蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定方法 蛋白质含量测定法 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法(Biuret法)、Folin,酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10,20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑:?实验对测定所要求的灵敏度和精确度;?蛋白质的性质;?溶液中存在的干扰物质;?测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法(Bradford法)，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下: CH2COOH NH2 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6(25即得。 170 五种蛋白质测定方法比较如下: 二、双缩脲法(Biuret法) (一)实验原理 左右加热，放出一个分 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两 个分子脲经180? 子氨后得到 171 的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 H2O HN NH H2 紫色络合物 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材 1. 试剂: (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0(05N NaOH配制。 (2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4?5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6?4H2O)，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2. 器材: 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 (三)操作方法 1. 标准曲线的测定:取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫172 升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温(20~25?)下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的 含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定:取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法(Lowry法) (一)实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购)，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%)，硫酸纳(1%)，硝酸纳(1%)，三氯乙酸(0.5%)，乙醇(5%)，乙醚(5%)，丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。 进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达。通常测定范围是。 (二)试剂与器材 1.试剂 (1)试剂甲: (A) 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6?4H2O)。 溶解于500毫升蒸馏水中。 (B) 0.5克硫酸铜(CuSO4?5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将 173 50份(A)与1份(B)混合，即为试剂甲。 (2)试剂乙: 在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠(Na2WO4?2H2O),25克钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂(Li2SO4)，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤)。 稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。 (3)标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 —球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。 2. 器材 (1)可见光分光光度计 2)旋涡混合器 ( (3)秒表 (4)试管16支 (三)操作方法 1. 标准曲线的测定:取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为)。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温(20,25?)放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙(Folin—酚试剂)，同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。 注意:因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的。表中是每个试管要加入的量(毫升)，并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。 Folin—酚试剂法实验表格: 174 2. 样品的测定:取1毫升样品溶液(其中约含蛋白质20~250微克)，按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。 根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。 注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质)。 四、改良的简易Folin—酚试剂法 (一)试剂 0.1%酒石酸钾 1. 试剂甲:碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。 2. 试剂乙:与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。 3. 标准蛋白质溶液:同基本法。 (二)操作步骤 测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55?恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。 改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法(即Lowry基本法)相接近的结果。 五、考马斯亮兰法(Bradford法) 175 (一)实验原理 双缩脲法(Biuret法)和Folin—酚试剂法(Lowry法)的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置()，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是: (1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质,染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是: (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 —球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。 (3)标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 (二)试剂与器材 1. 试剂: (1)标准蛋白质溶液，用 —球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 (2)考马斯亮兰G—250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 2. 器材: (1)可见光分光光度计 176 (2)旋涡混合器 (3)试管16支 (三)操作方法 1. 标准方法 (1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。 (2)加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。 注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表格: (3)用标准蛋白质量()为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。 2. 微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时(10,),可将取样量(包括补加的水)加大到 177 0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G,250试 剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。 六、紫外吸收法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。 下面介绍四种紫外吸收法: 1. 280nm的光吸收法 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂(水或缓冲液)作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值(A11cm)有文献数据可查，根据 ,此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与(A11cm)值(即 ,蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值)的关系。文献值A11cm,λ称为百分, 吸收系数或比吸收系数。 蛋白质浓度 浓度 178 ,1cm,280nm (mg/ml) 例:牛血清清蛋白 : A1 溶菌酶 : A1 ,1cm=6.3 (280nm) ,1cm=22.8 (280nm) 若查不到待测蛋白质的A1,则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含1cm值， 量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白(BSA)。 标准曲线的测定:取6支试管，按下表编号并加入试剂: 用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量(mg)为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1 2. 280nm和260nm的吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克)，但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常: 纯蛋白质的光吸收比值: 纯核酸的光吸收比值: 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A280,0.74×A260 (mg/ml) 179 ,1cm,280nm 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。 3. 215nm与225nm的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 用已知浓度的标准蛋白质，配制成20,的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差: 吸收差,A225 以吸收差为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。 本方法在蛋白质浓度范围 本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。 参考文献 1、Boyer, Rodney F. Modern experimental biochemistry 1986, 55-59页 2、蔡武成、袁厚积主编:生物物质常用化学分析法，1982年，93~99页 3、张龙翔、张庭芳、李令媛等编著，生化实验方法和技术，1981年，164~169 页，高等教育出版社 4、Bradford M.Anal Biochem ,72,248(1976) 180