牛冷冻精液质量检测技术规程

牛冷冻精液质量检测技术规程 牛冷冻精液质量检测技术规程中华人民共和国行业牛冷冻精液质量检测技术规程1主题内容与适应范围本规程了牛冷冻精液质量检测技术方法。本规程适用于牛的精液和冷冻精液产品检验。2引用标准GB4143-84牛冷冻精液。GB2828-87逐批检查计数抽样程序及抽样。3样品的收集3.1抽样:到受检单位精液库中抽取样品。3.2进样:将样品送至检验机构。4抽样方法4.l正常检查一次抽样。各品种投产公牛按牛号顺序排列，由抽样人现场随意确定取样牛号。4.1.1各品种公牛抽样头数，按照GB2828-87中2.1.29等有关标准规定。4.2全部取样对已投产公牛，全部取样。4.3样品的抽取凡确定取样的公牛，从其精液贮藏罐中，随意抽取一个包装置的精液其中数量不能少于20份。4.4早样品的保存4.4.1存放冷冻精液的低温容器质量应符合GB5458-85规定，使用前经过清洗后加入新鲜液氮。4.4.2取放样品时空中暴露时间不得超过5秒。4.4.3有专人保管样品，木能脱离液氮，抽样报告单随样品行。4.4.4样品包装，标记应保持原样。5规格与质量的检测方法5.1剂型检查细管两端封闭严密，管体无裂痕，剂型规格符合GB4143-84规定。颗粒大小是否均匀一致，表面光滑，有无混杂物。5.2剂量检验5.2.l细管细管解冻后，剪去两端封口，将精液倒入5毫升玻璃试管内，静置5分钟后，用1.0毫升吸管(精度为0.01毫升)吸取并检查其精液量，分别检验三支，三支剂量的平均值为该批样品的剂量值。5.2.2颗粒将颗粒放入5毫升玻璃试管内干解冻后，用0.5毫升吸管(精度为0.001毫升)吸取精液，分别检验三颗剂量，三颗剂量的平均值为该批样品的剂量值。5.2.3检验量值的有效数及尾数处理按GB8170-87规定。5.3精子活力5.3.1解冻:细管精液直接置于37~38?恒温水浴中解冻后，立即取出，擦干水迹，剪去封口，将精液置于小玻璃试管中待检。颗粒精液取一颗置于预先水浴至38~40?的内有1.0毫升2.9%柠檬酸钠解冻液小试管中，水浴解冻，适当摇动，迅速溶化。每批样品解冻2份，动作熟练，空间暴露时间不超过5秒，恒温保存。5.3.2观察;解冻后精液应在10分钟内观察完毕。取解冻精液100微升置载玻片上，加盖玻片，立即在200~400倍显微镜下观察活力，环境温度或载物台温度保持在37~38?。5.3.3判定:观察视野中呈直线前进运动的精子估测其所占总数的百分比，每样品至少观察三个视野。5.4每一剂量解冻后呈直线前进运动精子数5.4.1方法:颗粒精液用血色素管准确吸取平解冻精液10 微升，注入装有0.99毫升的3%氯化钠溶液试管内以100倍稀释、混匀;细管精液吸取10微升注入装有0.49毫升的3%氯化钠溶液的试管内，50倍稀释，血球计数板用盖玻片将计数室盖严，用吸管吸取一小滴混匀后的精液，滴在计数室盖玻片边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满，无气泡。5.4.2观察:在显微镜下计数每个大方格中的精子数，共观察5个大方格，选择的大方格应是在25个方格的四个角和中间的方格，凡精子处于占线位置的，数上不数下，数左不数有，每样品观察二个计数室。两个计算室计算结果误差超过5%，重检。5.4.3计算:每剂量中精子总数=5个大方格中的精子数×5(即计算室25个大方格的总精子数)×10(1立方毫米内的精子总数)×1000(l毫升精液中的精子总数)×100(颗粒稀释倍数)或50(细管稀释倍数)×剂量值。上式可简化为每剂量中精子总数=5个大方格中精子数×500万(颗粒)或250万(细管)×剂量值。5.4.4 5.5判定每剂量中呈直线前进运动精子数=每剂量中精子总数×评定的活力(%)。解冻后精子顶体完整率5.5.1试剂配制磷酸缓冲液:磷酸二氢钠0.55克磷酸氢二钠2.25克双蒸水定容至100毫升中性福尔马林固定液:40%甲醛(用前经碳酸镁中和过滤)8毫升。磷酸二氢钠0.55克磷酸氢二钠2.25克用0.9%氯化钠溶液约50毫升，溶解后加入8毫升中和后的甲醛，再加0.9%氯化钠溶液定容至100毫升。姬姆萨原液:姬姆萨染料1.0克甘油66毫升甲醇66毫升将姬姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒入，放入56?恒温箱中继续溶解4小时，再加甲醇充分溶解混匀，取出过滤贮于棕色瓶中备用。存放时间越长其染色效果越好。姬姆萨染液:姬姆萨原液2毫升磷酸缓冲液3毫升蒸馏水5毫升规配现用。所用试剂纯度不低于A.R级5.5.2制片:取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的玻片与有样品的载玻片呈35度角，将精液样品拖抹于载玻片上，自然风于，约15分钟左右。风干抹片上滴上1~2毫升中性福尔马林固定液固定15分钟后，用清水缓缓冲洗，奔去固定液，自然风干。抹片反扣在带有平槽的有机玻璃板面上，将姬姆萨染色液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片和含固定精子面蘸上染色液，染色1.5小时后用清水缓缓冲去染液，凉干镜检。5.5.3顶体观察:每样品制作二个抹片，每个抹片观察300个精子以上(分左、中、右区)，二片的结果变异系数不得超过20%，否则重检。二片的平均值为顶体完整率。显微镜在1000倍油镜下观察精子顶体的完整或受损情况。5.5.4顶体分类?类顶体完整:赤道带核环清晰规则，外型正常，顶体部着色均匀，边缘整齐，可见明显顶脊。?类顶体轻微膨胀:顶体(质膜)开始疏松膨大，顶脊消失。?类顶体破掼。精子质膜 严重膨胀破损，着色浅而露出部分细胞核，头前部边缘不整齐。?类顶体全部脱落，精子核裸露。5.5.5判定:?类为顶体完整，其他三类为顶体异常;5.5.6计算:顶体完整率(%)=(顶体完整精子数/精子总数)×100 5.6解冻后精子畸形率制片、染色方法同本规程中5.5，并可与项体染色检验用同一片。畸形精子率(%)=(畸形精子数/精子总数)×100 5.7解冻后精子存活时间5.7.1解冻方法、检查、判定同本规程中5.3，解冻精液分为二份，按下列处理。5.7.2解冻后精液置于37?恒温水浴中，保存4小时检查活力。5.7.3解冻后精液置于5~8?环境中，保存12小时检查活力。5.7.4判定:到保存规定时间检查活力，凡活力大于l%为合格。5.8精液解冻后每剂量中细菌菌落数5.8.1培养基配制:先配普通琼脂牛肉浸膏5克蛋白胨10克磷酸氢二钾1克氯化钠5克用蒸馏水1000毫升溶解后加琼脂粉20克加温融解。矫正pH为7.4~7.6用脱脂棉过 )。血液琼脂:普通滤后，分装于试管或三角烧瓶中经高压灭菌(15磅20分钟 琼脂100毫升脱纤维犊牛或绵羊或兔血5~10毫升5.8.2取三剂量的冷冻精液，在无菌条件下，用37?灭菌生理盐水或其他稀释液作成1?10的均匀稀释液，用lmL灭菌吸管吸取1?10稀释液0.2mL于灭菌平皿内，每个样品作两个平皿.在已凉至50?左右的普通琼脂中以无菌操作加入5~10%脱纤维血(牛、绵羊、兔)轻轻摇匀(勿起气泡)，注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将血液琼脂倾入加有0.2mL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37?温箱内培养24小时取出，计算平板内菌落数目。5.8.3观察和判定:平皿观察时用肉眼，必要时用放大镜以防漏记，结果每剂量中细菌菌落数=[(第一平皿中菌落数×5×10×剂量值)+(第二平皿中菌落数×5×10×剂量值)]/2。出现溶血现象可进~步检验，是否属致病菌引起的溶血。病原微生物的检验可根据农业部有关兽医检疫方法进行。附加说明: