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卡波氏肉瘤病毒(KSHV)K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探

2017-09-19 17页 doc 121KB 49阅读

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卡波氏肉瘤病毒(KSHV)K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探卡波氏肉瘤病毒(KSHV)K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探 卡波氏肉瘤病毒(KSHV)K1 蛋白在血管内 皮细胞中的表达及其功能初探 5 摘要:目的:获得稳定表达卡波氏肉瘤病毒(KSHV)K1 蛋白的人脐静脉内皮细胞(HUVECs), 探究 K1 蛋白对 HUVECs 增殖和迁移能力的影响。方法:从本实验室已构建好的含 KSHV K1 基 因 的 重 组 真 核 表 达 质 粒 pCI-neo-K1 中 扩 增 出 K1 基 因 , 克 隆 入 慢 病 毒 载 体 pHAGE-CMV-MCS-IZs-Gr...
卡波氏肉瘤病毒(KSHV)K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探
卡波氏肉瘤病毒(KSHV)K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探 卡波氏肉瘤病毒(KSHV)K1 蛋白在血管内 皮细胞中的表达及其功能初探 5 摘要:目的:获得稳定表达卡波氏肉瘤病毒(KSHV)K1 蛋白的人脐静脉内皮细胞(HUVECs), 探究 K1 蛋白对 HUVECs 增殖和迁移能力的影响。方法:从本实验室已构建好的含 KSHV K1 基 因 的 重 组 真 核 表 达 质 粒 pCI-neo-K1 中 扩 增 出 K1 基 因 , 克 隆 入 慢 病 毒 载 体 pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green 中构建重组质粒 pHAGE-K1。利用脂质体将 pHAGE-K1 与包 10 装质粒 psPAX2 和包膜质粒 pMD2.G 共转染 293T 细胞,收集培养上清经 0.45 μm 滤膜过 滤即获得慢病毒悬液。病毒感染 HUVECs,Western blot 检测 K1 蛋白的表达。通过绿色荧 光蛋白(GFP)流式分选、Western blot 验证获得稳定表达 K1 蛋白的 HUVECs。通过细胞增 殖实验和细胞划痕实验检测 K1 蛋白对 HUVECs 增殖和迁移能力的影响。结果:核酸序列测 定证实,克隆的 K1 基因全长 906 bp,与 GenBank 中登记的 K1 基因 100%同源。Western blot 15 结果显示,含 K1 基因的重组慢病毒感染的 HUVECs 在约 46 kD 处可观察到一特异性条带, 与预期的 K1 蛋白大小一致。流式分选获得稳定表达 K1 蛋白的 HUVECs 增殖能力与对照组 相比显著增强(P < 0.01),细胞迁移能力亦明显增加(P = 0.034)。结论:成功包装了含 KSHV K1 基因的重组慢病毒。KSHV K1 蛋白能够促进 HUVECs 增殖和迁移。 关键词:KSHV K1 蛋白;增殖;迁移 20 Expression of KSHV K1 protein in vascular endothelial cells and preliminary study on its function CHENG Xiaodong, XUE Min, HAO Tingting, QIN Di, LU Chun (Department of Microbiology and Immunology, Nanjing Medical University, NanJing 210029) 25 Abstract: Objective: To obtain human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) stably expressing KSHV K1 protein and explore the effect of K1 protein on the proliferation and migration ability of HUVECs. Methods: The fragment of K1 gene from expression plasmid pCI-neo-K1 was cloned into the lentivirus vector pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green, then the recombinant plasmid pHAGE-K1, packaging plasmid psPAX2 and envelope plasmid pMD2.G were co-transfected into 293T cells. Culture media were harvested and filtered through a 0.45 μ 30 m filter to remove the cells. The expression of K1 protein in recombinant lentivirus-infected HUVECs was detected by Western blot. Next, HUVECs stably expressing KSHV K1 protein were obtained by flow cytometry assay (FCM) screening and verified the expression of K1 protein by Western blot again. Finally, the effect of K1 protein on the proliferation and migration ability of HUVECs was detected by CCK-8 assay and wound-healing assay. Results: Nucleic acid 35 sequencing confirmed that cloned K1 gene was 906 bp, wihch was 100% homologous with K1 gene registered in GenBank. The exact band of K1 protein in recombinant lentivirus-infected HUVECs was detectable by Western blot. The results of CCK-8 and wound-healing assay showed that the proliferation and migration ability of HUVEC stably expressing KSHV K1 protein was 40 significantly increased than the corresponding control. Conclusion: The recombinant lentivirus carrying KSHV K1 gene was packaged successfully, and K1 protein could promote the proliferation and migration of HUVECs. Keywords: KSHV K1; proliferation; migration -1- 45 0 引言 卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)又称人疱疹病毒 8 型(human herpesvirus 8,HHV-8),是一种 γ2 型疱疹病毒,最初由 Chang 等从艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)相关的卡波氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma,KS)患者病损 组织中发现 [1]。研究发现,KSHV 感染与 KS、原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)和多中心 Castleman 病发生相关,其中与 KS 的关系最为密切[2]。KS 是一 50 种以血管细胞异常增生为特征的恶性肿瘤,好发于皮肤,可累及黏膜和内脏器官。KS 病灶 具有典型的组织学结构,分布大量的梭形细胞、炎性细胞及异常增生的新生血管[3]。尽管对 其梭形细胞的来源有争议,但是根据细胞表面标志特征,多数研究者认为梭形细胞主要来自 于内皮细胞[4]。 KSHV 作为 KS 的病原体,其编码的多种蛋白都与致瘤作用有关。如 KSHV ORF K1 编 55 码的 K1 蛋白[5],ORF K2 编码的病毒白细胞介素 6(viral interleukin-6,vIL-6)[6],ORF K9 编码的病毒干扰素调节因子 1(viral interferon regulatory factor 1,vIRF-1)[7],ORF74 编码 的病毒 G 蛋白偶联受体(viral G protein-coupled receptor,vGPCR)[8,9]等。其中致瘤蛋白 K1 是 KSHV 编码的 I 型跨膜糖蛋白,分子量约 46 kD,主要在病毒裂解期表达。K1 蛋白含有 289 个氨基酸,结构分为 N-末端信号肽胞外区、跨膜区和 C-末端胞浆区。胞浆区含有免疫 60 受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)[10]。目前已证 明,K1 可以通过 ITAM 的 C-末端 SH2 结合基序激活 PI3K/Akt 信号通路[10],促进细胞存活 [11,12] 。再者,K1 能够诱导血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在 内皮细胞和上皮细胞中表达和分泌,从而促进血管生成、增加肿瘤血管数和肿瘤大小[12]。 K1 还能够促进碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表达,有 65 利于血管形成[5,13]。此外,K1 也可以诱导基质金属蛋白酶 9(matrix metallo proteinase-9, MMP-9)在内皮细胞中表达,MMP-9 可促进胞外基质降解,使细胞与细胞以及细胞与基质 之间的联系减少,导致肿瘤细胞和内皮细胞迁移[14]。 本研究通过构建含 KSHV K1 基因重组慢病毒表达载体,包装 K1 慢病毒感染人脐静脉 内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),通过绿色荧光蛋白(green 70 fluorescent protein,GFP)流式分选获得稳定表达 K1 蛋白的 HUVECs,并初步探讨 K1 蛋白 对血管内皮细胞增殖和迁移能力的影响,为进一步研究 K1 蛋白的其它功能奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 慢病毒载体系统、质粒和细胞 75 1.1.1 慢病毒载体系统包括慢病毒克隆质粒 pHAGE-CMV-MCS-Izs-Green、包装质粒 psPAX2 以及包膜质粒 pMD2.G,均由武汉大学黄赞教授惠赠。含 K1 基因的重组真核表达质粒 pCI-neo-K1-Flag 为本实验室先前构建。人胚肾 293T 细胞为本室保存,人脐静脉血管内皮细 胞(HUVECs)按照常规方法培养。293T 细胞和 HUVECs 分别用含 10%和 20%胎牛血清的 80 DMEM 培养基来培养,培养基中加入青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 μg/ml)和庆大霉素 (50 μg/ml)。两种细胞在 37?、5% CO2 条件下培养。研究中所用的胎牛血清和 DMEM 培 养基均为美国 Gibco 公司产品。DH5α 感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司。 -2- 主要试剂 1.1.2 实验中所用的各种工具酶、蛋白预染 Marker 及核酸分子量 Marker(Lambda 85 DNA/EcoR I+Hind III)均为美国 Fermentas MBI 公司产品。质粒小量提取试剂盒、凝胶纯化 试剂盒为美国 Omega 公司产品。去内毒素质粒大量提取试剂盒为德国 Qiagen 公司产品。质 TM 2000 购自美国 Invitrogen 公司。鼠抗人 α-tubulin 单克隆抗体和 粒转染试剂 Lipofectamine 辣根过氧化物酶(horseradish peroxi-dase,HRP)标记的羊抗鼠/羊抗兔 IgG 购自美国 Santa Cruz 公司。兔抗 Flag 多克隆抗体(DYKDDDDK Tag Antibody)及用于免疫印迹(Western blot) 检测的增强化学发光( enhanced chemiluminescence, ECL)试剂为美国 Cell Signaling 90 Technology 公司产品。Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂购自日本同仁化学研究所。 1.2 方法 K1 基因的扩增 1.2.1 根据真核表达载体 pCI-neo-K1-Flag 中的 DNA 序列,利用 Oligo 6 软件设计上、下游引 95 物。上游引物序列:5' CGT CTA GAG CCA CCA TGT TCC TGT ATG TTG TTT G 3'(实线 部分为 Xba I 酶切位点、虚线部分为 Kozak 序列) ;下游引物序列:5' CGC GGA TCC TCA CTT GTC ATC GTC GT 3'(实线部分为 BamH I 酶切位点)。 以 pCI-neo-K1-Flag 质粒为,PCR 扩增 K1 基因。具体反应条件如下:94?变性 5 min, 然后 94? 1 min、62? 1 min、72? 1 min,扩增 30 个循环,最后 72?延伸 5 min。产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测,纯化后回收备用。 100 重组慢病毒转移质粒 pHAGE-K1 的构建与鉴定 1.2.2 用限制性内切酶 Xba I、BamH I 双酶切 PCR 产物回收片段,同时双酶切转移质粒 pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen。两个酶切产物纯化后用 T4 连接酶于 16?条件下连接过夜。 取适量连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞,随机挑选氨苄青霉素抗性菌落。先用质粒 105 小量提取试剂盒得到少量重组质粒进行 PCR 鉴定,进一步经基因测序正确后采用去内毒素 质粒大量提取试剂盒获得大量重组质粒,该质粒命名为 pHAGE-K1。 含 K1 基因重组慢病毒包装及病毒滴度测定 1.2.3 利用脂质体将 pHAGE-K1、psPAX2 和 pMD2.G 三种质粒按照 4:3:1 的比例共同转染 293T 细胞,转染 12 h 后更换为新鲜完全培养基。收取病毒液之前可利用荧光显微镜观察绿色荧 110 光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况。转染 48 h 后收集细胞培养上清,暂于 4? 保存;同时于 293T 细胞中补加新鲜完全培养基,24 h 后再次收集细胞培养上清。两次收集 的细胞培养上清充分混合经 0.45 μm 滤器过滤,即得到 K1 慢病毒(简称 K1)悬液,分装保 存于-70?。同时包装空载体作为阴性对照,即 Mock。 接种 293T 细胞于 24 孔板,第 2 天吸去原培养液,分别取 100 μl 不同稀释倍数的病毒 2 孵箱中孵育 2~3 液加入到相应孔的细胞中(每一稀释倍数设置 3 个复孔)。37?、5% CO115 h 弃病毒液,加入新鲜的 DMEM 完全培养基继续培养 72 h 后于荧光显微镜下计数绿色荧光 细胞。1 个发光的细胞即为 1 个转导单位(transducing unit,TU)。按下列计算病毒滴 度:病毒滴度(TU/ml)=(绿色荧光细胞数/视野)×(视野数/孔数)×病毒稀释倍数?病毒 体积。 -3- 120 K1 蛋白在 HUVECs 中的表达 1.2.4 将 HUVECs 接种于明胶包被的 6 孔板,培养 18 h后,吸弃培养基。加入一定量含 polybrene (终浓度为 8 μg/ml)的病毒液(K1/Mock)进行感染。病毒感染 2~3 h 后,吸弃病毒液,加 入完全培养基继续培养。于感染后 72 h 收取细胞,提取细胞总蛋白进行 Western blot,以抗 Flag 抗体为一抗,HRP 标记的羊抗兔 IgG 为二抗,检测 K1 蛋白在 HUVECs 中的表达。 125 获得稳定表达 K1 蛋白的内皮细胞 1.2.5 将 HUVECs 接种于明胶包被的 T25 细胞培养瓶,培养 24 h 后弃去培养基,用相同 MOI 的 Mock 和 K1 病毒感染细胞。感染 2~3 h 后,更换一次病毒液,进行二次感染(目的是获 得更多的阳性细胞),2~3 h 后更换为新鲜培养基终止感染。培养 72 h 后,以未感染的 HUVECs 为对照,进行 GFP 流式分选。提取分选后的部分细胞总蛋白进行 Western blot。 130 K1 蛋白对血管内皮细胞增殖的影响 1.2.6 流式分选获得稳定表达 K1 蛋白的 HUVECs(简称 K1 细胞)及对照 Mock 细胞。将细 孔板,待细胞达到约 90%汇合度时,撤去完全培养基,换为含 1%血清的培养基 胞接种于 6 饥饿处理 6 h。然后消化细胞,按 2 000 个/孔接种于 96 孔板。用 CCK-8 试剂盒按照其推荐 使用说明书检测细胞增殖情况。 细胞划痕实验 135 1.2.7 将细胞接种于 6 孔板,待细胞汇合,用无菌的 200 μl 移液器滴头沿培养板中间划痕。用 培养基洗去脱落的细胞,加入新鲜培养液继续培养。于 0 h 镜下划痕区相对距离,24 h 镜下观察划痕愈合情况。 1.3 统计学方法 _ 140 所得数据采用 SPSS13.0 软件进行统计学处理,实验结果以均数?标准差(x?s)表示, 统计分析采用 t 检验,p < 0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 K1 基因的 PCR 扩增 从重组真核表达质粒 pCI-neo-K1-Flag 中 PCR 扩增出目的片段 K1 基因,全长约 923 bp (图 1),与预期大小一致。 145 1: Marker 2:K1 图 1 K1 基因的扩增 Fig. 1 PCR amplification of K1 gene -4- 2.2 重组质粒 pHAGE-K1 的鉴定 150 质粒小提获得重组质粒,经 PCR 检测扩增出目的条带。将此重组质粒进行基因测序, 结果显示插入的外源基因序列全长 906 bp。经 Blast 比对表明,与 GenBank 中已登记的 KSHV K1 基因序列一致(图 2),引入的 Flag 序列正确无误。提示 K1 基因已被成功克隆到 pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen 载体中。 图 2 重组质粒 pHAGE-K1 部分测序结果 155 Fig. 2 Part result of sequencing of recombinant plasmid pHAGE-K1 2.3 慢病毒的包装及滴度测定 pHAGE-K1、psPAX2 和 pMD2.G 三质粒共转染 293T 细胞,48 h 在荧光显微镜下可以 观察到 GFP 的表达(图 3)。用梯度稀释法进行病毒滴度测定,经荧光计数法测得重组慢 160 病毒 K1 的病毒滴度约 3×106 TU/ml,对照 Mock 病毒滴度约 4×106 TU/ml。 左:白光视野 右:荧光视野 图 3 三质粒共转染 293T 细胞后 48 h GFP 的表达 Fig. 3 The expression of GFP in 293T cells at 48 h after three plasmids co-transfection 165 2.4 K1 蛋白在 HUVECs 中的表达 K1 慢病毒感染 HUVECs,72 h 后提取细胞总蛋白进行 Western blot,在约 46 kD 处出现 了一条特异性的条带,与预期 K1-Flag 蛋白大小一致(图 4)。提示,含 KSHV K1 基因的 重组慢病毒包装正确,且 K1 慢病毒可有效感染 HUVECs。 170 图 4 K1 蛋白在 HUVECs 中的表达 Fig. 4 The expression of K1 protein in HUVECs -5- 2.5 稳定表达 K1 蛋白血管内皮细胞的获得 175 HUVECs 经 K1 慢病毒感染,再经过 GFP 流式分选,获得了 GFP 阳性率近 100%的细胞 (图 5B),即 K1 细胞。以经 Mock 感染、GFP 流式分选获得的 Mock 细胞(图 5A)作为 对照。提取两细胞总蛋白进行 Western blot,结果显示,K1 细胞在约 46 kD 处出现了 K1-Flag 对应的特征性条带(图 5C),提示 K1 蛋白在流式分选后所获得的 K1 细胞中稳定表达。 180 A 185 190 B 195 200 C 205 210 A:流式分选获得的 Mock 细胞(左:白光视野;右:荧光视野);B:流式分选获得的 K1 细胞(左:白 光视野;右:荧光视野);C:Western blot 检测 K1 蛋白在 K1 细胞中的表达。 图 5 GFP 和 K1 蛋白在 K1 细胞中的表达 Fig. 5 The expression of GFP and K1 protein in K1 cells 215 2.6 K1 蛋白促进血管内皮细胞增殖 将 K1 细胞和 Mock 细胞按 2 000 个/孔接种于 96 孔板。分别于接种后 24 h,48 h,72 h 和 96 h,用 CCK-8 试剂盒检测细胞增殖情况。结果表明,从 48 h 起,K1 细胞增殖速度显 著快于 Mock 细胞,初步提示,K1 蛋白具有促进血管内皮细胞增殖的能力(图 6)。 -6- K1 组与 Mock 组相比, P < 0.01,n=5。 220 图 6 K1 促进血管内皮细胞增殖 Fig. 6 K1 promoted the proliferation of HUVECs 2.7 K1 蛋白促进血管内皮细胞迁移 225 细胞划痕实验中,取划痕后 24 h 的结果进行统计,以迁移到致伤区细胞所占的面积占 原划痕面积的百分比为统计对象。结果表明,K1 细胞迁移能力强于 Mock 细胞(图 7)。提 示 K1 蛋白具有促进血管内皮细胞迁移的能力。 K1 组与 Mock 组相比, P=0.034,n=5。 230 图 7 K1 促进血管内皮细胞迁移 Fig. 7 K1 promoted the migration of HUVECs 3 结论 本研究成功获得了稳定表达 KSHV K1 蛋白的 HUVECs,且初步证实了 K1 具有促进内 235 皮细胞增殖和迁移的作用。 -7- [参考文献] (References) [1] Chang Y, Cesarman E, Pessin MS, et al. 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