【doc】 甘草酸单铵配伍复方丹参注射液预防大鼠子宫角粘连及其对大鼠免疫机能调节作用的研究

【doc】 甘草酸单铵配伍复方丹参注射液预防大鼠子宫角粘连及其对大鼠免疫机能调节作用的研究 甘草酸单铵配伍复方丹参注射液预防大鼠子宫角粘连及其对大鼠免疫机能调节作用 的研究 中国中医药科技2005年9月第12卷第5期Sep.2005Vd.12No.5?289? 甘草酸单铵配伍复方丹参注射液预防大鼠子宫角 粘连及其对大鼠免疫机能调节作用的研究 王莉于俊荣樊瑞琴刘效群齐惠敏 (石家庄第四医院?石家庄o50lD11河北省计划生育科学技术研究所?石家庄o50lD11) 摘要目的:观察甘草酸铵盐(~LAG,Monoanarnomm~hemte)配伍复方丹参注射液对大鼠子宫角粘 连的预防作用和对大鼠免疫机能的影响.:参照Leach,Yamn等方法加以改良制作大鼠子宫角粘连模 型.观察各组粘连评分,腹腔液白细胞计数,测量腹腔液细胞因子白细胞介素(几)一2,肿瘤坏死因子 (,IT)一a,取粘连组织做病理;胸腺完整取出测胸腺指数,cD4标记率,CD8标记率及C_JM/CD8比值.结 果:与模型组比较,~LAG,MAG伍用复方丹参,Dex明显降低粘连评分及严重粘连百分率(P<0.01);单用复 方丹参未降低粘连评分.病理学检查提示~IAG抗炎作用与D类似, 复方丹参无抗炎作用.与模型组比 较~LAG组,Dex组降低白细胞计数,而复方丹参及~LAG加复方丹参组提高白细胞计数(P<0.01).与模型 组比较,Dex组明显降低胸腺指数(P<0.01).与模型组和Dex组比较,MAG组明显升高腹腔液几一2水平 (P<0,o5),其它各组无此作用;模型组比空白对照组显着升高腹腔液,IT一a(P<0.01).模型组cDd, cD8标记率明显降低(P<0.01);复方丹参,MAG加复方丹参组均提高cD4,标记率(P<0,01),提 高cD4/cD8(P<0.01).结论:MAG,MAG加复方丹参具有明确的抗炎,抗粘连作用,与D相当,并且 具有调节免疫力的作用,两者合用抗粘连作用优于单用~LAG. 主题词盆腹腔粘连/中医药疗法@甘草酸单铵/治疗应用丹参注射液/治疗应用盆腹腔粘连/病理 学免疫,细胞大鼠 本研究将5mg/kgMAG及1rlk复方丹参两者配伍,探 讨其预防大鼠子宫角粘连的作用及其对大鼠免疫调节作用 的影响. 1实验材料 1.1药品甘草酸单铵盐(~LAG,鹿梁公司提供,批号 200010),地塞米松磷酸钠注射液(Dex,天津药业涟水有限公 司,批号:01o4134),复方丹参注射液(广东博罗先锋药业集团 有限公司生产,批号:010909).白细胞介素(几)一2,肿瘤坏 死因子(TNF)一a放射免疫测定药盒,购自北京东亚免疫技 术研究所;抗体cD4和抗体cD8(小鼠抗大鼠),羊抗鼠I一 FITC,美国BECTONDIC~N公司生产. 1.2实验动物二级雌性SD大鼠,体重169,259g.购自河 北医科大学实验动物中心,饲养于河北医科大学附属第二医 院动物中心,室温23—24?,普通饲料,不限饮水,饲养1周 后进行实验. 1.3药物与试剂的配制MAG:以生理盐水溶解MAG配制 成0.o5%溶液充分混匀备用.复方丹参注射液:单用时稀释 10倍,但与~LAG混用时溶于其中.取Dex4omg加生理盐水 至40orI1l备用.配置0.5%戊巴比妥钠溶液. 2实验方法 2.1动物分组及处理方法取健SD雌性大鼠59只,体重 2oo,250g,随机分为6组,每组9—10只,每组给予约l0Ird// l(g药物,粘连对照组给予Ns10rll(g,对照组给予Dex lm~k,及空白对照组不作任何处理.实验组分别给予~L 5mg/,复方丹参1Ird//,~L5m+复方丹参lIrd//. 2,2大鼠子宫角粘连模型制备参照Leach子宫角粘连模 型加以改良l.将大鼠用0.5%戊巴比妥钠40ms/~腹腔注 射麻醉后,固定于大鼠解剖台上,腹部去毛,碘伏消毒后,沿 下腹正中切口3.0cm,逐层打开腹腔,提出一侧子宫角于子宫 再分叉处1cm开始,沿子宫浆膜非系膜侧磨擦,先用外科纱 布磨擦12次,再以刀刃刮擦12次,用力均匀适中,无活动性 出血,有普遍性红斑,对侧子宫角同法处理.将双侧子宫角 还纳于腹腔,关腹前予相应的药物灌腹,各组均给予容量约 10ml/kg药物,术后第7天L4J,以颈椎离断法处死,立即腹腔 注射生理盐水5rI1l,按摩30次,迅速打开腹腔,二次开腹以蓝 芯注射器抽吸腹腔液,进行白细胞记数.腹腔液离心取上清 保存于一70?待测几一2,TNF—a水平.将双侧子宫进行粘 连评分记录,切下处理的子宫角粘连部位送检,做组织形态 学观察.沿胸骨两侧打开胸腔上翻胸骨角,暴露出胸腺,以 眼科无齿镊小心剥离胸腺,称重,取黄豆大小剪碎,置于1% 甲醛缓冲液固定,待检cD4,cD8标记率. 2.3各项指标检测方法 2.3.1IL一2,TNF—a按药盒说明操作,实验前取腹腔液样 品1rI1l冻干以0.1rI1l生理盐水融解. 2.3.2胸腺组织C~/CD8流式免疫荧光标记法检测.参照 左连富流式细胞学方法…. 2.3.3粘连评分标准参照L髓ch等子宫角粘连评分标准. 2.3.4白细胞计数同血白细胞计数. 2.4统计学方法用SPSS统计学软件做ONENVAYAN0VA一 工JSD和Y2检验.结果采用均数?标准差和百分率表示. ? 290?中国中医药科技2005年9月第12卷第5期Sep.2005Vo1.12No.5 3实验结果 3.1大鼠一般状况及子宫角粘连评分见表1. 各组大鼠术后24h内均开始正常进食和饮水,治疗期间 除Dex组外其它组3天内伤口全部愈合,而D旺组大鼠伤口 均愈合不良,红肿,有食欲下降,体重增长较慢或下降等现 象,Dex组10天大鼠中有1只因术后6天灌胃不当造成肺水 肿死亡,其它未见异常.各组粘连评分结果见表1. 表1各组粘连评分的比较(;?s,分) 与模型组比较*P<0.O1;与DEX组比较?P<0.05 3.2组织病理学检查空白对照组表面单层上皮组织层完 整,各层组织无炎细胞浸润;模型组光镜下子宫角浆膜层消 失,代之以大量脂肪结缔组织,部分可见肉芽组织及纤维细 胞增生,肌层,固有层纤维变性,胶原变性,固有层大量炎细 胞浸润,小血管充血,水肿(见图1,3).MAG组光镜下表面 无或极少量纤维组织附着,无肉芽组织增生,固有层极少量 炎细胞浸润(见图4,5).复方丹参组表面有纤维结缔组织 附着,问皮细胞增生明显,固有层中度白细胞浸润,水肿(见 图6,7).MAG+复方丹参组表面少量纤维附着,固有层少 量白细胞浸润(见图8).D旺组表面无纤维附着,表面单层 问皮层覆盖,组织无变性,坏死,白细胞极少见(图9,10). 3.3腹腔液白细胞计数与空白对照组比较,模型组白细 胞计数明显提高,(P<O.01);与模型组比较,MAG组,Dex组 白细胞计数明显降低,复方丹参组及MAG+复方丹参组白细 胞计数均升高(P<0.01),见表2. 3.4胸腺称重指数见表2. 表2各组腹腔液白细胞计数及胸腺称重指数的比较(;?s,分) 与模型组比较*P<O.O1;与空白对照组比较AP<O.05;与DEX 组比较##P<O.05 3.5大鼠胸腺组织CD4,CD8标记率的比较见表3. 表3大鼠胸腺组织CD4,CD8标记率的比较(;?s) 与空白对照组比较Ap<0.01;与模型组比较*P<0.01 3.6腹腔液皿一2,TNF—d水平的比较见表4. 表4腹腔液IL一2TNF—a水平的比较(;,4-s) 与空白对照组比较AP<O.O1;与模型组比较*P<O.05;与DEX 组比较##P<0.O1 濑瓣一)姚100)HE100贼r,(,羹渊?可见巨噬细胞(×)灾肥技调.LHE×1wJ . ?丛一:’0j 图6表面不完整,覆盖 纤维结缔组织(HE×100) 图7固有层水肿,中量 白细胞浸润,血管扩张充 血(HE×400) 差篥蠹磊霪HE’细胞浸润c呱?轻度水肿,少量白细胞浸极少的白细粘 连百分率为100%.与空白对照组比较,模型组腹腔液白细 中国中医药科技2OO5年9月第12卷第5期Sep.2005Vo1.12No.5?291? 胞计数显着增多,TNF—a水平显着提高,组织的病理学改变 也证实其炎症反应明显.说明本实验大鼠子宫角粘连模型 符合实验要求,与以上理论相吻合. MAG在本实验中再次体现了其抗炎,抗粘连形成的作 用,可能通过以下几个机制发挥作用.?可降低毛细血管通 透性,减轻肉芽且织增生-5J.实验中腹腔液白细胞计数明显 低予粘连对照组,而病理改变也证实MAG组渗出至局部组 织中的白细胞明显减少.?MAG明显提高IL一2水平, 等报道MAG提高IL一2产物和儿一2R表达,而李铁 民-7J等报道MAG可促进IL一2增强NK活性,这种增强作用 与MAG浓度有关,IL一2可刺激自然杀伤细胞(NK)生长,并 增强它的溶细胞活性与细胞的杀肿瘤细胞活性,IL一2是 T细胞主要的自分泌生长因子,作用于人类B细胞既可以作 为生长因子又是抗体合成的刺激物-8J.应用IL一2治疗感 染性疾病亦取得一定疗效-9J.以上均提示MAG可通过提高 IL一2水平发挥抗感染和调节免疫功能.?MAG明显降低 TNF—a水平.?最近R丑0[1o]等指出甘草甜素与唾液酸化的 路易斯寡糖(Sialyl—LewisX,SLex)在结构上最相近,甘草甜 素抑制选择素与Sex结合,因而抑制了最初炎症反应.?而 M砌jci0l11J等指出甘草甜素能与凝血酶阴离子结合位点一1 结合,发挥凝血酶抑制作用,其抗炎作用与抗凝血作用部分 相关.?文献报道MAG有免疫调节作用,结构近似类固醇, 体内可能存在一个与甾体激素受体相连的细胞内受体而在 体内发挥糖皮质激素的调节作用:抗炎,抗变态反应等_】. ?MAG能非特异性增强巨噬细胞的活性,包括吞噬活性和分 泌免疫调节介质的活性(NO及IFN一7)-】,抑制巨噬细胞分 泌前列腺素-】.而粘连程度与前列腺素水平有关,加 入前列腺素E2可诱导粘连形成_】5l.其它方面:MAC还有强 大的抗纤维化作用,静止时呈凝胶状态-13_,可起屏障作 用.MAG可抑制磷脂酶A的活性,使溶酶体膜稳定,显示其 抗损伤,抗氧化,清除氧自由基作用_】.MAG是透明质酸酶 抑制剂,具间接提高透明质酸的作用l18],而透明质酸(HA)抗 粘连形成作用已得到广泛共识-】9l. 本实验仅在几个方面探讨了MAG抗粘连形成机制,因 复方丹参注射液具有抗纤维化,提高纤溶,抑制胶原蛋白合 成及中医认为的活血化瘀等作用,临床曾证实二者合用有协 同抗纤维化作用J,因此将二者合用,以期观察其更好的抗 粘连作用.实验证实合用后有协同抗炎,抗粘连作用,且明 显体现在co4,CD8标记率及C04/CD~这些免疫指标上. CD4T细胞和CD8T细胞的比例可视为TH,CD4/CD8在 免疫系统中具有重要调节作用-8J,MAG+复方丹参,复方丹 参提高cD4,cI)R标记率及提高CD4/CD~.二者合用提高 免疫力,可发挥中药对免疫的双向调节作用-2”. 综上所述,本研究进一步证明了术后粘连形成过程与炎 症反应过程和免疫反应密切相关的理论;且初步探讨了MAG 发挥抗炎,抗粘连形成作用的机理,证明了MAG和复方丹参 两者伍用,发挥两种药物免疫双向调节作用,较单用MAG增 强抗炎,抗粘连作用,但单用复方丹参不具抗炎,抗粘连的作 用;MAG,MAG+复方丹参抗炎抗粘连作用与Dex相当,但无 Dex明显降低胸腺称重指数,胸腺坏死,伤口不愈合等作用. 参考文献 1左连富.流式细胞术与生物医学.沈阳:辽宁科学技术出版社, 1996:240. 2OzoguiT,TurkeyT,Bayk~A,eta1.Anexperimentalstudyoftheeffect0f aprotininONintestinaladhesionformation.AmJSurg,1998;75:137. 3KaidiAA,GurehumelidzeT,NazzalM,eta1.Tumornecrosisfactor一口:A mltllKerforperito~adhesionformation.JSurg,1995;58:516 4I-IaneyAF.Identification0fmaerophagesroleforperitonealinjury: evidencesupportingadirectroleforperitonealrT1ac10pha8esinhealing injuredperitoneum.FertilSteril,2ooo~73(5):988 5黄能慧,李诚秀.罗俊,等.甘草酸铵的抗炎作用.贵阳医学院学 报,1995;2o(1):26 6丑langYH,KatoM,IsobeKI,eta1.Dissociatede~atrol0fglyeyrrhizin0f proliferationandIL—-2productionandIL—-2productionnlurirlethymoeyte cel1.Iminunol,1995;162:97 7李铁民,梁再斌.甘草甜素免疫调节作用研究进展.中草药, 1993;24(10):553 8林学玲,张玲.现代细胞与分子生物学.北京:科学出版社,1999: 248 9龙振洲.医学免疫学.北京:人民卫生出版社,1994:133 10RaoBN.AndersonMB,MusserJn.eta1.Sialyl—lewisxmimicsderived fromaphannacophoresearcharesdectinInhibitorswitl1anti— inflammatoryactivity.JBiolChem.1994;269(31):19663 11MararieioI,FrancischettlB.MonteiroFtQ,eta1.Ide~fication0f glycyn-hizina8athrombininhibitor.Bi~hemBiophysR?Corramm. 1997;235(1):259 l2李铁民,梁再斌.甘草甜素免疫调节作用研究进展.中草药. 1993;24(10):553 13胡金铎,沈风嘉.甘草在医药等方面的深度开发及综合利用. 中草药.1995;26(1):39 14任骏,甘草酸铵对前列腺素,F2a合成的影响.科学通报, 1988;(3):227 15CelebigluB.E8lambd】liNR,OlcayE.eta1.rIlaeeffect0ftenoxicamon intraperitonedadhesionsandpro~aglanclinlevelsinmice.Anesth Analg.1999~88(4):939 16王吉耀.刘维田,胡美玉.甘草酸对成纤维细胞I,?型前胶原 mRNA表达的抑制作用.中华消化杂志,1997;17(1):6o 17张坚松,廖春梅,王智.强力宁对家兔心肌缺血再灌注损伤时红 细胞内MDA及血浆中Tx,6一keto—I’CF2含量的影响.湖南医 学高等专科学校,1999;1(2):1 18FuruyaT,YamagataS,ShimoyamaY,eta1.Biochemicalcharacterization 0fglycy~zina8aneffectiveinhibitorforhya1uIDnidasesfrombovine testis.BiolPharmBull.1997;2o(9)-973 1911aomtonMH,JohnsDB.Carr)eauJD.eta1.Clinicalevaluationof0.5% ferrichyaluronateadhesionpreventiongelforthereductionofadhesi0rIs followingperitonealcavitysurgery:open—labelpilotstudy.HumReprod 1998;13(6):1480 2o于忠省,王玉刚,王铁军.强力宁合用复方丹参抗纤维化的疗效 观察.临床肝胆病杂志,1999;15(2):116 2l王芗斌.郑家铿.中医药免疫的双向调节及机制探讨.福建中 医学院;1998;8(2):40(修回:2005—05—18)