【推荐】猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因原核表达载体的构建及表达

【推荐】猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因原核达载体的构建及表达 猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因原核表达载 体的构建及表达 第23卷第4期 2005年12月 上海交通大学(农业科学 版)JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY(AGRICULTURALSCIEN CE)V01.23No.4 Dec.2005 文章编号:1671.9964(2005)04.0353.07 猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因 原核表达载体的构建及表达 崔立,朱建国,芦银华,谈国蕾,陈溥言,华修国 (1.上海交通大学农业与生物学院,上海201101; 2.南京农业大学动物医学院,南京210095) 摘要:用PK一15细胞增殖PCV一2病毒,提取病毒DNA,用PCR方法扩增核衣壳蛋白(Cap蛋白)全基因,克隆到pET一32a载 体中,构建了表达载体pETORF2,转化入大肠杆菌BI21中,用IPTG进行诱导表达,结果显示表达的蛋白大小与设计不符.同 样的方法,又构建了表达栽体pETRF2,含有Cap蛋白的部分基因,结果显示表达的蛋白大小依然与设计不符.对Cap蛋白编 码基因进行改造,在不改变原氨基酸序列的基础上,把其编码密码子全部换成大肠杆菌偏爱密码子,根据此序列,设计了4 条长引物,参照SOE的原理,用降落PCR的方法扩增出含Cap蛋白表位基因的片段,并克隆到pET.32a栽体中,成功构建了 重组表达栽体pETP1P4.SDS.PAGE电泳结果表明,表达的蛋白分子量与设计相符. 关键词:猪圆环病毒2型;Cap蛋白;大肠杆菌;表达 中图分类号:$852.651文献标识码:A Constructionnd一'0fProk~'yoticExprc"andExoressiont'rogaryottcresston0t VectorofPorcineCircovirusType2NucleocapsidProtein CU/Li,ZHUJian—guo,LUYin-hua.,TANguo-lei.,CHENFu-yan.,HUAXiu—guo (1.SchoolofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniv.,Shanghai201101; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NamingAgriculturalUniv.,Nanjing210095,China) Abstract:InoculatedPCV一 2inPK-15cells,theCapgenewasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)fromtheextracted virusDNAandclonedintopET32一 a.TherecombinantplasmidpETORF2wasconstructedandtransformedintotheBL21.Afusion proteinwasinducedwithffrrGandexpressed,butthemolecularweightofthefusionproteinwasnotaccordwiththeexpected.Inthe sameway,pETRF2wasconstructedandthepartofCapgenewasincluded.The~sultindicatedthesalnesituation.SotheCapgene wasaltered.Onthebasisoftonotalterationtheammonia,thesequenceofcodonswasreplacedbythemajorcodonsofcoli. AccordingtothechangedsequenceandtheprincipleofgeneSOEing,fourprimersweredesignedandthegeneincludingtheepitopes ofCapwasamplifiedbythetouchdownPCR.ThenitwasclonedintopET32-a,therecombinantplasmidpETP1P4wasconstiucted. TheresultofSDS-PAGEindicatedthecorrectmolecularweightswiththeexpected. Keywords:porcinecircovirustype2:Capprotein;Ecoli;expression 猪圆环病毒2型(poreinecircovirustype2,PCV一2)与综合征包括猪皮炎肾病综合征, 繁殖障碍,A2型 先天性震颤,猪增生l生和坏死性肺炎以及断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等 多种猪病相关n-_1,尤其 PMWS,自1991年加拿大首次报道以来,近年来给国内外养猪业造成了巨大的经 济损失,建立一种有效, 收稿日期:2005.04.26 基金项目:上海市科技兴农重点攻关项目(农科攻字2001第3.5) 作者简介:崔立(1971.),女,黑龙江大兴安岭人,副教授,在职博士,研究方向:营养免疫学;华修国为本文通讯作者 354上海交通大学(农业科学版)第23卷 简便的方法为当务之急.PCV一2Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,由病毒基因组中ORF2编码,构成病 毒的核衣壳.PCV一2Cap蛋白能被PCV一2的特异性抗血清所识别.所以本研究目的是构建含有Cap蛋白基 因的原核表达载体,并进行表达. 1材料 1.1细胞系 PK一15细胞,PCV一2shanghai株由南京农业大学传染病教研组分离并提供. 1.2菌株与质粒 BL.21菌株以及质粒pET一32a(+)为农业部疫病诊断与免疫重点实验室提供. 1.3酶与试剂 PCR试剂盒,蛋白酶K及试验用酶类均购自大连Takara公司;DNA小量胶回收试剂盒为上海华舜生 物有限公司产品;四季青小牛血清,SDS,琼脂糖,胰蛋白胨,酵母抽提物,溴乙锭,饱和酚(pH8.0)等 试剂购自南京生物工程公司;MEM细胞培养基为GIBCOBRL公司产品,各种化学试剂均为分析纯. 2方法 2.1原核表达载体pETORF2的构建及表达 2.1.1引物设计与合成根据已发表的2型圆环病毒基因序列设计了1对引物,由宝生物(TaKaRa)大 连有限公司合成: 引物1(5'Primer):GCGGATCCATGACGTATCCAAGGGATCC为BamHI识别位点 引物2(3'Primer):GCGTCGACCATrI~AGGGGTTAAGGTCGAC为SalI识别位点 2.1.2病毒增殖将病毒接种在PK一15细胞上,传代2次后,收获PK一15细胞,悬浮于适量超纯水中. 2.1.3病毒DNA的提取取接种PCV一2的PK一15细胞悬液,按文献[6]的方法进行病毒DNA抽提,备 作PCR模板. 2.1.4PCR扩增以提取的病毒DNA为模板.按PCR试剂盒说明进行,循环条件为:94cclmin,54oC 1min,72oC1min共35次循环,最后72cc延伸10min,取5IxLPCR产物经1%琼脂糖上电泳. 2.1.5pET一32a质粒的小量提取参照文献[6]方法进行. 2.1.6PCR产物的克隆 2.1.6.1DNA小量胶回收试剂盒提取凝胶中的DNA按DNA小量胶回收试剂盒进行操作,最 后用无菌超纯水溶解回收的产物,一2Occ保存备用. 2.1.6.2酶切反应目的片段及载体pET一32a的BamHI和SalI双酶切反应均按内切酶说明书进行各 取取4O酶切产物经1%琼脂糖电泳后切下目的条带用小量胶回收试剂盒回收. 2.1.6.3连接反应经2.1.6.2处理的目的DNA片段和pET一32a载体,按TDNAligase说明书进行连 接. 2.1.6.4BL21感受态细胞的制备按文献[8]的方法制备感受态细胞,置4cc12,24h待用. 2.1.6.5连接产物转化宿主菌(BL21)取连接产物5L按文献[6]的方法转化感受态BL21150IxL,用无 菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的琼脂平板,37cc放置,20min后倒置培养1O,14h. 2.1.6.6重组质粒双酶切鉴定双酶切反应分别按SalI和BamHI的说明书进行.取2O酶切产物经 1%琼脂糖电泳鉴定. 2.1.7重组质粒诱导表达及产物的SDS—PAGE电泳 2.1.7.1对数生长期细菌的培养与诱导从含有氨苄青霉素的琼脂平板上挑取单个阳性菌落接种到含 氨苄青霉素(100g?mLI1)的LB液体培养基中,37cc振摇培养,达到对数生长中期,即可以诱导.按In— 第3期崔立,等:猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因原核表达载体的构建及表达355 vitrogen公司所附的试验手册推荐的1mmol?LIPTG进行诱导表达. 2.1.7.2SDS—PAGE电泳按文献[6]的方法进行. 2.2原核表达载体pETRF2的构建及表达 2.2.1引物设计如下参考已发表的序列设计引物 1(5'Primer):CGGATGGCATCTTCAACACC, GA为EcoRV识别位点;引物2(3'Primer):GCGTCGACCATI'TAGGGGqq'AAG,GTCGAC为SalI识别 位点. 2.2.2PCR模板的获得分别参照1.2.1和1.2.2. 2.2.3PCR的扩增以提取的病毒DNA为模板,按PCR试剂盒说明书进行.循环条件为:94?lrain, 54?1min,72?1min共35次循环,最后72?延伸10min.取5IxLPCR产物在的1%琼脂糖上电泳. 2.2.3PCR产物的克隆用DNA小量胶回收试剂盒提取凝胶中的PCR产物;目的片段和载体pET一32a 的双酶切反应分别按EcoRV和SalI的说明书进行,各取40L酶切产物经1%琼脂糖电泳后切下目的条 带用胶小量回收试剂盒回收;目的DNA片段和pET一32a载体连接反应按TDNAligase说明书进行,其余 BL21感受态的制备及连接产物转化宿主菌方法同1.2.5. 2.2.4重组质粒PCR鉴定以提取的病毒DNA为模板,引物2,3(20pmol?L)各0.5IxL, 按PCR试 剂盒说明书进行.取5IxLPCR产物经1%琼脂糖电泳后鉴定. 2.2.5重组质粒诱导表达及产物的SDS—PAGE电泳方法同1.2.6. 2.3原核表达载体pETP11:'4的构建及表达 2.3.1设计4条引物如下P1引物5'端加入EcoRV酶切位点,P4引物5'端加入SalI酶切位点.全部 引物由上海生工合成. Pl(5'Primer):ATCGATATCGTGGATATGATGCGTITrAACATCGATGA'ITITGTGC CGCCGGGTGGTGGCACCAAC P2(3'Primer):CACTI'TCACTIq'ACGGATACGATAATATYCAAACGGGATGCTGA TITrGTYGGTGCCACCACCCGGCGG P3(5'Primer):GAATATYATCGTATCCGTAAAGTGAAAGTGGAAT17q'GGCCGTG CAGCCCGATCACCCAGGGTGACCGTGGC P4(3'Primer):CACCGGGTCACAAAGTTATCATCCAGGATCACCCCGGTGCTGC CCACCCCACCGTCACCCTCGCTGAT 2.3.2PCR扩增总反应体积 50L,10XBuffer5L,dNTP(2.5mmol?L)4L,MgCh(25mmol'L) 3L,P1,P2,P3,P4(40pmol?L一)各2IxL,rTaq酶0.5L,灭菌超纯水29.5L,混匀.采用降落PCR的方 法,95?预变性5rain,进人PCR循环,退火温度从70?降至50?,每次降温1?,每个温度进行2个循环, 当退火温度降到50时,进行15个循环.最后72?延伸10min.取PCR产物经2%琼脂糖电泳.取0L PCR扩增产物经2%琼脂糖电泳后,切下目的条带,用小量胶回收试剂盒回收. 2.3.3PCR产物的克隆用DNA小量胶回收试剂盒提取凝胶中的PCR产物;目的片段和载体pET-32a 的双酶切反应分别按0RV和SalI的说明书进行,各取40L酶切产物经1%琼脂糖电泳后切下目的条 带用小量胶回收试剂盒回收;目的DNA片段和pET一32a载体连接反应按 T4DNAligase说明书进行,按照 1.2.5制备BL21感受态细胞及连接产物转化BL21感受态细胞. 2.3.4重组质粒的PCR鉴定总反应体积 25L,10XBuffer2.5IxL,dNTP(2.5mmol?LI1)2p,L,MgClz (25mmol?L一)1.5L,P1,P4(40pmol?L一)各1IxL,rTaq酶0.25IxL,加入待检测的重组质粒1L,用 灭菌超纯水补足体积到25,同时,准备另外一个体系,把重组质粒换成pET一32a空载体,其余成分与之 相同,作为对照.PCR方法同2.3.2. 3.2.5重组质粒诱导表达及产物的SDS—PAGE电泳方法同1.2.6. 3结果 3.1原核表达载体pETORF2的构建及表达 3.1.1PCR扩增结果从提取的病毒核酸中扩增出大小约为700bp的基因片段,结果见图1. 3.1.2重组质粒的酶切鉴定结果重组质粒用SalI和EcoRV双酶切,切出大小分别为5.9kb和07kb 356上海交通大学(农业科学版)第23卷 的基因片段,结果见图2.Cap蛋白基因成功的克隆到pET一32a中,并将此质粒命为pETORF2. 3.1.3诱导表达产物的SDS—PAGE电泳结果通过诱导和SOS—PAGE电泳,结果显示pET一32a空载体 表达的融合蛋白大小为2ekd,pETORF2表达的大小约为31kd,比预计的42kd小,结果见图3. 3.2原核表达载体pETRF2的构建及表达 3.2.1PCR扩增结果从提取的病毒核酸中扩增出大小约为600bp的基因片段,结果见图4. 3.2.2重组质粒PCR鉴定的结果以重组质粒为模板进行PCR扩增,得到大小约为600bp的基因片 段,结果见图5.说明目的片段已成功的克隆到pET一32a中,并将此质粒命为pETRF2. 3.2.3诱导表达产物的SDS—PAGE电泳结果通过诱导表达和SDS—PAGE电泳分析,结果显示pET.32a空 载体表达的融合蛋白分子量大小为2Okd,pETRF2表达的大小约为24kd,比预计的38kd小,结果见图6. 3.3原核表达载体pETP1P4的构建及表达 3.3.1PCR扩增结果采用降落PCR的方法,得到大小为190bp的基因片段,结果见图7. 3.2.2重组质粒PCR鉴定的结果以重组质粒pETP1P4为模板进行PCR扩增,得到大小为190bp的 基因片段;而对照空载体pET一32a扩增结果无特异性条带,结果见图8.说明目的片段已克隆到pET一32a 载体中,并将此质粒命名为pETP1P4. 3.2.3诱导表达产物的SDS—PAGE电泳结果通过诱导和SDS—PAGE电泳分析,结果显示pET一32a空 载体表达的大小为20kd,pETP1P4表达的大小为27kd,符合预计大小,结果见图9. bp ' 750 500 M-ABMsbp 一 一 750 500 图1PCV一2CapgenePCR扩增结果 A:以PCV一2为模板的扩增产物:M:DL-2000分子量 Fig.1ThePCRproductofPCV一2Capgene A:theCapgeneproduct;M:DNAmolecularmarkerDL-2000 图2重组质粒pETORF2酶切鉴定 M1:DI.15000标准分子量;A:pET.32aSalI单酶切 B:pETORF2SalI/EcoRV双酶切;M2:DL-2000标准分子量 Fig.2REanalysisofrecombinantplasmidDETORF2 M1:DNAmolecularmarkerDL-15000;A:pET-32adigestedwithSalI; B:pETORF2digestedwithSalI/EcoRV;M2:DNAmoleeularmarkerDL.2000 图3含pETORF2的宿主菌IPTG诱导的SDS.PAGE A:合重组质粒pETORF2的宿主菌诱导;B:含空栽体pET32.a的 宿主茵诱导;M:中等分子量蛋白质标准 Fig.3SDSPAGEresultofpETORF2afterinduetion A:HostwithpETORE2induced;B:HostwithpET32-ainduced; M:MiddleMWstandardproteMarker 图4PCV-2Cap部分基因PCR扩增结果 A.B:以PCV一2为模板扩增的产物;M:DL-2000分子量标准 Fig.4ThePCRproductofPCV一2partofCapgene A.B:thepartofCapgeneproduct;M:DNAmolecularrflarkerDL-2000 一一42OO1 卯加 OOnOOO加m豁m 第3期崔立,等:猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因原核表达载体的构建及表达357 2090 lO0o ;88 ABMld AM 97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 14.4 bp 250 100 bpMAB —kdMAB 97.4 66.2 43.0 31.O 20.1 14.4 图5重组质粒pETRF2的PCR鉴定 A:扩增Cap的部分基因;M:DL-2000标准分子量 Fig.5PCRanalysisofrecombinantplasmidpETORF2 A:thepartofCapgenefromplasmidpETORF2; M:DNAmolecularmarkerDL.2000 图6含pETRF2的宿主菌IPTG诱导的SDS.PAGE A:含重组质粒pETRF2的宿主茵诱导:B:含空载体pET32.a 的宿主茵诱导;M:中等分子量蛋白质标准 Fig.6SDS.PAGEresultofpETRF2afterinduction A:HostwithpETRF2induced;B:HostwithpET32-ainduced; M:MiddleMWstandardproteMarker 图7P1P4片段PCR扩增结果 A:P1P4的扩增产物;M:DL.2000标准分子量 Fig.7ThePCRresultofP1P4gene A:theproductofP1P4gene;M:DNAmolecularmarkerDL-2000 图8重组质粒pETP1P4的PCR鉴定 A:从重组质粒pETP1P4扩增的P1P4基因;B:从重组质粒pET32.a 扩增;M:DL-2000标准分子量 Fig.8PCRanalysisofrecombinantplasmidpETP1P4 A:P1P4genefromrecombinantplasmidpETP1p4;B:PCRproductfrom recombinantplasmidpET32-a:M:DNAmolecularmarkerDb.2000 图9含pETP1P4的宿主菌IPTG诱导的SDS.PAGE A:含重组质粒pETP1P4的宿主茵诱导;B:含空载体pET32.a 的宿主茵诱导;M:中等分子量蛋白质标准 Fig.9SDS.PAGEresultofpETP1P4afterinduction A:HostwithpETP1P4induced;B:HostwithpET32-ainduced; M:MiddhMWstandardproteMarker 358上海交通大学(农业科学版)第23卷 4讨论 4.1人工合成片段运用0E方法的探索 重叠区扩增基因拼接法(genesplicingbyoverlapextension,geneSOEing)是利用PCR技术在体外进行 有效的基因重组和定点突变,而且不需要内切酶消化和连接酶处理.它是将2个或多个基因片断通过末 段互补,重叠延伸的方法进行体外基因拼接的简单,快速的基因重组技术.应用SOE方法可以构建突 变体,也可以构建融合基因.在本研究中,需要一段长达190bp的特定碱基,由于人工碱基合成技术的限 制,一次性合成这么长的碱基难以保证较高的准确性.所以人工合成了4段引物,2次应用SOE的方法, 最终扩增出该片段.中间为目的片段,两端是不同的限制性内切酶位点,以方便下一步的克隆.在此过程 中,需要解决以下的问题: 第一,这4段引物的长度都在70bp左右,超过常规引物的长度(20—30bp),但生物公 司的合成技术 可以保证较高的准确性.第二,引物和引物的重叠区域有24bp左右,这也是SOE中引物的特点,重叠区 域很长.在SOE中,引物越长,重叠区域也要长,长度可根据具体情况来决定.本研究中所选取的重叠区域 的长度是一种探索,这里重叠区域的长度占到引物长度的三分之一,这在理论上足够完成SOE反应.第 三,退火温度的选择.引物长度太长,超过一般引物设计软件中引物长度的要求,于是无法借助计算机辅 助软件进行设计.本研究借用Touchdown(TD)PCR(降落PCR)的方法,不需探索具体的退火温度,也可以 在较佳的条件下扩增出目的条带.这次退火温度从较高的70c【=开始,每次下降1c【=,循环2次,直至50 c【=,然后循环15次,使得特异性产物大量扩增.在产物中也存在非特异性产物,但产量不如特异性产物 从图8上可以看出试验中是分2次进行SOE扩增,在实际操作中,也进行高.第四, 了不同方法的探索.探 索一,按正常的顺序,分别在2个PCR管中进行P1与P2,P3与P4的PCR反应,反应结束后,再把2管的 产物混合到一起,补充一些rTaq酶.再进行一次PCR反应;探索二,直接在1个PCR反应管中加人4种引 物进行PCR反应.从琼脂糖电泳结果来看,都能扩增出目的产物.所以,最后选择了一次性PCR扩增方 法,就是本研究试验部分所述的方法.第五,引物浓度,M浓度,dNTP含量,DNA聚合酶用量的确定,需 要在PCR过程中不断调整,使得产物更加特异,量也最多. 4.2关于PCV一2Cap蛋白编码碱基中稀有密码子的问题 Cap蛋白一共有233个氨基酸,其中精氨酸稀有密码子AGG/AGA共有15个,占总蛋白6.44%;脯 氨酸稀有密码子CCC有13个,占5.58%.而在正常的表达中,AGG/AGA只有0.14%一0.21%,CCC有 0.43%.所以,从前述遗传密码应用的偏倚性与基因的高效表达中,我们可推测大量稀有密码子的存在, 不仅造成能蛋白表达量的减少,甚至能造成蛋白翻译障碍. 本研究所构建的第1个载体pETORF2,含有Cap蛋白的完整基因,实验结果表明pETORF2表达的蛋 白分子量比预计的偏小.经分析在PCV一2Cap蛋白基因的N端前41个氨基酸中,有3处成串的AGG/ AGA簇,由于稀有密码子对蛋白质合成的影响在N端要大于c端;并且50%的阅读框移位发生在AGG/ AGA串联密码处?.所以这使得表达完整的Cap蛋白基因的可能性很低. 本研究所构建的第2个载体pETRF2,去除了N端41个氨基酸编码基因,只含有Cap蛋白剩余基 因.Liu等n对PCV.2Cap蛋白基因进行实验分析表明,N端41个氨基酸与Cap蛋白的核内定位密切相 —18位及34—41位的氨基酸对Cap蛋白的核内定位起着决定性作用.关,其中12 但大肠杆菌表达 pETRF2时,表达产物分子量依然比预计的偏小.经分析,在去除N端41个氨基酸后剩余的蛋白质基因组 中,依然分散存在着AGG/AGA,以及CCC等稀有密码子,其中AGG/AGA占4.19%,CCC占5.76%,所 占比例依然比较高,而许多类似的研究也表明,单一的AGG/AGA也可引起翻译障碍. 针对稀有密码子带来翻译方面的问题,如产生移码突变和表达量下降等.通常可以采用2种措施:用 常用密码子代替稀有密码子n或将稀有密码子对应的tRNA基因和外源基因共表达151.本研究所构建的 第3个载体pETP1P4,就是用常用密码子代替稀有密码子.Mahe等发现在 PCV.2Cap蛋白上的表位[161,它 可以特异性识别PCV一2抗血清.于是在不改变这段抗原表位氨基酸序列的基础 上,把这段基因编码密码 第3期崔立,等:猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因原核表达载体的构建及表达359 子全部换成大肠杆菌最偏爱的密码子,根据这段碱基,设计4条引物,应用SOE的 原理,用降落PCR法扩 增出这个片段,并克隆到pET一32a载体中,构建成pETP1P4载体.通过SDS— PAGE电泳,目的蛋白的表达 符合设计的大小. 参考文献: [1]KavanaghNT.Dermatitis/nephropathysyndromeinpigs[J]_VetRec,1994,134(12):311 . 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