【doc】 EB病毒GST-Rta融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

【doc】 EB病毒GST-Rta融合蛋白的达、纯化及其多克隆抗体的制备 EB病毒GST-Rta融合蛋白的表达、纯化及 其多克隆抗体的制备 四川大学学医版 i;2005;36(5)JSichuanUnivedScEd:665—667(Mii)…,’…’’ EB病毒GST—Rta融合蛋白的表达,纯化及其 多克隆抗体的制备 徐永春,梁伟波,苟航,陈文婕,朱银华,贾静,张林? 1.四川大学华西基础医学与法医学院法医物证学教研室(成都610041);2.四川大学华西医院教育部人类疾病生物治疗重点 【摘要】目的表达和纯化EB病毒的重组融合蛋白谷胱氨肽S转移酶(GST)一Rta185和GST-Rtal50,并制 备特异性多克隆抗体.质粒表达载体pGEX—R185I,pGEX—R150I和pGEX一5X一3分别转入大肠杆菌BL21 (DE3)中,异丙基硫代一D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化目的蛋白.将 纯化后的GST—R185,GST—R150和GST蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清.结果在细菌裂解液中检测到高表 达量的融合蛋白,经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST—Rta融合蛋白.应用Western blot和ELISA方法检测证实,用纯化的GST—Rta蛋白免疫家兔得到 了特异性的多克隆抗体.结论通过上述方法 制备出来的融合蛋白纯度较高,免疫家兔获得的多克隆抗体具有良 好的特异性,为研究EB病毒Rta蛋白及与EB 病毒相关疾病的诊断和治疗提供了重要的条件. 【关键词】融合蛋白亲和层析多克隆抗体EB病毒 【中图分类号】R392 ExpressionandPurificationofGST-RtaFusionProteinfromEBVirusandPreparationofthePolyclonalAntibody AgainstGST-RtaXUYong-chun,LIANGWei-bo,GOUHang,CHENWen-fie,ZHUYin-hua,JIAJ/ng,ZHANG Lin.DepartmentofForensicBiology,WestChinaSchoolofPreclinicalandForensicMedicine,Sichuan University,Chengdu610041,China [Abstract]0bjectiveToobtaintherecombinantfusionproteinsGST..Rta185andGST..Rtal50fromEB virusandpreparetWORtaproteinspecificpolyclonalantibodies,respectively.MethodsPlasmidspGEX—R150I, pGEX-R185IandpGEX-5X-3wereseparatelytransformedintoEscherichiacoliBL21(DE3).Expressionsofthe recombinantproteinsR150一GST,R185一 GSTandfreeGSTwereinducedby0.1mmol/LIPTGinLBmedium. TheexpressedproteinswerepurifiedfromlysateswithGlutathioneSepharose4B.Purifiedproteinsweremixed withFreund’SadjuvantandthenwereusedtOimmunizerabbits.ResultsHighlevelsofexpressionoftarget proteinsweredetectedinthelysatesandthepurifiedproteinswereobtainedbyaffinitychromatographywith GlutathioneSepharose4B.WesternblotandELISAanalysissuggestedthatthepolyclonalantibodiesagainstGST— R150werespecific.ConclusionTheantiserumshavegoods R185andGST— pecificity.Theyareimportantforthe researchonRtafusionproteinsfromEBvirusandforthediagnosisortreatmentofEBvirusassociateddiseases. [Keywords]FusionproteinAffinitychromatographyPolyclonalantibodyEBvirus EB病毒是一种在世界范围内广为传播的淋巴 滤泡病毒,与多种疾病密切相关[1].EB病毒的生活 周期可以分为潜伏期和裂解(复制)期两个阶段,研 究表明,从潜伏期向裂解期过渡的过程由两种立即 早期基因(immediateearlygene,IEgene)产物调 控,即BZIF1转录活化剂Zta和BRIF1转录活化 剂Rta,它们几乎同时在诱导转录后2h内表达,然 后引发一系列早期基因的相继表达[2.].Feng等[4] *教育部跨世纪优秀人才培养基金(批准号2001.29),四 JII省杰出青年学科带头人培养基金(批准号:2001—2)和纽约中华医 学基金会(CMB00722)资助 ACorrespondingauthor,E—mail;kit@SCU.edu.cn 对Rta的研究提示,它可作为早期EB病毒复制的 监测指标,从而为鼻咽癌,B淋巴细胞瘤等与EB病 毒关系密切的疾病早期诊断提供了可能性.要进一 步研究Rta蛋白在EB病毒相关疾病的表达情况, 需要有特异性的抗体,本研究采用自行构建的谷胱 氨肽S转移酶(GST)一Rta蛋白重组质粒,对GST— Rta融合蛋白的表达,纯化及其多克隆抗体的制备 和鉴定进行了研究. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1实验动物新西兰纯种白兔,2,5个月,雄 四川I大学(医学版)2005年第36卷第5期 性健壮,体质量为2.5,3kg,购自四JII大学华西实 验动物中心. 1.1.2试剂和仪器重组质粒GEX一5X一3,pGEX— R1851,pGEX—RI5Ol(本课题组构建);Glutathione Sepharose4B亲和层析柱(AmershamBiosciences 公司);还原型谷胱甘肽(ReducedGlutathione, Sino—AmericanBiotec公司);异丙基硫代一D半乳 糖苷(isopropylD—thiogalactoside,IPTG, TaKaRa公司);对甲基苯磺酰氟(phenylmethyl- sulphonylfluoride,PMSF,Sherengy公司);3,3-_.-- 氨基联苯胺(DAB,AMERESO公司);邻苯二胺 (OPD,科密欧公司);弗氏佐剂由四川I大学华西基 础医学与法医学院免疫学教研室提供;辣根过氧化 物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白(IgG-HRP,BIO- RAD公司);HZQ—F全温振荡培养箱(哈尔滨东联 电子技术开发有限公司);JY92一?型超声波细胞粉 碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);微型 Trans—Blot转印系统(BIO—RAD公司);680型酶标 仪(BIO—RAD公司). 1.2方法 1.2.1融合蛋白的表达和纯化将重组质粒 pGEX—R185I用氯化钙法转入大肠杆菌BL21 (DE3)中,挑选单个菌落,接种到IB培养基中(含 有lOO/~g/ml的氨苄青霉素),37?摇床振荡培养 至A..一0.6,0.8左右.加入终浓度为0.1mmol/ L的IPTG,30?诱导培养3.5h.收取菌液,4? 4000×g离心10min,弃去上清,按5ml/g大肠杆 菌的比例将沉淀悬浮于冰浴的裂解缓冲液中(含有 1g/I的TritonX一100,1mmol/LPMSF的磷酸盐 缓冲液PBS,pH7.4).用超声波细胞粉碎机破碎菌 体,直至细胞悬浮液变得澄清(冰浴条件下进行).将 裂解液4?12000×g离心15min,收集上清液,与 适量的GlutathioneSepharose4B匀浆(pH7.4的 PBS平衡),室温搅拌混匀.混合液体缓缓流经亲和 层析柱,用5倍体积的PBS(pH7.4)洗涤柱子两次, 再用洗脱液(10mmol/L还原型谷胱甘肽,50 mmol/L的Tris—HC1,pH8.0)洗脱,室温静置10 min后,从层析柱底端收集洗脱下来的蛋白溶液.用 100mg/I的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS—PAGE)鉴定.采用同样方法得到GST和 GST—R15O融合蛋白.用Lowry法[5]测定蛋白浓度 后,一30?保存. 1.2.2佐荆抗原的制备和家兔的免疫制备过程 均在冰浴中进行.将一定体积的弗氏佐剂置预先经 高压灭菌的研钵中,缓慢滴加等体积的抗原(0.5 mg/m1),每加1滴研磨数转直至液滴消失,待抗原 全部滴入并研磨成为乳白色粘稠的油包水乳剂.将 佐剂抗原滴入冷水表面,滴入后应保持完整而不分 散时,即为合格.动物免疫前,由耳缘静脉取血5 ml,分离血清,一20?保存,作为对照.6只家兔随 机分为GST对照组,R185组和R150组等3组.初 次免疫剂量为每只家兔注射2ml的抗原(含氟氏 完全佐剂),多点注射于足掌及肘窝淋巴结周围,背 部两侧,颌下,耳后等皮下.4周后以同样的剂量(含 弗氏不完全佐剂)加强免疫,背部多点注射.加强免 疫两周后再次加强免疫.第3次免疫10d以后进行 末次免疫,直接用2ml抗原静脉注射.每次加强免 疫后7,10d从兔耳缘静脉采血2,3ml,用间接 ELISA法检测抗体效价.效价达到1:10000以上 后,即用颈动脉放血法采血,4?静置过夜,4000×g 离心10min得到抗血清. 1.2.3血清中抗体效价的检测采用间接ELISA 法检测血清中抗体效价.将纯化的抗原分别用包被 液(pH9.6,0.05mol/L碳酸盐缓冲液)稀释为3O /~g/ml,每孔加入100l,4?隔夜包被酶标板.用含 0.5ml/LTween20的PBS洗3遍后,每孔加入含 10g/LBSA的PBST100l,37?封闭2h.PBST 洗3遍后加入用封闭液稀释(先稀释1000倍后再倍 比稀释)的对照兔血清(ga疫前)和兔抗血清,37? 反应2h.PBST洗5遍后加入相应辣根过氧化物酶 标记的羊抗兔二抗(1:1000稀释),100v.I/~L,37 ?反应1h;PBST洗6遍后加入含过氧化氢的底物 OPD溶液,室温避光显色5,3Omin,2mol/L H.SO终止反应(50v.I/~L).酶标仪检测A..值. 1.2.4Westernblot检测血清中抗体的特异性 纯化的融合蛋白先进行100mg/L的SDS—PAGE, 然后进行电转移(微型Trans-Blot转印槽,100V,1 h).小心取下PVDF膜,用封闭液(含5脱脂牛奶 的TBST)室温封闭3Omin.TBST洗涤两次,每次5 min.加入一抗(封闭液稀释成1:300的多克隆抗 体),室温孵育1h;TBST洗涤3次,每次10min;加 入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,用封闭 液稀释成1:1000),室温孵育1h;TBST洗涤3 次,每次10min.然后用DAB溶液显色(20mlDAB 溶液含有10mmol/L的Tris—HCl,12mgDAB和 30},l300ml/L的HO).双蒸水冲洗终止反应. 2结果 2.1融合蛋白的表达和纯化 JSichuanUniv(MedSciEdi)Vo1.36No52005 pGEX一5X一3,pGEX—R185I,pGEX—RI501分别 转染大肠杆菌E.coilBI21,IPTG诱导3.5h后. SDS—PAGE分析证实细菌裂解上清液中表达有较 高浓度的蛋白.3种蛋白的相对分子质量分别为 GST27×10.{GST—R18549.2×10;GST—R15045 ×10.用OlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯 化后得到纯度较高的融合蛋白(图1)Lowry法测 得蛋白浓度为0.5mg/m1.可用于免疫家兔制备抗 血清 2.2抗体产生情况 舶ltO0g/L的SDS—PAGE分析结果 Fig1Resultsof1O0g/LSDS—PAGEanalysis MIMolecutarsmarkers;IlL尸TG—inducedbacteria1 sotutlon0fGST—Rtal85I2】Bacteria[1ysatesupernatantthat expressesGST-Rta185J3|PurifiedfusionproteinGST—Rta185;4l IPTG.inducedbacterialsolUtianofGST—Rta150I5:BacterialIysate supernatantthatexpressesGST—Rt】50l6:Purllied[usionprotein GST—Rl50 田2ELISA檀训抗血清的效价 Fig2TheliterofantiserumdetectedbyELISA ?, 一 .___’.__?- ii;- 田3WesternBlot植碧结果 F3ResultsofWesternBlotanalysts MlMolecular?rkes{1tGST—R150;21GST:3lGST R185 见图2.免疫前的家兔血清对抗原没有反应.而 加强免疫后的抗血清效价不断提高末次免疫后的 抗血清对抗原的反应滴度都在1:32000以上. 2.3多克隆抗体的特异性 检验结果如图3,可见Rta150,GST,Rtal85均 有特异性条带出现. 3讨论 Rta是EB病毒IE基因BRIF1的编码产物, 是DNA序列特异性的酸性转录活化剂.有证据表 明BRIF1能单独破坏B淋巴细胞和上皮细胞中 EBV的潜伏期],使EB病毒进入裂解期.Rta在细 胞周期的调节上也有重要的作用,它能活化一种调 节细胞增殖与分化的基因c—myc以及EBVBHRFl 基因;还能直接与肿瘤抑制剂Rb蛋白相互作用,破 坏Rb—E2F复合体或是降低Rb家族成员的稳定 性,使静止的纤维原细胞进人s期.另一方面,细胞 因子能调节BRIF1在上皮细胞和淋巴细胞系中的 表达.Rta和细胞因子之间的相互作用在病毒复制 和宿主细胞分化的调节上也许发挥了重要的作用, 并且有可能用于治疗EBV阳性肿瘤]. 要研究BRLF1基因以及其编码的Rta蛋白在 EB病毒相关疾病中的表达和功能时,首要问题就是 先获得纯化Rta蛋白及其特异性抗体.利用细菌表 达的融合蛋白免疫动物制备抗体是一种特异性好, 效价高,费用低,方便快捷的方法在现有的融合表 达系统中,GST融合表达系统很好的满足了这些条 件本实验利用构建好的质粒表达载体pGEX— R1851,pGEX—R150I和pGEX一5X一3,通过IPTG诱 导在大肠杆菌BI21(DE3)中表达融合蛋白GST— Rl85,GSTRl?和GSTSDS—PAGE分析表明,在 细菌裂解上清液中检测到较高浓度的融合蛋白.在 用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱除去其他 杂蛋白后,得到纯度较高的融合蛋白,说明上述表达 和纯化Rta—GST融合蛋白的方法是可行的.然后将 制备的融合蛋白作为抗原,GST作为对照抗原,免 疫新西兰大白兔.为了得到高效价的抗血清,根据有 关文献,采用了多次加强免疫,末次免疫直接用抗原 静脉注射的方法,ELISA结果表明,获得的抗血清 效价在1:32000以上,说明整个免疫过程是成功 的.Westernbtot结果表明抗血清能特异性的识别 融台蛋白,但GST—R185抗体和GST—Rl5O抗体以 及GST之间有部分交叉反应(因为其中都含有共同 的GST成分),说明还应该进一步去(下转第699页) “ ×?如?;2如 :,, :呈l昌 X JSichuanUniv(MedSciEdi)Vo1.36No.52005699 间接指标,它测定的是脂过氧化物分解产物的醛类 物质,如MDA在LDI氧化修饰过程随脂质过氧化 反应的进行,产生的TBARS的量也在不断增加,因 此TBARS的含量可以反映LDI的修饰程度[1引.模 型组动物血清TBARS升高,比正常对照组高20 倍,表明脂质过氧化的代谢产物增加,说明在As发 展过程中存在着脂质过氧化损伤.而花椒挥发油能 有效提高机体抗氧化活性,降低脂质过氧化物的最 终产物(TBARS值)的含量,仅比正常对照组高5 倍.提示花椒挥发油抗As的作用与其清除氧自由 基,抗脂质过氧化损伤有关.从我们对花椒挥发油的 化学成分分析来看,这种抗氧化作用可能与其中含 有丰富的单萜,含氧萜,醌类和不饱和脂肪酸有直接 关系,它的抗氧化作用可能是多种成分协同作用的 结果. 花椒挥发油还具有抗血小板聚集,抗血栓及免 疫调节等作用,以及降压,保护应激性心肌损伤等心 血管药理活性.因此,推测花椒挥发油的抗As作用 除了与降低血脂及抗氧化作用有关外,还可能与其 抗血小板聚集,抗血栓,保护内皮细胞功能等作用有 关.其确切的作用机制有待于进一步深入研究. 1 2 参考文献 孙小文,段志兴.花椒属药用植物研究进展.药学,1996} 31(3):231. 卢长庆,路雪雅.不同品种花椒粗提物抗菌,抗氧化作用比较 4 6 7 8 11 研究.中国中药杂志,I995}20(12):752. 许青媛,于利森,张小莉等.花椒粗提物对实验性血栓形成及 凝血系统的影响.中草药,I990}21(12):17. 杨靖,曹宁.花椒挥发油的抗菌作用及对小鼠免疫机能的 影响.济宁医学院,1993}16(4):26. 许青媛,杨浦昭,陈春梅.花椒粗提物对应激性心肌损伤的保 护作用.中草药,I993}24(5)z277. 国家药典委员会主编.中华人民共和国药典2000年版一部.北 京z化学工业出版社,2000t附录XD,64. LinECK,FernandezML,McnamaraDJ.Dietaryfattypeand cholesterolquantityinteracttoaffectcholesterolmetabolismin guineapigs.JNutr,1992l122(10)l2019. JaneroDR.Malondialdehydeandthiobarbituricacidreactivity asdiagnosisindicesoflipidperoxidationandperoxidativetissue injury.FreeRadicBiolMed,1990}9(6)l515. 李培瑛,李健斋.异丙醇抽提,高铁醋酸硫酸显色测定血清总 胆固醇的评价.中华医学检验杂志,I982}5(I):44. 李培瑛,李健斋,王抒.乙酰丙酮显色法测定血清甘油三醋. 中华医学检验杂志,1987}10(4):193. GundersenHJG,BendstenTF,KorboL,eta1.Somenew, simpleandefficientstereologicalmethodsandtheirusein pathologicalresearchanddiagnosis.APMIS,I988}96(5)l 379. FernandezML.Guineapigsasmodelsforcholesteroland lipoproteinmetabolism.JNutr,2001;131(1)l10. 刘尚喜,陈瑷,周攻.低密度脂蛋白体外氧化修饰过程中 几种产物变化的动力学研究.中国动脉硬化杂志,1996I4(4): 250. (2004一II一29收稿,2005—03—04修回) 编辑汤洁 (上接第667页) 除其中的交叉成分.综上,我们成功进行了重组Rta 蛋白的表达,纯化以及多克隆抗体的制备,为研究 EB病毒Rta蛋白以及EB病毒相关疾病的诊断和 治疗奠定了基础. 参考文献 4 5 6 1徐才刚,朱焕玲,吴泰相等.恶性淋巴瘤发病与病毒感染的配对 病例一对照研究.四川大学(医学版).2004;35(2):247.7 2FeederleR,KostM,BaumannM,eta1.TheEpsteinBarrvirus lyticprogramiscontrolledbytheCO-operaticefunctionsoftWO transactivators.EMBOJ,2000;19(12):3080. 3PingfanLiu,SamuelH.Synergisticautoactivationofthe Epstein??Barrvirusimmediate.-earlyBRLFIpromoterbyRtaand Zta.Virology,2003}310(2):199. FengP,RenEC,LiuD.eta1.ExpressionofEpstein—Barrvirus lyticgeneBRLFIinnasopharyngealcarcinomalpotentialusein diagnosis.JGenVirol,2000I81(10)I2417. BollagDM,RozyckiMD,EdelsteinSJ.ProteinMethods.New York:Wiley—Liss,1996t68—69. ChangLK,STLiu.ActivationoftheBRLFIpromoterandlytic cycleofEpstein—BarrvirusbyhistoneacetylationlNucleicAcids Res.2000;28(20):3918. FengWH,WestphalE,MauserA,eta1.UseofadenoviruS vectorsexpressingEpstein??Barrvirusimmediate?-earlyprotein BZLFIorBRLFItotreatEBV—positivetumors.Virol,2002}76 (21)t10951. (2004一II一26收稿,2005—03—02修回) 编辑汤洁