【doc】鼠抗人A1血型物质单克隆抗体特异识别抗原的特性研究

【doc】鼠抗人A1血型物质单克隆抗体特异识别抗原的特性研究 鼠抗人A1血型物质单克隆抗体特异识别抗 原的特性研究 7— 第24卷第5期 1992年9月 生物化学与生物物理 A0TABIOC~IMIOAetB10PHY8IOA8IN10A 8o?) Vo1.24.No.5 Sopt.,1992 鼠抗人A血型物质单克隆抗体 特异识别抗原的特性研究* 监整华堂 '安徽医科大学舟子生物学实验奎,虫物亿学教研宣.台肥23o08砷 摘要 }2?}{ 应用ELISA定量抑制试验,谢定3株鼠抗人AI血型物质单克隆抗体:D粥一.,B一 和Dm_?.抗原结台部位的互补结构.发现3株抗A1血型单克隆抗体仅被Al血型物质结合, 而不被B,H和L.血型物质结合.D蛐ElI结台部位互补于:aA13罾4踟乌 l1 Fuod B瞄—和D一结台部位互补于:a.mNA%3卢1o(GHI)8G..cHa.结果显示: F也 抗体识别抗原的能力与其抗原结台部位的空同结构有关:和血型抗原的差异与&-tri的 空间构象有关. 关键词抗体的抗原结合部位:单克瞳抗体:血型物质;酶联免疫测定法 稚 1911年VonDungerm,E.和Hirszfeld,L.发现A血型可分为强凝集的A1型 和弱凝集的A型,且A|型红细胞不与抗A抗体发生反应.A1和A.亚型血的这种差 异,起初被认为是由于亚型红细胞面抗原多寡所造成的.19竹年W8tkin8根据他的 研究发现:A基因又可区别为A1,A两个基因,它们所产生的糖基转移酶并非同一物质, 因此认为A,和A.型的差异不仅是量的问题,而且存在着质的不同.但质的差异究竟为 何?至今仍是一个谜.三株抗人A血型物质单抗的建立为应用单一抗体来研究抗原结 构的差异提供了新的途径.我们实验室应用ELI8A半抗原定量抑制法精确测定3株单 抗的结台部位互补结构,从而发现A血型抗原与A,血型抗原之间的结构有着明显的差 异. 材料和方法 1.抗A1血型糟质单克隆抗体s株抗人A1血型物质单抗杂交瘤株D.h, B52H,D24?.均由本实验室制备. 本文1991年6月10日收到.修改稿1991年8月6日收到. ?国家教委优秀青年教师基金和第三世界科学基金厦国家自然基金资助课题. 生物化学与生物物理学抒2i卷 2.血型物质研究所用的血型物质MsM(A1),Tj?phenol-insoluble(B),T~ghe phenol-insoluble(?)和N-1phenol—insoluble(Le)"均由Dr.RA.Kabat(美国 哥伦比亚太学)赠送. 3.单搪,寡糖抑制荆单糖:L一岩藻糖(F11,DL_半乳糖(Ga1),D—N一乙酰氨基半 乳糖(GalNA)购自Sigma;寡糖:A_七ri,B-%rl,01由Dr.RM.Ratchliff~(chembimo4. Oana~)赠送;Aetra,A—penta.i-hexa来自Dr.A,Lundblad(Sweden). 4:ELI8A试荆碱性磷酸酶,对硝基苯酚磷酸盐和戊二醛购自Sigma;亲和层析绝 化的羊抗鼠免疫球蛋一自(ZgS)购自KirkegardandPerryLaboratorie~Ino.Gaithe? rsburg,MdMD. 羊抗鼠IgS与碱性磷酸酶偶联物的制各,采用戊二醛一步法,适量的酶和抗体相 混,在0.05mol/LPBS中于4口a透析过夜.加为戊二醛使终浓度为0.2为,在室温下 搅拌反应2小时.再在上述缓冲溶液中4.a透析过夜.最后用5为BSA,0.05mol/I~ Trls/Mg/叠氮钠缓冲渡稀释到适当浓度.贮存于4. 5.BLIsA定量抑制试硷[用l:~g/ml血型物质溶液100pd/孔包被96孔酶标 板(pII7.2)4过夜.洗涤两次,以无抗原包被的孔作空白(A),加舯0/孔l%BSA (含有0.05%吐温—舯及O.O2%NaN8)室温下封闭半小时;洗涤两次后加入适度稀释的 抗A抗体5ol,再加入不同量的抑制剂(A),最后用0.Olmol/LPBS(pH7.2),调整每 孔溶液总体积为100l,小心混匀,以不含抑制剂孔作为标准孔(A8),37.a反应口一3小 时.洗涤两次,加入适当稀释的羊抗鼠Igs-碱性磷酸酶复合物100l/孔,37~C反应2,3 小时洗涤5次后,加对硝基苯酚磷酸盐溶液[3omg/5oml二乙醇胺缓冲溶液(pH9.8j1 100/孔,37~C反应l小时,最后加3NNa0H25~l/孔,终止酶促反应,在酶标仪上读 At06. 抑制剂的抑制百分率计算: 抑制作用一垒I二L_j垒×l0o为 结果 一 ,Ie—Et.,IHB52B一且I.血凝特挂鉴定 由血凝试验结果(表1)表明,3种单抗均能使A和AB型血细胞凝集,不能使0和B 型血细胞凝集.而..一n及D"a—n.两株杂交瘤所分泌的单抗,扩大培养上清液凝集 虬 亚型血细胞的效价高达舯48和1024时,对A.亚型血细胞仍不发生鞋集作用,表现出对 虬亚型血细胞的高度识别能力. =,A1血型物质对8种单抗凝集A型血细胞的特异抑制作用 血凝抑制试验结果(表表明,经过提纯的A血型物质MSM(A~)处理后,3种单抗 均失去了凝集A型血的能力,而经血型物质TijlIphenol-insoluble(B),Tighe phenol—insoluble(H),N_1phenolqnso~uble(Le)处理后,3种单抗凝集A型血纽 咆的能力,与未经处理的单抗能力相当.证明它们对A血型物质具有高度特异性. 5期鼠抗人山血型物质单克隆抗体特异识别抗原的特性研究409 Table1Hemagu七inaont~ersofmon~2onalanti一鱼【 Titer~withhumanehroc,七e日 Ab A1AjABB0 86.EI204832 B523一HB048一64 D蛳一1O48一3口 Tab2e2Inhibitionofhemagg2utination.n52002group8ubanc曲bymonov/on矗lanti~A1 Inhibition0fbleedgroupsubstances 皿BAb AiBHL D蝴.1.+ B5盥一+ D"0+ Symbolsusede:A1??吕? (A1);B,TLIphenol-insoluble(B);H,Tigbephenol-lnsolube(H);L旧?. N_1phenol—insoluble(L;+,g&伸昱i{;ni丘龃ntinhibitionwith.theanti—Am0no.】0叫;—.gaveno Idgnificantinhibitionwiththeanti-Amono~lona1. 40 囝 z:}f.1恃P毋— g.1Inhi~tionbyvariousg?haridofbindingofm~lsG lnOnC,32ona2an%i-AbybIc~xlgroupsubstanceMSbI(A~)10 ~ymbelsusedare:A,]~s6-EB.B623一?;0,D248咀.;?.11;O,0l;一.A-T~I| ?,A-Tetza;.A-penta;,A一~exa;一,A-Hep~a;e.6~aIXAc;0,D-g~al; ?,L-Fuo~,B--Tzi;?,HIE. 生物化学与生物物理24卷 Table3I?bit0ryactivityofoligosaeoharidesOD.binding .an~-Axtobloodgroupsubstance~ Oligc~-50%Inhibition(??De耐 Symbel日~ructurs ~accharide~242-HB523一HlrD:‰ 一 —I ?nGa1NAcal-*SGa1~1--*0(OH2)~-O000Ha8O18 (21.0%)l38.0%) o01alN—3Gal阻0(0?)rO.0a?311.4a860 镗 uC 一A-Tr/GalNAcal--~3al66.2口 隹O ?A一etraGa1NA?1Gal盟婚lO诒擒牲 Fuo A-pen~aGalNAc口I—+3GalB1蝣1o虬瓣蚰 仨仁』.ruc~'uO oA-HexaGalNA哪舶l皿31瞄Ac—曲al阻划k60b87孵.7 侄 'uc 臼A-HepbaGalNA叫l—蛸Gal阻3G1AqBl啐3阻—埘1c 仨任?O'?O TB—TG嘲【-*9Gal70001o5I125 f; Fn0 ?H—di—E——一一 eGalNAc——一—— 0D—Gal——一—— ?Lnc——一—— ELISAquantita丫einhlbitionassay? 三ELISA定量抑制试验结果 3株单抗的抑制曲线如图1所示.表3列出了在定量抑制试验中各种血型活性寡糖 以及为了得到50为抑制作用所需要的寡糖用量. 由表3可知,A一活性寡糖能抑制3种单抗与A1血型物质的结合,而活性寡糖,?一 活性寡糖则不能.从而进一步证实De丑?,D"a.及B一一n对A血型物质的高度特 异性. D.一a.及B一一a给出了非常相似的抑制曲线.人工台成的连接在脂肪链上的A一 活性三糖Ol是最强的抑制剂.当抑制作用达50为时,01需要量分别为11.4和3.8 (nmo1);与01寡糖结构相似的A-~rL其抑制作用达5O%时,需要量分别为66.2和9 (nmo1);11抑制作用则较弱.D248一日.在试验中当11的剂量高达80nmol时,仅产生 口1.0为的抑制作用.B5?一日?达刭50为抑制率时n需要量为18nmol,是O1需要量的 6倍. 5期鼠抗人A1血型物质单克隆抗体特异识别抗原的特性研究 其次,杂交瘤不同,其所分泌的单抗间的抑制曲线也有差异.主要表现在各种^-_活 性寡糖抑制作用的大小和顺序不同. D"s一丑l为O1>A—penta>A—tetr8>A—h0xa>一tri>11>A—hep~; B528一H1l为01>A-trY>A_七etrB>Ll>A-penta~A—hexa>A—heptao D一丑?的寡糖抑制曲线则显然不同.A一活性寡糖o1在3.8Nil.4(nmo1)范围内 无明显的抑制作用;活性寡糖A-te~ra是最强的抑制剂. 讨论 1.Da—H".a—H1.是首次获得的两株抗A1单克隆抗体白1975年杂交瘤技术 向世以来,国外许多实验室相继研制了一些抗人A血型单抗,均属抗A单抗.表4 列出其中已作了结台部位互补结构研究的3株单抗(Ao—1001,M?./6,AHIs).他们 的结果表明:3株单抗均能使Aa-RB0及Au-RB0发生凝集作用,但对AkA.血细胞凝 集作用的强弱有差异.Ac-1001及M?./BD两种单抗凝集Aa-RBO与ArRBo的效价 之比为2:1.A?"是以人胃癌细胞作免疫原制备的抗A单抗,识别A,A.血细胞的能 力有所提高,凝集ArRBa及A~-RBO的效价之比为l6:1.而我们实验室以提纯的Ai 血型物质MSM(AD为免疫原,由于免疫作了改进,研制获得的8株单抗特异性大大 提高.D一一Eu的A1与A2血细胞凝集效价之比为64:1.D.及B一一两种单抗则 仅对虹血细胞显示凝集作用,表现出对亚型血细胞有特异识剐作用.这是两株首次 获得的抗A1单抗,并将为研究A亚型血本质,为A血型抗体的抗原结合部位的结构研究 提供极好的材料.也为医学临床提供A亚型血分型试剂,故具有重要的理论和实践 意 义. 2.单抗结合部位互补结构琏A1,A抗原决定簇结构的差异我们应用ELISA定 量抑制试验法,进行A亚型血本质的研究.即利用各种具有不同血型活性的寡糖,单糖 为抑制剂,对A血型物质与抗A抗体的结合起竞争抑制作用.当抑制剂的抑制作用达 为时,所给出的最小荆量的抑制剂分子结构,被认为是互补于抗原结合部位的结构,因 此抑制剂的分子结构或空间构象可看作为抗原决定簇的结构. 分析ELI8A定量抑制试验结果表明,O1是D8n.及B一日1.两种抗A1单抗共同 的最强抑制剂,而D—丑?的最强抑制剂是Ae七ra.从而可以确定它们抗原结合部位的 互补结构是: TaMe4Hemagglut~nationtiterg碰monoelonalan~-A Ti~erswithhumanerhroc了te mAb A,AB0Ref0re?(糊 A._1.0l20481眙4l0 M?6D42048102"fl 冉】日旦5B168 生物化学与生物物理24卷 D艄8一H.及B嘲一m.互补于G8lNAol3G8l1O(O?)s0000~ Fuo岱 D286一互补于GalNA013G8I14G10 侣 Fuo 此外,由表4可知,ATE和A-tri分子中寡糖序列是一样的,不同的是前者与脂 肪链相连接.A?i—E和A—di—E分子中寡糖不同而接连的脂肪链却是相同的.它们对 A血型物质和抗A1抗体结台的抑制作用却差别甚大.一个较台理的解释是当A-tri连 结在脂肪链上后,可能引起了三糖空间构象的改变,使其与红细胞膜上天然状态的A抗 原决定簇结构更相吻台.这种解释与红细胞膜上的血型抗原是以糖脂形式存在的理 论相符.也与1977年Kaba%提出的A血型抗原的特异性与空间构象相关的说法相符 台.同时实验结果也显示出:Al和抗原的差异与A-_活性寡糖的前三个糖的空间构象 有关. 3.抗A单抗识别抗原的能力与抗体结合部位的互补结构有关比较表1和表4可 以看出:免疫原不同,免疫途径不同,制备得到的单抗识别抗原的能力亦不相同. 表5列出国外对Ac-1001,M?./6及AH1e3种单抗的ELISA定量抑制试验结 果表明,Ao—l00l和MHj/6最强的抑制剂是A-hep%a,给出5D%抑制作用时需要量为 Table5InhibitoryagtivityoHgharidesonthebinding anti一tobloodgroupsubstances ?%InhibitiD丑(哪册?f酣 SymbolOllgosae~azide吼run? A?A~-i001M?2/6D o01GalNAc砒—1加(o?0.o日t一勰够 恬 J1 Fue口 —A一NAO皿3aa180?2%5 帽 Jl Fue口 oA-Te~raG.alNO口1—?3GamGlO一18.5龉5 十2 Jl Fue 0—Pen~aGalNAc0a1日1GIo一4.615.8 背信 Fuc口Fue —竭母枷lc465.030 OA—n0矾GalNAeal-~@al皿哼3GlcNe田 恬 j1 Fue ?A一丑oDtaGamA眦删芦l_蚰GlcNA—鸹母—"GIe一8.74.8 十目十4 I1f1 F?ePue ELISAquantitativeinhibitionassay 5期鼠抗人A1血型物质单克隆抗体特异识别抗原的特性研究423 3.7和4S(nmo1);A?1日最强抑制剂是A-hexa,达50%抑制率时需要量为46nmol. 比较表3和表5可以得出特异性不同的单抗,抗体结台部位的互补结构也不相同,呈 现这样一个趋势: 对ArRBa的识别<AH1日<D2se-m,B~3-Hw MH 对A1一RBa的识别能力: . /6D4<A日1.< u3一H. 抗体互补的寡糖数:A-hepta>A-hex~>A—tetra>Atri-E 即抗A单克隆抗体的特异性,随着对A亚型红细胞识别能力的提高,构成A一活性 寡糖链的数目呈递减趋势.这显示出抗体的识别能力与抗体结合部位的结:构有密切关 系. 参考文献 f1】VonDunge~m,EundHizszfelL.,Uebergeuppenzpezifische~kturendesBeuile~.g.zmm". F,19J/,BJ526. 孔禄卿:A和B型的亚墅.血型血清学-1988,第一版,18页,群焱出版社.北京. 囊凌云等:抗Ai血型物质单克隆抗体的研制及其竟症学特性研究.中国免疲学杂志.1992年,待发表. Allen.P.Z.a?dKabat.E.ATIImmunocbemicalstudiesonbloodgroul~.3-.珊瑚,1959,82.840. 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KEYWORDS."AntigencembinJng舡伯:Monoe]ona]antibody;A1Blood groupSubstance;Enzyme-linkedi】nmun0BOrbenta~says