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重组人肝脏胶原样凝集素1在中国仓鼠卵巢细胞内定位

2017-12-26 6页 doc 20KB 23阅读

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重组人肝脏胶原样凝集素1在中国仓鼠卵巢细胞内定位重组人肝脏胶原样凝集素1在中国仓鼠卵巢细胞内定位 重组人肝脏胶原样凝集素1在中国仓鼠卵巢细胞内定位 作者: 李付广, 杨桂枝, 王芳, 杜英【摘要】 目的: 使用已构建的真核表达载体pEGFP CLL1转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞, 探讨CL L1在CHO细胞内的定位。方法: 使用免疫荧光标记技术和Western blot检测EGFP CLL1融合蛋白在细胞内的表达部位。结果: 融合蛋白主要存在于细胞质基质中, 不存在于内质网、 高尔基体和细胞核等部位。结论: CL L1为已发现惟一存在于细胞质基质中的胶原样凝集...
重组人肝脏胶原样凝集素1在中国仓鼠卵巢细胞内定位
重组人肝脏胶原样凝集素1在中国仓鼠卵巢细胞内定位 重组人肝脏胶原样凝集素1在中国仓鼠卵巢细胞内定位 作者: 李付广, 杨桂枝, 王芳, 杜英【摘要】 目的: 使用已构建的真核表达载体pEGFP CLL1转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞, 探讨CL L1在CHO细胞内的定位。: 使用免疫荧光标记技术和Western blot检测EGFP CLL1融合蛋白在细胞内的表达部位。结果: 融合蛋白主要存在于细胞质基质中, 不存在于内质网、 高尔基体和细胞核等部位。结论: CL L1为已发现惟一存在于细胞质基质中的胶原样凝集素成员。 【关键词】 肝脏胶原样凝集素1 蛋白定位 绿色荧光蛋白 高尔基体 内质网 人肝脏胶原样凝集素1(collectin liver 1, CL L1)是Ohtani等克隆和鉴定出的一个胶原样凝集素家族的新成员[1], 编码基因位于8q23 q24.1, 由6个外显子和5个内含子组成, 其cDNA中含有831 bp编码片段, 可编码277个氨基酸序列, 推测该序列具有典型的胶原样凝集素特点, 由N端富含半胱氨酸区、 胶原样区、 颈区和糖识别区(carbohydrate recognition domain, CRD)组成。其他胶原样凝集素成员多数为分泌蛋白, 存在于血液和组织液中, 是固有免疫的重要分子, 它们通过激活补体, 凝集病原微生物, 抑制病原生长, 调理和激活吞噬作用等参与机体的免疫防御反应[2, 3]。但对CL L1的在人体组织分布和细胞内定位及其功能了解较少。我们尝试利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞真核表达系统表达重组人CL L1, 并检测该蛋白在细胞内的定位。 1 材料和方法 1.1 材料 pEGFP C1载体购自Clontech公司; CHO K1细胞系购自ATCC; 大肠杆菌DH5α为本室保存。工具酶均购自宝生物公司(大连); HAM/F12培养液购自Hyclone公司; 胎牛血清购自天津市TBD生物技术发展中心; 多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)、 聚乙烯亚胺 (polyethylenimine, PEI)购自Promega公司; ER Tracker Blue White DPX和BODIPY TR C5 Ceramide购自Molecular Probes公司; ECL plus Western blot检测试剂购自Amersham Biosciences公司。 1.2 方法 1.2.1 真核表达载体pEGFP CLL1的构建 使用本室已构建好的含有人全长CL L1 cDNA的真核表达载体pEGFP CLL1, 通过酶切鉴定和序列分析, 表明插入目的片段DNA序列与读码框完全正确。 1.2.2 细胞培养和转染步骤 将CHO K1细胞按1?4转种于直径35 mm的玻璃底Petri平皿(MatTek)内, 完全生长培养液为含2 mmol/L L 谷氨酰胺、 100 mL/L胎牛血清(FCS)和 1.5g/L碳酸氢钠的Ham’s F12K培养液, 放置37?含50mL/L CO2的饱和湿度空气中孵育。把1 μg质粒DNA溶于100 μL不含血清的Ham’s F12K培养液, 加入适量PEI振荡混均, 室温孵育20 min, 形成PEI/DNA复合物(polyplex); 再加入完全生长培养液至终体积1000 μL混均; 当CHO K1细胞贴壁生长70%形成单层细胞, 将培养皿中培养液吸出, 用PBS冲洗2次, 将含有转染复合物的1000 μL培养液一滴 一滴地加入培养‎‎皿, 边加边摇动。细胞培养6 h后, 去除转染液, 换完全培养液继续培养42 h, 荧光染色。 1.2.3 荧光标记方法 用内质网特异性荧光染料ER Tracker Blue White DPX, 对转染后的细胞染色, 探针的染色步骤按照试剂说明书进行: 将1 mmol/L ER Tracker Blue White DPX储备液稀释至0.5 μmol/L的工作液, 在玻璃底Petri平皿的中间凹槽中加入100 μL含0.5 μmol/L的染料的无血清培养液, 37?放置30 min, 用无探针的培养液替代染液。特异显示高尔基体红色荧光探针BODIPY TR C5 Ceramide染色方法如下: 用无血清培养液冲洗培养细胞3次, 加100 μL含5 μmol/L BODIPY TR C5 Ceramide染液, 4?孵育30 min, 用冰冷培养液冲洗3次, 加200 μL新鲜培养液37?继续孵育30 min, 吸出液体弃去, 加1滴抗褪色溶液, 用盖玻片盖上细胞, 在BX51TRF荧光显微镜下观察和图像采集。330,385 nm激发观察ER Tracker Blue White DPX发出的蓝色荧光(滤光片BA420), 460,490 nm激发观察EGFP融合蛋白发出的绿色荧光(BA510IF), 545,580 nm激发观察BODIPY TR C5 Ceramide发出的红色荧光(滤光片BA610IF), 图象重叠观察EGFP融合蛋白细胞内定位。 1.2.4 Western blot分析 按文献方法制备转染细胞的细胞质基质部分和细胞核、 高尔基体、 内质网部分, 免疫沉淀法浓缩培养上清中的EGFP或EGFP融合蛋白(抗 ), SDS PAGE电泳, 转印到PVDF膜, 兔抗EGFP多抗为一抗, 羊抗兔EGFP mAb IgG HRP为二抗, ECL PLUS化学发光试剂为检测系统, 进行蛋白质Western blot分析。2 结果 2.1 EGFP CLL1融合蛋白在CHO细胞内的定位 重组质粒pEGFP CLL1瞬时转染CHO细胞, 转染阳性细胞表达融合蛋白EGFP CLL1, 发绿色荧光, 广泛分布于细胞质内(图1C); 红色荧光示踪高尔基体(图1B); ER Tracker蓝色荧光示踪内质网(图1D); B、 C和D图象经计算机叠加后, 发现绿色荧光与红色荧光和蓝色荧光互相不重叠(图1A), 说明融合蛋白EGFP CLL1不在高尔基体和内质网表达, 可能仅存在于细胞质基质中。 图1 EGFP CLL1融合蛋白在CHO细胞内的定位(略) A: B、 C和D计算机叠加后结果; B: BODIPY TR染色的高尔基体(红色信号); C: 表达的EGFP CLL1融合蛋白(绿色信号); D: ER Tracker Blue White DPX染色的内质网(蓝色信号). 2.2 Western blot鉴定 pEGFP C1空质粒转染CHO细胞, 在胞质部分和细胞核、 高尔基体、 内质网部分中均发现相对分子质量(Mr)大约30000的EGFP蛋白; pEGFP CLL1转染CHO细胞, 在胞质中发现Mr约60000的EGFP CLL1融合蛋白, 细胞核、 高尔基体、 内质网部分中没有发现相同蛋白(图2)。用EGFP单克隆抗体(mAb)进行免疫沉淀, 浓缩上清液中相应抗原, pEGFP C1空质粒转染CHO细胞的细胞裂解物, 发现Mr大约30000的EGFP蛋白, pEGFP CLL1转染CHO细胞的细胞裂解物, 发现Mr大约60000的EGFP融合蛋白, CHO细胞、 pEGFP C1空质粒转染细胞和pEGFP CLL1转染细胞的培养上清中均没有发现EGFP蛋白(图3)。 图2 转染细胞不同部位融合蛋白Western blot分析(略) M: 蛋白marker; 1: 空白载体转染CHO细胞质部分; 2: 融合载体转染CHO细胞质部分; 3: 空白载体转染 CHO细胞的细胞核、 高尔基体、 内质网部分; 4: 融合载体转染CHO细胞的细胞核、 高尔基体、 内质网部分. 图3 细胞培养上清液中融合蛋白Western blot分析(略) M: 蛋白marker; 1: 空白载体转染CHO细胞裂解物; 2: 融合载体转染CHO细胞裂解物; 3: CHO细胞培养上清液; 4: 空白载体转染CHO细胞培养上清液; 5: 融合载体转染CHO细胞培养上清液. 3 讨论 GFP是一种独特的蛋白, GFP基本不影响宿主细胞, 因而可以鉴定、 跟踪、 分选表达的活细胞。由于细胞本身没有GFP基因, 将GFP和另一基因的编码区相连得到的融合体, 可以研究目的蛋白的定位。将研究的基因克隆进增强型重组GFP质粒pEGFP C1中, GFP和基因的编码区被整合在CMV启动子下游, 可在真核细胞中表达融合蛋白并在蓝色激光下产生绿色荧 光, 从而可得知所研究的基因表达蛋白的细胞内定位信息。 本研究中, 我们使用已构建含CL L1全cDNA表达序列的绿色荧光真核表达载体pEGFP CLL1, 转染CHO细胞,使用内质网和高尔基体示踪荧光染料染色, 荧光显微镜下观察和采集图像。发现融合蛋白的绿色荧光与内质网、 高尔基体不重叠, 说明融合蛋白存在于细胞质基质中, 而不存在于内质网和高尔基体内。用 Western blot检测发现在pEGFP C1空质粒转染CHO细胞, 在细胞质和细胞核、 高尔基体、 内质网部分中均发现Mr大约30000的EGFP蛋白; 而pEGFP CLL1转染CHO细胞, 在细胞培养上清液和细胞核、 高尔基体、 内质网部分中均没有发现Mr大约60000的CL L1融合蛋白; 进一步印证CL L1蛋白主要表达于真核细 不表达在内质网、 高尔基体和细胞核中, 也不分泌到细胞外。其他胞的细胞质中, 胶原样凝集素(如MBL、 SP A、 SP D等)主要为分泌型蛋白, 发挥重要的固有免疫作用[4, 6]。而CL L1是已发现的惟一存在于胞质中的胶原样凝集素蛋白, 推测其具有独特的生物学作用, 对它在人体组织内的分布和功能需要进一步深入研究。【参考文献】 [1] Ohtani K, Suzuki Y, Eda S, et al. Molecular and cloning of a novel human collectin from liver (CL L1)[J]. J Biol Chem, 1999, 274(19): 13681-13689. Nakagawa T, Ma BY, Uemura K, et al. Role of mannan binding protein, MBP, in innate immunity[J]. Anticancer Res, 2017, 23(6): 4467-447 1. Sano H, Kuroki Y. The lung collectins, SP A and SP D, modulate pulmonary innate immunity[J]. Mol Immunol, 2017, 42 (3): 279-287. Boussif O, Lezoualc HF, Zanta MA, et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyethylenimine[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(16): 7297-730 1. De Duve C, Pressman BC, Gianetto R, et al. Tissue fraction studies. 6. Intracellular distribution patterns of enzymes in rat liver tissue[J]. Biochem J, 1955, 60 (4): 604-617. Keshi H, Sakamoto T, Kawai T, et al. Identification and characterization of a novel human collectin CL K1[J]. Microbiol Immunol, 2017, 50(12): 1001-1013.
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