【DOC】尿脱落细胞HPV16／18E7基因表达对膀胱移行细胞癌诊断价值的研究

【DOC】尿脱落细胞HPV16／18E7基因达对膀胱移行细胞癌诊断价值的研究 尿脱落细胞HPV16,18E7基因表达对膀胱 移行细胞癌诊断价值的研究 临床泌尿外科盘查旦笙鲞篁塑?455? ? 实验研究? 尿脱落细胞HPV6/18E7基因表达对膀胱 移行细胞癌诊断价值的研究 王栋苏泽轩肖亮生.岑松黄卫王阳 [摘要]目的:探讨尿脱落细胞高危型人乳头状瘤病毒16,18E基因(HPV,s,l8E7)在膀胱移行细胞癌中的 表达.方法:利用聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)和特异性核酸内切酶技术对60例膀胱移行细 胞癌患者的尿液标本进行研究.结果:膀胱移行细胞癌I级,?级和?级HPVe的检出率分别为73.7,78.5 和92.3%,总的检出率为80.0(48/60);HPV检出率分别为73.7,71.4和84.6,总的检出率为75.0 (45/60)由此可知,HPV,的检出率差别无统计学意义(P>0.01),但膀胱移行细胞癌?级的检出率最高(P <0.05).结论:尿液中HPVE基因的检测可作为膀胱癌早期诊断的一种方法. [关键词]膀胱肿瘤;癌;人乳头状瘤病毒;尿液;诊断 [中图分类号]R747.14[文献标识码]A[文章编 号]1001—1420(2006)06—0455—03 Adiagnosisvaluestudyofthegeneexpressionofhumanpapillomavirus (HPV)16/18E7inurinecast-offcellsoftransitionalcellbladdercancer WANGDongSUZexuanXIA0Liangsheng. CENSongHUANG肌WNGng (DepartmentofUrology,thePeopleSHospitalofHainanProvince,Haikou,570000,Chi— na;DepartmentofUrology.theFistAffiliatedHospitalofJinanUniversityMedicalCol— lege;.DepartmentofUrology,theCentralHospitalofShantouCity) Abstract0bjective:Toinvestigatethegeneexpressionofhumanpapillomavirus(HPV)16/18E7inurine cast—offcellsoftransitionalcellbladdercancer.Methods:60sampleofurinecast—offcellsoftransitionalcellbladder cancerhadbeendetectedbythepolymerasechainreaction(PCR)usingspecialprimerandDNArestrictionendo— nucleasetechnique(DNARET).Results:Of60transitionalcellbladdercancer,80.0(48/60)werepositivegene expressionforHPV16DNA(amongthem,73.3foronegradetransitionalcellbladdercancer,78.5for,two gradetransitionalcellbladdercancer92.3%threegradetransitionalcellbladdercancer)and75(45/60)were positivegeneexpressionforHPV18DNA(amongthem,one,twoandthreegradetransitionalcellbladdercancer were46.7,66.7and44.3%respectively).Conclusions:Ourdatasuggestthathumanpapillomavirusisunlike— lytobeinvolvedinthepathogenesisoftransitionalcellcarcinoma,itisprobablyaearlierdiagnosismethodsin transitionalcellcarcinomabydetectingHPV16,】 8E7inurinecast-offcellsoftransitionalcellbladdercancer. KeywordsBiddertumer;Cancer;Humanpapillomavirus;Urine;Diagnosis 膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,早期诊断 是提高其疗效的关键.研究表明,高危型人乳头状 瘤病毒16,18基因(HPV-.)与膀胱癌关系密 切n.有关HPV..与膀胱癌关系的回顾性研究 较多,但尿脱落细胞HPV..在膀胱移行细胞癌中 的诊断价值研究尚未见报道.我们利用聚合酶链 反应(Polymerasechainreaction,PCR)和特异性 核酸内切酶技术对6O例膀胱移行细胞癌患者的尿 液标本进行研究,现将结果如下. 1材料与方法 海南省人民医院泌尿外科(海口,570000) 暨南大学医学院附属第一医院泌尿外科 .汕头市中心医院中心实验室 1.1实验材料 实验组6O例,男43例,女17例.按WH0分 级:I级19例,?级28例,?级13例;按 UICC分期标准:Tl22例,T:27例,T.11例.对照 组2O例,为自愿正常成人的尿液标本. 1.2实验方法 实验主要试剂:HPV.阳性克隆(由北京医 科大学分子病理研究室惠赠),蛋白酶K,四种脱氧 三磷酸核苷酸(dNTP),核酸内切酶Pvu?和Hinf I(购于加拿大Sangon生物公司),Taq脱氧核苷 酸聚合酶(TaqDNA聚合酶)(购于美国Gene公 司). 实验主要仪器:聚合酶链反应基因扩增仪(美 ? 456? 国PE公司9600型),加样枪(法国产),电泳仪(国 产)以及各种反应管(200IPCR反应管为美国进 口PCR专用薄壁试管),M750--B型多功能紫外分 光光度计(国产). 引物设计及合成:由国际生物技术情报中心 JournalofClinicalUrology,』!! (Internet)提供HPVl6’l8E7基因序列.利用美国生 物医学基因研究中心的引物设计软件Primer一3设 计出下列两对引物(表1),由上海生工生物工程公 司合成. 表1PCR引物和核酸内切酶碱基序列及位置 主要试验过程:?标本DNA的制备:收集每 个研究对象早晨新鲜尿液100ml,离心15min后 加入Carnoy氏固定液后再离心,中间层即为上皮 细胞.用常规蛋白酶K消化,苯酚/氯仿抽取 DNA,醋酸及冰乙醇沉淀DNA,干燥,Tris一盐酸缓 冲液(TE)溶解,同时用紫外分光光度计测定DNA 含量.作为DNA,置于一4?保存备用.? 基因扩增:取模板2l,每对引物各2l(1/lmol/ L),dNTP5tA(200mol/L),5×缓冲液10”l(含 Mg1.5mmol/L),去离子三蒸水30.5l,总反应 体积49.5l,置美国PE一9600基因扩增仪95?预 变性10min后,于8O?时加入TaqDNA聚合酶 0.5/A(即2U).此时总反应体积为5O”l.PCR 反应条件:94?30S,60?30S,72?3min,共1个 循环;94?30s,58?30S,72?30S,共35个循 环;72?3min终延伸,置于4?保存.取上述扩 增产物1Ol,加溴酚兰5l混合后于1.5O琼脂糖 (含1l/ml的溴乙锭)凝胶,电泳检测扩增产物 (电压8OV,时间3,4h).?特异性核酸内切酶 鉴定扩增产物:取PCR产物5l,Pvu?或Hinf1 l,10×缓冲液2l,双蒸水12l混合离心,37? 水浴,酶消化1h,65?酶失活15min,用1.5琼 脂糖凝胶电泳检测. 1.3统计学方法 采用t检验,实验数据用?s表示. 2结果 2.1判断标准 两对寡核苷酸引物扩增膀胱移行细胞癌标本 中HPVs/l8基因,碱基片段大小分别为203bp和 244bp,用HPV./l8阳性克隆为阳性对照,用正常 尿液及去离子三蒸水为阴性对照.电泳结果于紫 外灯下观察,若于标准分子量203bp和244bp水 平处出现橙黄色亮带判断为阳性.对于阳性的 PCR产物,行核酸内切酶鉴定,于标准分子量34 bp和169bp,53bp和192bp处分别出现两条亮 带,说明PCR扩增的产物为HPV.和HPV..基因 型,从而验证结果的准确性. 2.2实验结果 6o例膀胱癌患者尿液标本经过M750一B型 (国产)紫外分光光度计测得的DNA含量为0.24 ?0.032g/L. 6O例膀胱癌患者尿液及2O例正常人尿液 HPVl6-.型基因PCR结果见表2. 表260例膀胱癌组织HPVl6’,l型基因PCR结果 例 从表2可以看出,膀胱移行细胞癌I级,?级 和?级HPV的检出率分别为73.7,78.5O和 92.3,总的检出率为80.0O(48/60).HPv.的 检出率分别为73.7,71.4%和84.6,总的检出 率为75.0O(45/60).由此可知,HPVHPV.的 检出率差别无统计学意义(P>0.01),但膀胱移 行细胞癌?级的检出率为最高(P<O.05). 3讨论 膀胱癌是泌尿生殖系肿瘤中最为常见的一种, 以移行细胞癌为主,且术后复发率高,早期诊断和 治疗是提高患者生存率的关键.但迄今为止尚未 临床泌尿外科杂志2oo6—年笙鲞笙塑 发现一种敏感性好,特异性高而又无创伤的膀胱癌 早期诊断方法.近年研究表明,高危型HPV16,18基 因与膀胱癌关系十分密切.其早期病毒基因产 物E6和E蛋白极易与Rb和P53基因产物相结 合,导致细胞生长失控,从而发生癌变?.因此,对 HPV的E6和E,基因进行分析研究,为膀胱肿 瘤的早期诊断及进一步了解其恶性表型开辟了新 途径. 国外学者Shibutani等和Reznikoff等研 究指出,高危型16,18基因与膀胱癌的关系十分密 切.Agliano和Lopez—Beltran等’采用South— ern核酸杂交技术,PCR技术,原位杂交技术,免疫 组织化学技术等方法对膀胱癌术后标本进行回顾 性研究,证实HPV-基因与膀胱癌有一定关系, 强调指出HPV病毒与宿主DNA结合导致了膀胱 癌基因突变,从而发生膀胱癌,并认为HPV感染 是膀胱癌发生的早期事件. 国内有关学者鸥?利用PCR对149例膀胱癌 标本进行了回顾性研究分析,发现HPV.基因表 达产物E和E是膀胱癌发生发展的一个重要基 因事件,并且发生在膀胱癌细胞转化的早期.因 此,HPV.基因的检测对膀胱癌的诊断和预后有 重要意义. PCR技术是一种特异性强,敏感性高的基因 检测方法,已广泛应用于病毒基因检测.笔者 等”结合国内外文献指出PCR技术是检测 HPV.?.的最佳技术. 综上所述,可见有关HPV与膀胱癌的研究 均属回顾性研究.为了寻找一种特异性高,敏感性 强而又无创伤的膀胱癌早期诊断技术,本研究采用 前瞻性研究,利用PCR和核酸内切酶技术对膀胱 移行细胞癌患者的尿脱落细胞中HPV.E基因 进行检测,发现在膀胱移行细胞癌患者的尿液中可 以检测到HPV.E基因,HPV.的检出率差 ? 457? 别无统计学意义(P>O.01).但HPVl6’18的检出 率和膀胱癌的病理分级有密切的关系,其中以移行 细胞癌III级的检出率为最高.本研究表明,尿液 HPV.的检测可作为膀胱癌的早期诊断方法. [参考文献] 1Anwark,NaikiH,NakarakiK.eta1.Highfrequenceof humanpapillomavirusincarcinomaoftheurinaryblad— der[-J].Cancer.1993,70:1967. 2ShibutaniYF.SchoenbergMP.CarpinielloVI?eta1. 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[书籍]作者.文题.见:主编者(含责任项).书名EM].卷.版次.出版地:出版者,年.起页一止页. 或作者(含责任项).书名I-M].卷.版次.出版地:出版者,年.起页一止页. 《临床泌尿外科杂志》编辑部