【word】 日粮血浆蛋白、肠道免疫系统及肠黏膜的屏障功能

【word】 日粮血浆蛋白、肠道免疫系统及肠黏膜的屏障功能 日粮血浆蛋白、肠道免疫系统及肠黏膜的屏 障功能 广东饲料第18卷第l0期2009年10月 日粮血浆蛋白\肠道免疫系统及肠黏膜的屏障功台邑 M.Moret6等着,公衍玲译,朱翠校 (1.华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;2.广东省农业科学院畜牧研究所,广州510640) 在断奶仔猪日粮中添加喷雾干燥的血浆蛋白 粉(Spray—driedplasma,SDP),能提高断奶仔猪的日 增重,日采食量和饲料转化率,减轻腹泻(Coffey等, 2OO1).许多有关感染致病菌(埃里氏大肠杆菌,沙门 氏菌,巴氏杆菌),病毒(轮状病毒,冠状病毒,白斑 综合症病毒)或原生动物(隐孢子虫)的研究发现: 给动物饲喂猪血或牛血来源的血浆蛋白粉,可降低 许多动物的死亡率和发病率,表明其可作为抗生素 的替代品(Quigley等,2004;Torrallardona等,2007). 加拿大某猪场的流行病学研究发现:日粮添加 血浆蛋白粉可降低由猪繁殖与呼吸障碍综合征和 猪?型圆环病毒所引起的死亡率(Dewey等,2006). 口服一种从牛血浆中分离出的约含有50%的IgG 的蛋F{组分,可改善儿童的病毒性胃肠炎(Guarino 等,1994),并已用于治疗艾滋病患者由于角虫感染 所引起的腹泻(Greenberg和Cello,1996).由此推 断,IgG是SDP发挥作用的主要原因fVanDjik等, 2001).然而,人的血浆中已被证实含有250多个肽 fAndre?SOil等,2002).SDP中的许多蛋白质在经过喷 雾干燥后仍显示生物学功能(Borg等,2002).尽管, IgG在SDP中发挥主要作用这一推断合乎逻辑,但 是,许多其他的血浆复合物在口服SDP时的各种 反应中可能也发挥作用 为丫更好地了解SDP在肠道免疫系统和肠道 屏障功能中的作用,利用大鼠的轻度肠道炎症模型 设计了一系列的实验.该模型基于大鼠感染金黄色 葡萄球菌肠毒素B(SEB),SEB是一种可激活肠黏 膜免疫系统的肠毒素,对有结构的GALT和弥散 GALT都有影响.SEB还增加了肠黏膜的渗透性, 增加了肠管中水的分泌,减少了小肠对葡萄糖的吸 收.本文的主要目的是为了更好地了解SDP在黏 膜水平上的作用机制以及SDP在肠道炎症反应中 的潜在调节机制.本文的第二个目的是比较SDP 和血浆蛋F1成分(PPF)的不同作用,PPF是从血浆 中分离出来的含有约50%IgG的物质(除去血浆中 大部分的纤维蛋白和白蛋白). 1肠道免疫系统 肠道是机体最大的免疫器官,肠黏膜免疫系统 与宿主和肠道菌群相互作用,在防止病原微生物的 入侵中发挥重要的作用.肠黏膜免疫系统通过表面 上皮的先天性免疫和获得性免疫来维持其稳态 fKiyono等,2004).80%的肠黏膜免疫系统是由肠道 相关淋巴组织构成,肠道相关淋巴组织在肠道中以 有结构的实体形式分布,由派尔集合淋巴结,孤立 淋巴滤泡和肠系膜淋巴结组成,或者以弥散的形式 分布,则由沿着上皮和固有层(1aminapropria,LP)散 在分布的淋巴细胞组成(Granger等,2006).两种 GALT在调节系统中分别发挥不同的作用,其中有 结构的GALT作为免疫反应的诱导部位,而弥散 GALT作为免疫反应的效应部位. 本综述的试验结果源自于SEB诱导的大鼠轻 度肠道炎症模型.对30日龄和33日龄的Wis— tar—Lewis大鼠腹腔注射抗原SEB,使之产生肠道炎 症反应,使得辅助性T淋巴细胞被激活,许多参与 炎症反应的细胞数量增加(P苣FeZ—Bosque等. 2004,2008b).在所有试验中,试验动物均在21日 龄断奶后分配到不同的日粮处理组,饲喂到35日 龄,然后将其杀死. SEB能诱导先天性免疫系统中的中性粒细胞 增殖(P6fez—Bosque等,2004)和嗜酸性粒细胞增 殖.日粮添加SDP并未改善SEB对中性粒细胞的 诱导作用,但减少了嗜酸眭粒细胞的数量和脱颗粒 程度(图1o日粮添加SDP或PPF后,抑制了抗原 SEB对集合淋巴结,固有层和上皮内的CD细胞 (如Th细胞)的诱导活化(P6rez—Bosque等, 2004,2008b;图2).这些结果表明:大鼠饲喂SDP 或PPF,能够降低SEB对辅助性T淋巴细胞的诱 导活化.活化的辅助性T淋巴细胞可释放一种细胞 ? 37? 广东饲料第l8卷第10期2009年10月 因子,进而放大先天性免疫系统和获得性免疫系统 (Mowat,2003). A ]门.-.豳.I. j由.?.卤.I. 图1在大鼠轻度肠道炎症模型中,日粮补充来源于猪血 的浓缩血浆(血浆蛋白粉,SDP)和血浆蛋白组分(PPF)对固有 层嗜酸性粒细胞的影响.图A表示对嗜酸性粒细胞数量的影 响,图B表示对嗜酸性粒细胞的活化作用,用颗粒脱落程度来 表示.号表示与对照组相比差异显着(P<0.05);号表示与 SEB组相比差异显着(P<0.05).以下同. 萎量 亳丢 l壹 ‘ l300 主耄z..8150 萎喜,oo 董As0 3驰.幽..CD25NKc表示固有层内每平方毫米的免疫细胞数. 8型T细胞亚群通过增加肠黏膜表面的淋 巴细胞和单核细胞数量流量来调节炎症反应 (Sohys和Quinn,1999).大鼠感染金黄色葡萄球菌 肠毒素B后,增加了派尔集合淋巴结和固有层中的 S型T淋巴细胞和以及上皮内的淋巴细胞.血 浆蛋白可减少派尔集合淋巴结和固有层中8型 ? 38? T细胞的数量,由此,证实了日粮中添加的SDP可 调节免疫反应的假说.但是,在日粮中添加PPF只 能够抑制SEB对固有层的作用(P6rez—Bosque等, 2004,2008b). Nofrarias等报道(2006)在猪的研究中了报道 了类似的结果,日粮添加的SDP减少了回盲淋巴 结中的8型T细胞,减少了白细胞在肠黏膜上 的渗透.这些结果与Jiang等(2000)日粮添加的 SDP降低了肠绒毛内固有层的细胞密度相一致. Noffarias等(2006)研究表明添加SDP对未受感染 的断奶仔猪的GALT作用也十分明显.社会,环境 和营养物质等因素的改变对仔猪造成的应激 (Pluske等,1997年),肠道炎症反应和全身性炎症 反应与这些应激有关(McCracken等,1999). 当机体受到感染时,炎性细胞因子的分泌上 调.这些炎性细胞因子作为化学诱导剂,可诱导黏 附分子的表达,黏附分子从而辅助应对感染的免疫 细胞定植.此外,细胞因子还可刺激免疫细胞的功 能成熟,进而对病原体作出应答(或识别).一组抗 炎细胞因子为了平衡炎性细胞因子,可抑制免疫反 应,从而防止自身的免疫系统伤害到宿主本身 (Lippolis,2008). 在大鼠的适度肠道炎症模型中,SEB感染导 致空肠黏膜中的肿瘤坏死因子d(TNF一仅)和干扰 素(IFN一)释放:~J[](Moret6等,2008).SDP和 PPF都能抑制SEB对炎性细胞因子的诱导释放作 用,表明日粮中添加的血浆参与炎症状态下黏膜细 胞因子平衡的改变.Bosi等(2004)也指出,SDP可 降低感染大肠杆菌K88的早期断奶仔猪肠道炎性 细胞因子的表达.二者一致认为:SDP通过抑制细 胞因子表达来调节免疫反应. 调节性T细胞(T—reg淋巴细胞)也具有免疫抑 制功能,其产生的细胞因子(如转化生长因子一B 和IL一10)不同于Th细胞和Th细胞.受到抗原刺 激后,T—reg淋巴细胞能够特异性地抑制辅助性T 细胞的免疫反应(Iijima等,2001;Janeway,2001). 我们实验室最近的研究结果表明,日粮中添加的 SDP可增加感染SEB大鼠肠道水平(PP结和肠黏 膜)及系统水平的IL—lO的分泌(Moret6等, 2008).这此结果证实了以下观点:SDP通过调节炎 性细胞因子和抗炎细胞因子的平衡来调节机体对 毒素和其他病原体的免疫反应. 32,o??{三伯0 吾亏Q 1uflo.}}tI.ul砷.山Bcol1?InBJ西心. 广东饲料第18卷第10期2009年l0月 2屏障功能 肠上皮的主要功能是作为一种选择性的屏障 允许营养物质的摄取,而阻碍毒素和微生物的入 侵.然而,肠上皮对肠腔中的内容物并不是完全不 渗透的,为此,溶剂和溶质从黏膜流向浆膜时要受 到严格的控制.肠黏膜的通透性主要取决于紧密连 接有效封闭顶端上皮细胞的能力.上皮细胞间隙被 一 种叫做claudin的内嵌蛋白所占据,此蛋白结合 到支架蛋白如ZO一1蛋白上,ZO一1蛋白再反过来 将其连接到网状的细胞骨架上(Ba~ett,2008).在 疾病状态下,尤其是当肠道受到肠腔抗原的感染 时,肠黏膜屏障功能将发生急剧变化. 肠』二皮的通透性受到若干刺激的调节.分泌性 腹泻与通透性的增加有关(Toivola等,2004).梭状 芽孢杆菌和弧菌分泌的毒素能改变一些紧密连接 蛋自的定位(Chen等,2002)或减少紧密连接的链 数(Sonoda等,1999).此外,肠毒素也可通过诱导炎 LL 80 60 20 O 廿Con打OI?SEB口SEB—SDP?SEB.PPF 02448 Timeafartreatrr~nt,h 图3在大鼠轻度肠道炎症模型中,日粮补充SDP和PPF 对粪便中水分含量(表示湿重百分比)的影响 我们观察到SEB使肠管中水分的含量增加,表 明SEB影响水的吸收和分泌的平衡(P6rez—Bosque 等,2004)图3表示:在第二次注射SEB后,日粮中 的SDP和PPF对肠毒素的抑制作用可达24小时, 而SDP在48小时后仍发挥效用.其他研究结果表 明:日粮添加m浆可改善动物的健康;例如,通过口 服来补充犊牛血清,可改善角虫感染所引起的腹泻 (Hunt等,2002),并可减轻冠状病毒对犊牛机体造 成的损伤(AahinOon等,2002). 肠腔内渗透压的改变(如养分吸收或排泄减 少)或黏膜通透性的改变引起了肠管中水的增加. 因为葡萄糖和氨基酸的吸收几乎不受不影响(见下 文),于是我们猜想可否用旁细胞通透性的变化来 解释对肠腔中水含量的变化的影响.为此,我们测 量了示踪剂的透壁流量和控制旁细胞通透的紧密 连接蛋白质的表达.采用两种示踪剂,荧光素异硫 氰酸酯一葡聚糖(FD,4kD)和辣根过氧化物酶 (HRP),分子量为40kD,与食物抗原蛋白类似. GontroISEBSEB-SDPSEB-PPF Treatment 图4在大鼠轻度肠道炎症模型中,日粮中补充SDP和 PPF对空肠通透性的影响.利用分子量为4kDa(FD)的荧光素 异硫氰酸酯,葡聚糖在整个肠壁上的跨膜流量情况来估测 肠道的通透性 sE显着增加了FD的跨膜流量;添加SDP和 PPF可抑制这一效应(图4).金黄色葡萄球菌肠毒 素B也促进了HRP的跨膜流量,而添加SDP和 PPF具有降低这种作用的趋势.然而,FD和HRP 的流量值存在显着的正相关关系,这表明:动物感 染肠毒素后,旁细胞途径有助于增加肠道中蛋白 质的跨膜运输.金黄色葡萄球菌肠毒素B降低了 ZO一1蛋白和B—catenin蛋白的表达,而这两种蛋 白质与FD流量呈负相关,这表明:在上皮细胞水 平上,葡聚糖流量的增加与ZO一1和8一catenin 表达的下降是两个平行的过程(图5).这些结果 表明:SEB诱导FD流量的增加与上皮紧密连接复 合体的减少有关;在日粮中添加SDP和PPF,在一 定程度上能改善了这一诱导作用(图5).SEB的 诱导作用与所描述的注射SEB小鼠的症状类似 (Lu等,1998).目粮添加的SDP和PPF可降低毒 素诱导的肠黏膜通透性增加,阻止病原微生物和 食物抗原进入肠道,进而阻断局部炎症反应(San一 ? 39? OOOO0OO O5O5O5 32211 c.N,ufao—oc?.参ll—a—EmId一仃c—l弓c一 广东饲料第18卷第10期2009年l0月 1OO 80 6O 口COn0I ?SEB ZO-1n-Calenin T.帕htiunctionoroteins 图5在大鼠轻度肠道炎症模型中,日粮中补充浓缩血浆 (血浆蛋白粉,SDP)和血浆蛋白组分(PPF)对上皮中的 ZO一1蛋白和p—Catenin蛋白在肠道水平上表达的影响. 这些影响主要是炎性细胞因子引起的,因为它 们是有SEB诱导产生的(Huang等,1998),而且促 进了抗原的旁细胞路途(Toivola等,2004).肠毒素 如SEB可刺激淋巴细胞分泌干扰素和 TNF—Ot,这两种细胞因子可分解紧密连接蛋白 (Nusrat等,2000)或降低其表达(Tsukita等,2002). 肠道通透性的增加会引发局部炎症反应,如溃疡性 结肠炎,炎症性肠病(McKay,2OO1). 3养分吸收 对于养殖场的动物,其肠道感染可能会引起肠 道炎症,肠绒毛萎缩或吸收障碍等,导致较高的死 亡率(vanDijk等,2002).在不同的动物模型中研 究了肠道炎症对养分吸收的影响.对于新生的大 鼠,角虫感染不影响其体内肽的转运(Marquet, 2007),但扰乱了AA的吸收,导致营养不良和生长 受阻,且无法通过自身清除寄生虫获得修复 (Topouehian等,2001).脂多糖(LPS)通过一个复杂 的细胞机制抑制了肠道对D一半乳糖的吸收,这个 机制可能涉及到刷状缘处与Na+耦合的葡萄糖和 半乳糖的转运体转录后的调控过程fSGLT1(A— mador等,20071.脂多糖还通过一个与TNF一仅有 关的机制来降低肠黏膜上的葡萄糖转运体一5的表 达,该蛋白是刷状缘上果糖的特异转运体 (GarcIa—Herrera等,2008).TNF—抑制了兔肠 道对D一果糖的摄取(GarcIa—Herrera等,2004), 而IFN一则下调了T斛细胞对D一葡萄糖的转运 (Yoo等,2000o这些研究结果表明,炎症过程中产 生的细胞因子参与调控养分运输蛋白的表达. 我们利用SEB模型研究发现,肠毒素并不影 响L一亮氨酸,L一蛋氨酸和L一赖氨酸盐酸盐的吸 ? 40? 收速率,但通过SGLTI降低了空肠中D一葡萄糖 的转运能力(Garriga等,2005).D一葡萄糖的转运 能力的下降是由于刷状缘膜上D一葡萄糖转运体 的表达减少引起的,如Vmax(最大转运能力动力 学常量)的下降.通过对SGLT1的免疫染色分析证 实了这一观点符合Ferraris等(1990)的观点. SGLT1免疫染色表明,该蛋白质在吸收性上皮细 胞上沿着隐窝一绒毛轴线分布,在绒毛顶端表达 量大于在中部和基底部的表达(图6).由此,得出 的结论是:我们所观察到的感染SEB大鼠体内的 D一葡萄糖转运动力学的改变是由于对SGLT1的 功能造成了特定的影响.SDP提高了SGLT1的最 大转运能力.PPF则起中间调节作用.Westernblot 的分析进一步证实了SDP对SGLT1表达的影响 (Garriga等,2005年). ApexMidBase Reclionofbrushbocder 图6在大鼠轻度肠道炎症模型中,日粮中补充SDP和PPF 对空肠刷状缘处的Na一葡萄糖转运蛋白,1表达的影响. 尽管SDP的作用机制尚存在争议;但有证据 表明,它可降低早期断奶仔猪因感染大肠杆菌K88 而引起的炎性细胞因子在GALT中的表达(Bosi 等,2004年).此外,我们实验室的研究表明,补充 的血浆可能会改变黏膜中的炎性细胞因子和抗炎 细胞因子的平衡(Moret6等,2008).这些研究结果 表明,SDP可能通过减少黏膜中的炎性细胞因子来 影响SGLT1的表达.黏膜炎性细胞因子可降低 SGLT1在体内的表达(Garcia—Herrera等,2004, 2008)和SGLT1在体外的表达(Yoo等,2000)已被SDP将使肠道对D一葡萄糖的吸收量提 高8%,9%.这个作用虽小但非常重要,在动物日 粮中添加SDP可提高其生长速率和饲料转化率 (Coffey等,2001) 4作用模式 SDP的作可能是可直接提高食物摄入量(例 如,通过改善适口性来增加采食量;Ermer等, 1994),或者是SDP以其他机制在管腔,黏膜和系 统水平上发挥问接的作用.vanDijk等(2001)就 SDP的管腔效应进行了报道,指SDP可增强肠 管的免疫活性,减少管腔抗原借助于血浆糖蛋白 与黏膜结合. lo? 图7该图总结了SDP或PPF的作用模式,食物蛋白抗原 和共生菌的产物均可被派尔集合淋巴结中的M细胞,固有层 中的树突状细~Ig(DC)或通过跨细胞途径(尤其是在发育的初 期阶段)所摄取,然后,被抗原提呈细胞转呈给初始的CDT细 胞,并将其激活被激活的淋巴细胞产生炎性细胞因子,放大免 疫反应,诱导炎症细胞进行修复发生炎症反应时,免疫细胞释 放活性氧(R0s),以消除入侵的病原体;但是.释放的活性氧物 质可能会导致肠道改变和组织损伤:日粮添加血浆蛋白可在管 腔水平上调节免疫反应(如对微生物的增殖,病原体的吸附进 行修饰);存在于血浆中的生物活性化合物也可以直接与黏膜 免疫细胞作用.血浆可通过诱导黏膜细胞因子发生改变来阻止 或逆转免疫系统激活所产生的有害影响.IEL=上皮内淋巴细 胞;T—reg=调节T淋巴细胞:APC=抗原提呈细胞:Thl=1 型辅助性T细胞:Th2细胞=2型辅助性T细胞 最近的研究结果表明,SDP对于生长性能的作 用机制涉及到对GALT的调节.Bosi等(2004)发 现,在受到感染的猪中,对于日粮中添加SDP的 猪,其炎性细胞因子的表达减少.我们实验室的研 究结果表明,日粮补充的血浆减少了黏膜中的炎性 细胞因子的表达(Moret6等,2008),降低了固有层 和上皮细胞中的活化的辅助性T淋巴细胞的表达 (P6rez—Bosque等,2008b).对黏膜细胞因子的这 些影响可用来解释:日粮添加的血浆降低了黏膜上 的炎症反应,以及SDP和PPF抑制了由SEB引起 的黏膜的通透性的改变(P色rez—Bosque等,2004), 紧密连接蛋白表达的下降(Prez—Bosque等, 2006)以及养分吸收的改变(Garriga等,2005). SDP和PPF可通过很多种可能的方式来调节 肠道免疫反应.浓缩血浆是一个复杂的混合物,包 含生长因子,细胞因子及其他生物活性化合物.这 些蛋白质可以与肠黏膜上的免疫细胞相互作用,从 而改变细胞因子的环境.最后,SDP测得比PPF影 响更多个变量,证实了这一假说:SDP含有的多种 蛋白质有助于SDP发挥作用(图7). 5总结和结论 血浆蛋白粉可降低对动物(如猪和大鼠)免疫 反应的过度激活,使更多的可利用能量和营养物 质用于生长和其他繁殖性能,而不是被转化用于 免疫反应.在SEB诱导大鼠轻度肠道炎症反应中, SDP可降低黏膜中的炎性细胞因子的产生,增加了 抗炎细胞因子IL—l0的数量.证实了这一假说, SDP通过增加IL一10的分泌来降低对黏膜免疫反 应的过度刺激. SDP在系统水平上同样发挥作用:例如,当猪 感染脂多糖时,它可降低炎性细胞因子在外周组织 中的表达(Touchette等,2002),并且,在LPS诱导 肺炎模型中,它还可抑制活化淋巴细胞数量的增加 (P6rez—Bosque等,2008a).因为有结构的GALT 是一个诱导位点,与局部和外周的效应部位(呼吸 道,腺体组织以及子宫黏膜)相接,可进一步推测, SDP可能会降低对广泛的共黏膜免疫系统的过度 刺激. 泽自’,ANIMSCI2009:87E92—100(<Dielaryplasmapro— teins,theintestinalinlmunesystem.andthebarrierfunctionsof theintestinalInucnsa>> ? 4l?