取样时间对小鼠骨髓和外周血嗜多染红细胞微核率的影响

取样时间对小鼠骨髓和外周血嗜多染红细胞微核率的影响 取样时间对小鼠骨髓和外周血嗜多染红细 胞微核率的影响 癌变'畸变?突变2001年1月第13卷第i期carcinogene9Temr.ogen?is衄dMuta日enesVol13N.1Jan200 文章编号:1004—616XI2001)01,0039—03 取样时间对小鼠骨髓和外周血嗜多染红细胞微核率的影响. 宫丽宠.冯洁.屠曾宏 (中国科学院上海药物研究所,上海200031) ? 论着? 摘要目的:比较一次给药后不同采样时间对鼠外周血和骨髓嗜多染红细胞微核率的影响.方法;IcR小鼠一次瞠腔注射f) MMC2.0rng/kgbw或CP40mg/kgbw,后12h,18h,24h,32h,48h,72h采外周血及骨髓涂片.Giemsa染色.计数嗜多染 红细胞及其微核数.结果:一次IPMMC或cP后12h即可观察到小鼠骨髓PCE微核率增高,分别在绐药后24h,32h达到高 峰,此后逐渐下降.到72h已接近对照组水平;而外周血PCE微桉率的显着增高刷出现在绪药后的24h,在48h选到高峰. 结论:外周血PCE作为微核试验靶细胞与骨髓PCE的检测敏感性相同,但外周血PCE微核高峰出现较骨髓延迟约l2,24h; 在检测化学物对骨髓细胞毒性方面,外周血与骨髓的检测灵敏性也相同. 关键词:徽棱试验;嗜多染红细胞(PCE);骨髓;外周血 中圉分粪号:Q343.245文献标识码:A EFFECTOFSAMPLINGT肼EONMoUSEMICRONUCLEUSASSAYINBONEhIARROWAND PERIPHERALBLOOD GONGLi—kun,FENGJie,TUZenghong 【StateKeyLaboratoryofDrugResearch,ShanghaiInstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofSo1 ezzces,Shanghai200031,China) Abstract;Purpose:Studiaswereconductedtoevaluatedtheeffectsofonetreatmentprotoco1andsamplinglime onthemicroliucleustestsoftWOclastogens— mitomytinCandcyclopho~}phamide.Methods:YoungadultICR miceweretreatedoncewithmitomytiliC(MMC,2kg.bw)orcyclophc,sphamide(CP,40mg/kg.bw)by intraperitonealinjection.Themicroliucleusincidencesinpolychromaticerythrocytes(PCEs)ofdifferentsam— piingtimes12h,18h,24h,32h,48h,72hafterdosewereevaluatedintheperiphera1bloodandthebine marrow.Results:Thedateinthisstudyindicated:? Thefrequenciesofmicronucleatdepolychromatieerythro— cy1es(MnPCEs)intheboneillarrov7andperipheralbloodwerealmostidenticalateachoptimalsamplingtimeof thetwoetastogens;? Themaximal{herea~o.,eoftheilicidencedMnPCEsofperipheralbloodwasdelayed12, 24hcomparedtOthatofboliemalTow;? ThefrequencyofPCEsofperiphera1bloodwasequa1,sensitivetothat ofbonemarrowindetectingcytotoxicitytOthehematopoiticsystem.Conclusion:Itissuggestedthatfollowing theoneinjectionprotocolwithMMCorCP,boneinarrowandperipheralbloodarebothequalyefficacy. Keywords:micronucleustest(assay);polychromaticerythrocyte(PCE);bonemarrow;periphera1blood 微核试验是反映染色体损伤的一种简易,快速的 检测方法.骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核率作为常 规指标广泛应用于化学物的安全性评价及诱变剂的 ?收稿日期:20I】0—0427; 作者简介:宫丽岜(1972一 任订日期:20000615 ),女.硕士,从事毒理学研究1二作. 筛选.但骨髓嗜多染红细胞微核试验亦存在某些局 限,为此,人们尝试了多种靶组织或细胞的微核试验, 其中外周血嗜多染红细胞(即网织红细胞)一直受到 一 39— 癌变?畸变一突变2001年1月第13卷第1期 CarcinogeaesisTeratogenesisaadMutagen~isVo]13No1J帅,2001 国内外学者的关注.1997年ICJ4已通过可以采用 外周血为靶组织进行微棱试验.但国内关于此方 本实验应用丝裂霉素C及环磷酰胺 面的报道较少. 两种致突变物,比较了一次给药后不同采样时间对小 鼠外周血和骨髓嗜多染红细胞微核率的影响. 1材料与方法 1.1主要试剂与器材 丝裂霉素(wwc),Ft本K.H.K.公司;环磷酰胺 (CP),上海华联制药有限公司产品;胎牛血清(FCS), Sigma公司;Giemsa染色液按常规染色方法配制; OLYMPUS显微镜(CH型). 1.2实验动物 健康,成年ICR小鼠,体重20,24g;中国科学院 上海实验动物中心提供. 1.3方法 ICR小鼠随机分为3组,对照组6只小鼠,腹腔 注射0.9%NaC1,24h采样;实验组分别经腹腔注射 MMC2mg/kgbw,CP40mg/kgbw,按0.1ml/ 10g.bw给药,每组动物再随机分为6组,每组4只, 分别于给药后12h,18h,24h,36h,48h,72h采鼠 尾血约101制血涂片,处死小鼠后取两侧股骨骨髓 制成细胞悬液,涂片;将全血及骨髓细胞涂片固定,1: 10Giemsa磷酸盐缓冲液(pH6.8,70)染色, ×1000镜下观察.全血细胞涂片计数2000个 PCE,骨髓涂片计数1Oo0个PCE,记录含微核的嗜 多染红细胞(MnPCE)数,计算微核率;同时计数相同 视野下正染红细胞(NCE)数,并计算PCE占红细胞 总数的比率.结果以千分率表示. 1.4统计方法各组间微核率比较用u检验,PCE 比率的差别用成组比较的f检验. 2结果 MMC,CP外周血与骨髓微核试验结果见表1, 2.一次1PMMC2.0mg/kg或CP40mg/kg后12h 即可观察到小鼠骨髓PCE微核率增高,分别在给药 后24h,32h达到高峰,此后逐渐下降,到72h已接 近对照组水平;而外周血PCE微核率的显着增高则 出现在给药后24h.在48h达到高峰.图1显示两 种诱变剂骨髓与外周血时间一微核率曲线,可见骨髓 与外周血PCE微核率在其各自的峰值时点几乎相 等,只是外周血微核率达峰时间较骨髓晚约12,24h (MMC组约16h,CP组约24h). ut224#2 Sap1instizen1, 圈1MMC和CP对骨髓和外周血中散核发生率的影响BM:骨髓; PB:外周血. Fig~e1EliotMMCaadCPonincidenceolmkmnucLeiin~oilemar一 ?wandperipheralbloodBM:bonemarlRJw;PB:peripherMblood 本研究ICR小鼠一次IPMMC2.0mg/kg.bw 显示出明显的骨髓细胞毒作用,且在骨髓与外周血中 均可以观察到PCEs占红细胞总数的显着降低;且随 着时间的增加,下降更明显.一次IP40mg/kgbw CP未观察到其对骨髓细胞明显的抑制作用,各时间 点采样PCEs占红细胞总数比率与对照组相比无显 着性差异. 表1用MMC处理小鼠的骨髓和外赢血的獭榷频牢 Table1.Frequenciesofmleroncclelinbonemarrowandpcrlph~rMbleodofmicetreatedthM Mc(‰,? anegative?lIsaline0ln/t0g.IP *UtP<O05-**P<00tsigrdfica~dydifferent?negativecontrol #P<005.&mfknt出ffer曲tfromnegadv~comrM(bonemarrow)or0timebygroupedltest 一 40—— 钟??? 一?苣?uulI 癌变-畸变?突变2001年1月第13卷第1期Caxeinngene~sTeratogeneslsandMutngme~isVo[13No1Jan,2001 3讨论 微核率是检测细胞遗传性损伤的一个重要指标. 本实验以骨髓和外周血PCE为靶细胞,采用Giemsa 染色方法检测了一次给药MMC或CP诱导微核率 的差异.MMC的血浆半衰期极短t1,2<30rain,可 直接作用与遗传物质引起染色体断裂,CP本身无致 突变活性,需经肝脏代谢后才具有致突变'I生,此两种 化学物常用作微核试验的阳性物,为此,本实验选此 两种染色体断裂剂为受试物. 丧2用CP盘上理小鼠的骨髓和外周血的微核额率 bk2.Frequen~iesofmleronaelei岫口em~rrow柏d曲bloodo,metrealed曲衄f‰,; ane~stivecomrol,saline01ml/logbw.IP *Ut啦P<005,**P<00i帅cantdiffe~ntfromttega*ivecottt~o] 本实验发现,MMC组骨髓PCE微核率在一次给 药后32h达到高峰,而CP组微核率高峰出现在一次 给药后24h,可见不同化学物引起的PCE微核率峰 值出现的时间不同,且同一他学物,给药剂量与途径 不同,动物种属不同.微核率峰值出现的时间也不 同【-.在以外周血为靶组织时亦存在同样的问题. 尤其在化学物致突变效应较弱时,采样时间点的选取 就更加重要. 红细胞的细胞增殖动力学显示,其排核成为 PCE后,在骨髓中停留约12,24h入血,在外周血中 经过约相同的时间发育成成熟的红细胞(即NCE). 本试验MMC组及CP组外周血MnPCE在染毒后48 h计数出现高峰,分别较骨髓PCE微核率高峰延迟 了16h和24h.但骨髓与外周血PCE微核率在其各 自的峰值时点几乎相等,说明两者的检测敏感性相 同.与uayashi等-J结论相同. 多数外周血PCE为靶细胞的微核试验采用吖 啶橙(A.O.)超活体生物染色,无法计数PCE占红细 胞总数的比例,也就无法判定受试物是否对血细胞的 生成有抑制作用,采用Giemsa染色方法便可以克服 A0染色此点的不足,在用小鼠试验时不像大鼠血 细胞中存在较多的嗜破颗粒易与微核相混淆而产生 假阳性结果.且Giemsa染色具有方法简单,标本玻片 的保存时间较长.不必立即计数等优点,因而本研究 采用了Giemsa染色.结果显示,ICR小鼠一次IP MMC2.0mg/kg.bw既出现明显的骨髓细胞毒作 用,在外周血和骨髓涂片中均观察到PCE占红细咆 总数比率的显着降低,且随着时间的延长呈下降趋 势,在外周血更明显.与Tice-0等结果一致.一次 IPcP40mg/kgbw各时点采样计数,外周血与骨 髓PCE占红细胞总数比率均与对照组相比无统计学 差异.提示,外周血PCE占红细胞总数的比率也可 咀反映外来化台物对骨髓细咆的毒作用,与骨髓 PCE细胞同样甚至更灵敏. 参考文献: [I]ICH4SteeringC~itteeGmotoxixity:Asmnderedbatter;efor genotoxicitytestingofpharmaccutica/sFourthInternationalCon- ferenee口nHarmon/sationR,Brusse3I99716--I8 2]1l1ceRR.Er~xsonGL.Hilliardq."fEffectoftre~'ltmetltpro— toco[andsampletmle0?theffrequenc[esol"mieronucIeatedpoly— chromaticerythroeyte~inbonem~t1.t~owandperipheralblood fJ1.~futagenesis,1990.5(4):313--32I r3]VanparysP.DeknudtG.Vem~eirenF,elS~mNingtimesin mleronucleustes6ng~j】mRes.1992,282:191,196 :4】Ha)~ashiM,MorlmT,KodaautY,e/alThere[croftue]et~assay ?m0peripherMret~eulocytesu,~angacridineorange一~ated shdes[J】M"报Res.I990.245245--249 41