培养基中水溶性胆固醇的皂化产物游离胆 固醇的萃取同样是影响实验结果的重要步骤.常用的萃取剂主要有甲苯,乙醚,石油醚和正己烷等,而 萃取剂与液相的比例通常低于2:1. 通过正交实验对上述潜在影响样品前处理的因素进行了分析.结果表明,在所设定的水平范围内, 5个因素均会对结果产生显着影响(P<0.05);极差分析和方差分析的结果均显示各因素对实验结果的 影响顺序为萃取剂类型>皂化试剂类型>萃取剂体积>皂化温度>皂化时间;最优条件为:皂化溶液 O.5mol/LKOH一甲醇溶液,皂化温度60?,皂化时间30min,萃取剂为5mL甲苯.此外,样品与皂化溶 液的体积比也可能是影响实验结果的潜在因素.本研究未将该因素纳入正交设计,而是直接将其固定 在l:5,这是因为文献【11,12]显示,将样品和皂化溶液的体积比控制在1:5可获得最高的回收率. 3.2色谱分离 采用上述正交实验确定的最优条件对胆固醇标准品及样品分别进行了测定.从图2可见,即使在 不分流的情况下,胆固醇的峰形依然良好,无拖尾现象,而且分析速度较快,胆固醇的保留时间仅为 896分析化学第39卷 7.6min,并能和培养基中的其它可萃取成分达到有效分离. 胆固醇为高沸点有机物.在耐高温毛细管柱未出现时,研究者通常将胆固醇进行衍生处理,以降低 其沸点,然后再进行色谱分析.本研究采用的HP-5石英毛细管柱可耐受300?的高温,这使得直接 对胆固醇这种高沸点有机物进行气相色谱分析成为可能.通常采用内径为0.32mm的常规毛细管柱对 食品或生物样品中的胆固醇进行定量分析,本研究采用内径为0.53mm的大口径毛细管柱.大口径毛 细管柱和常规曰径毛细管柱相比,具有较高的柱容量.此特性可以不分流进样.而 不分流进样则是提 高气相色谱法检测灵敏度的最直接,也是最有效的措施. l 0l23456789l00I2345678910 t/mint/min 图2标准品和样品色谱图 Fig.2Chromatogramsofstandardandsample a.胆固醇标准品(Standardsample,cholestero1);b.样品(含水溶性胆固醇的MRS肉汤培养基)(Sample (MRSbrothcontainingwater-solublecholestero1);I.溶剂(Solvent):甲苯(Toluene);2.胆固醇(Cholestero1). 3.3线性范围及检出限 分别吸取浓度为1,2.5,5,10,25和50mg/L的胆固醇标准溶液,按照3.1节确定的最优条件进行 前处理,然后进行色谱分析.结果表明,在l,50mg/L浓度范围内,胆固醇标准溶液进样浓度(x)与其 峰面积(y)呈良好线性关系.其线性方程为y一23.45X一4.64,相关系数R一0.9998.将标准溶液进样浓 度折算成样品进样浓度,则在5,250mg/L浓度范围内,胆固醇进样浓度(x)与其峰面积(y)之间的线 性关系为y一4.69X,4.64. 根据信噪比S/N=3计算得胆固醇检出限为0.12mg/L.将胆固醇标准溶液浓度折算成样品浓度. 则样品中水溶性胆固醇的检出限为0.6mg/L(以游离胆固醇计). 3.4方法的精密度及标准加入回收率 3.4.1精密度将2.2.1节制备的样品用含0.3%(m/V)牛胆盐的MRS肉汤培养基稀释5倍,然后用该 混合物进行准确度及精密度实验.取18份上述样品,每天测定6份,连续测定3d.基于方差分析求取 日间标准偏差,日内标准偏差及总的标准偏差.结果表明,本方法具有较高的精密度.日内与日间相对 标准偏差分别为1.6%和1.9%. 3.4.2准确加入的回收率采用加样回收法测定方法的准确度.取l2份上述样品,分成4组,每组 3份,分别向每组样品中添加0,20,50和80mg/L胆固醇,然后进行色谱分析.样品中胆固醇测量值为 22.9mg/L.胆固醇添加浓度为20,5O和80mg/L的回收率(一3)分别为98.O%,95.6%和96-2%. References 1ProkschGJ,BondermanDP.Clin.ChelT1.,1978,24(11):1924,1926 2ZhangM,HangX,FanX,LiD,YangH.%r.Microbio1.Biotechno1.,2008,24(1):7,14 3SirilunS,ChaiyasutC,KantachoteD,LuxananilP.A.J.Microbio1.Res.,2010,4(10):994,1000 4LiongMT,ShahNP.Int.Dairy-r.,2005,15(4):391,398 5PereiraDIA,GibsonGR.APp1.Environ.Microbio1.,2002,68(9):4689,4693 6MatharaJM,SchillingerU,GuigasC,FranzC,KutimaPM,MbuguaSK,ShinHK,Holzapfe lWH.Int.J FoodMicrobio1.,2008,126(1—2):57,64 第6期郭春锋等:大口径毛细管气相色谱法快速测定MRS肉汤培养基中水溶性胆固醇897 7ZhangM,HangXM,FanXB,LiDT,YangH.WorldJ.Microbio1.Biotechno1.,2008,24(1): 7,14 8RudelLL,MorrisMD.J.LipidRes.,1973,14(3):364,366 9FletourisDJ,BotsoglouNA,PsomasIE,MantisAI.J.DairySci.,1998,81(11):2833,2840 10DinhTTN,BlantonJR,BrooksJC,MillerMF,ThompsonLD.J.FoodCompos.Ana1.,200 8,21(4) 306,314 11VanelswykME,SchakeLS,HargisPS.PoultrySci.,1991,70(5):1258~1260 12IndykHE.Analyst.,1990,115(12):1525,1530 13DerksH,VanheiningenA,KoedamHC.Clin.Chem.,1985,31(5):691,694 RapidDeterminationofWater'SolubleCholesterolinMRSBrothby Wide—BoreCapillaryGasChromatography GUOChun—Feng,ZHANGLan-Wei,LIJing—Yan,ZHANGYing—Chun,YIHua— Xi,DUMing,HANXue (SchoolofFoodScienceandEngineering,HarbinInstituteofTechnology,Harbin15O09O) AbstractAmethodforwater—solublecholesterolquantificationindeMan—Rogosa— Sharpe(MRS) brothbasedoncapillarygaschromatographywasdeveloped.Samples(1mI)weresaponified in cappedtubeswith5mLmethanolicKOHsolution(O.5mol/L)byheatingfor30minat6O?.T he product(cholestero1)wasextractedwithtoluene,anddirectlyanalyzedbygaschromatograp hy.The analysiswascarriedoutusingawide—borecolumnHP一5(30m×0.53mmi.d.× 1.5lam),FIDdetec— torandexternalstandardmethodforquantification.Withthismethod.asinglesamplecouldb e analyzedin45rain.Thelinearitywasexcellentfortheconcentrationrangeof5— 250mg/L.The recoveryandoverallrelativestandarddeviation(RSD)were95.6一 98.0and1.6%,respectively. Thismethodisrapid,simpleandaccurate. KeywordsWide—borecapillary;Gaschromatography;Water— solublecholesterol;deMan—Rogosa— Sharpe(MRS)broth (Received3August2010;accepted17January2O11) +—+_量+—+—j+—+—+—+—q+— 《工厂化验员速查手册》(第二版) +—+—+_{ 该手册简明扼要地汇集了工矿企业中化学分析常用有关检测技术图表及基本知识.全手册分为十二章:常用 玻璃仪器及其他器皿和用品,天平,计量单位与常用理化数据,常见化学物质的物理,化学特性,水,试剂及溶液,标准,检 测标准,标准物质和标准样品,取样规则和样品的分解,化学分析方法,分离和富集,误差,数据处理和常用计算公式,仪 器分析方法,化验室安全知识.该手册深受工厂化验室及有关的技术人员和化验员欢迎.新版又有新的补充与修订. 该书(ISBN978—7—122—06758—6)由化学工业出版社出版,李启华,余锦,宋祥江,陈毅芳编着,定价38.0元.