免疫共沉淀和荧光共定位验证107个人肝蛋白质相互作用对的准备工作

免疫共沉淀和荧光共定位验证107个人肝蛋白质相互作用对的准备工作 摘 要 中国人类肝脏蛋白质组(;,,”,，;,,,, ,,,柚,,,,, ,,,,,伽, ,,,,,;,)是一项意义重大的全国性基础研究项目，湖北大学有幸参与其中。我们以,,,条全长肝脏,,,为诱饵，运用酵母双杂交技术对一个健康成人肝脏;,,,文库进行筛选，初筛得到了,,,个蛋白质相互作用对，通过共转化验证证实了,,,个，其中,,,个相互作用对未经报道过。在这,,,个蛋白质相互作用对中，与本研究室拥有的,,,,多条全长肝脏蛋白质,,,资源相对应的有,,,,个，涉及,,,条全长,,,。本研究的目的是用免疫共沉淀和荧光共定位技术对这,;,,个蛋白质相互作用对在哺乳动物细胞中作进一步验证，主要包括以下两个方面: (,)将,,,条,,,克隆到免疫共沉淀载体上:将免疫共沉淀载体,,,;,,,,,,曲和,,,,哥,,,,,【硼口玎改造为,,,;—,,,,,?圈多一,,和,,,,,(,,,,,曲一,,，载体上的插入片段都替换为动，，并在插入片段的上、下游各引入,,,,的同源臂，使其与本研究室已经合成的用于酵母双杂交,,载体克隆的引物的同源臂保持一致，然后利用已有的引物将这些,,,克隆到免疫共沉淀载体上，成功克隆并测序验证,,,条,,,，对应于,,个完整的蛋白质相互作用对。 (,)荧光共定位载体的改造及部分,,,的克隆:在荧光共定位载体,,,,,,,(,,和,,,,,(,,的多克隆位点插入填充片段;;扭，并在;;，船的上游引入,,,,,(序列和皿聊，识别位点，得到,,,,,,【础,,,,,,,和,,,,,,【础,,,,,。 ,,,,,,【戗,,(,,,,,,和,,,,,,《;,日(,,,,对不携带,质粒的大肠杆菌宿主,,,,,是致死的，可以消除克隆过程中污染的载体背景。现已成功克隆,条,,,，其中与,,,,融合的,个重组质粒在,,,,细胞中均能正确达，被转染细胞能激发绿色荧光，大规模克隆及融合质粒的功能验证工作正在进行中。关键词:,,”,;蛋白质相互作用;酵母双杂交;免疫共沉淀;荧光共定位 ,,,,,,;, ;,,,,,(,,,,, ,,,柚,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,;, ,, , ,,,,,，,,, ,,,,,;, ,,,;, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,姐, ,,,,,,,,,;;?,,,;,,,,,，孤, ,,,, ,,,,, ,,,,,岫, ,,,,;,蚰,,,,,,,柚, ,,,,;,,,，,, ,, ,,; ,,舯, ,, ,,,;, ,,,,,,,“, ,, ,,,; ,,, ,, ,,,, ,,,,,;,(,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,, ,;”;,,,,,鹬,,,,,;,,, ,, ,;,;,, , ,,,,, ;,,, ,,,,,, ,, , ,,,,,,,, ,,,,,,, ,;,,,,?,,，,,,,,,,,，锄, ,,, ,,,,;,,,,,,,,,,, ,,,锄，;,,,,,(,,,) ,,, ,,,(,,,, ,,,,,, ,,;,。,脚,,,皿,,,衄，,,,吲瑚,,,,，,,, ,, ,,,,;, ,,,; ,,, ,?, ,;,,,,,, ,,,(,,,,, ,,，, ,,,,,,,，,,, ,,,, ,,,,,;, ,;?,,,,, ,,如,,(,,,,，, ,,,, ,; ,,,, ,,,,,,,，,,, ,,, ,,,—,,,,,,,,,, ,,,,,,;,(，，, ,,，,,?,,盯;,，,, ,,, ,,??,,,, ,,;,; ,,,, ,, ,,,,,,岫,,,,;,,,,砒,?,,,日,,坞,;,,?,,;,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ;,,( ,,, ,,,, ;,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,;, ,,, ,, ,,,，,,: (,),,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,, ,,,, ,,;,,,, ,, ;,—,,,,,,,,,,,,,,,,,,: ,,, ,,;,,,,,,,;—,,,,,【劝,,, ,,,,,—,,,,,嗍口，, ,,,, ,,,嘀,, ,, ,,,;?,,,,,,,勿一,, ,,, ,,,,,(,,,,,„罟咖„,, ,,,,,;,,,,, ,(,,,,,, ,,, ,,,,,,;,,,,,，,,, ,,,,,～, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,酉,,, ,,;,,,,,,,; ,,,,,;,, ,, , ;,,,,,,,,,,,, ,,,，,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,—,,,百, ,,,,,,,,,, ,,？,,,;;,,,,, ,,,,,,,;,, ,,, 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脱氧核糖核苷三磷酸,,,?, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,;;,,; ,;,, 乙二胺四乙酸，,,, ,,,,,,,,，,,,,一,一,—,,,,;,,,,,, 异丙基(,一,(半乳糖苷,,, ,,,,,, ,,,,;,,蛐,,,,,; 十二烷基硫酸钠,—,,, ,,,,,,,,一;,,,,,,,,,,,,, ,, ,(溴(,(氯(,(吲哚(,(,( 一,一,,,,,,;,,,,,, 半乳糖苷,, ,埘,,,,,,,, ,,,,,, ,,培养基,,, ,,,,亿,,,,,‰, 开放阅读框,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,;,,,咖 聚合酶链式反应,,, ,,;,, ,,，,,,,,, ,,,,,,, 绿色荧光蛋白,,,,, ,,,;,,,,, ,,,妇,,?,;;,, ,,,,,,, 盘状海葵属红色荧光蛋白,,,, ,,,柚;;,伊;;, ,,,,;,,,, ,,,;,, 增强型绿色荧光蛋白,,,,, ,,,,,,,,,;, ,佗,, ,,,,;,,,, ,,,,,, 超折叠绿色荧光蛋白 ? 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律后果由本人承担。 论文作者签名: 时间: 年 月 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解湖北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务;学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文;在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 (保密论文在解密后遵守此规定)论文作者签名: 导师签名:签名日期: 年月 日 签名日期: 年月 日 第一部分文献综述 第一部分 文献综述,(,蛋白质组和蛋白质组学的概念 ,,世纪中期以来，随着,,,双螺旋结构的提出和蛋白质空间结构的,射线解析，开始了分子生物学时代，对遗传信息载体,,砧阳生命功能的主要体现者蛋白质的研究，成为生命科学的主要内容。,,世纪,,年代初期，美国生物学家提出并实施了人类基因组计划,,,柚,蜘锄, ,,,;;,，,,,)，预计在,,年内投入,,亿美元，完成人类全部,,条(,,条常染色体和,、,性染色体)染色体的核苷酸(,×,们,,)序列分析、构建详细的人类基因组遗传图谱和物理图谱，确定人类,,,的全部核苷酸序列，定位约,,万个基因，并对其它生物进行类似研究，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。经过各国科学家十几年的共同努力，,,,已取得了巨大的成绩。,,,,年,月,,日，美国人类基因组研究项目首席科学家;,,,,,, ,博士在华盛顿隆重宣布:人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。这标志着“人类基因组计划”胜利完成和“后基因组时代”(,傩, ,;,,,,啪，,,勘正式来临【,,。 在后基因组时代，生物学家研究的重心已从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究【,捌。这种转向的第一个标志就是产生了功能基因组学(,，,,;,,彻,, ,;,,,,;,)的新学科。它采用一些新的技术，如微阵列或,,,芯片，可对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。但是，生命现象的主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身的特定活动规律，仅仅从基因的角度来研究是远远不够的，必须研究由基因转录和翻译出蛋白质的过程，才能真正揭示生命现象的本质和规律。因此，在,,世纪,,年代中期，在人类基因组计划研究发展及功能基因组学的基础上，又产生了一门在整体水平上研究细胞内全部蛋白质组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(,,,,?,,;,)。 蛋白质组,,,,?,;)一词，源于蛋白 质(,,,,,,,)与基因组(,咖,;)两个词的结合，最早由澳大利亚学者,,,,,,,,等于,,,,年提出，指的是,个基因组、,种生物或,种组织细胞所表达的全套蛋白质【,,。从这个定义看，蛋白质组内蛋白质的数目应该等于基因组内编码蛋白质的基因(准确地说应为开放阅读框，,,,?的数目，但在生物体内这样的蛋白质组是不存在的。从基因表达的角度看，蛋白质组内蛋白质的数目总是少于基因组中,,,的数目。但从蛋白质修饰的角度看，蛋白质组的蛋白质的数目又远远大于这个数字。因为,,,, 湖北大学硕士学位论文的剪切和编辑可使一个,，疆产生数种蛋白质，蛋白质翻译后的修饰，如糖基化、磷酸化同样增加了蛋白质种类。朊病毒学说认为一级结构相同的蛋白质在一定条件下可以形成不同结构的蛋白质，从结构上进一步丰富了蛋白质种类的概念。因此，蛋白质组的概念也被定义为:在一个细胞内存在的全部蛋白质。基因组基本是固定不变的，蛋白质组却是动态的，具有时空性和可调节性，能反映出特定基因的表达时间、表达量以及蛋白质翻译后的加工修饰和亚细胞分布等。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，主要在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、结构及其活动规律。 同基因组学一样，蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的知识体系，而是一个领域。它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等，最终揭示蛋白质功能，是基因组,,,序列与基因功能之间的桥梁,,,。,(,蛋白质组学的研究内容 蛋白质组学研究包括两个方面:一方面是对蛋白质表达模式(或蛋白质组组成)的研究。对蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质组进行表征，即实现亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次中所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。此外，尚须比较、分析在发生变化的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化，翻译后修饰的类型和程度，或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上定位的改变等。另一方面是对蛋白质组功能模式的研究。通过分析一个蛋白质是否与有抑制功能的蛋白质相互作用可得到揭示其功能的线索。利用大规模酵母双杂交系统，建立相互作用关系的网络图，是目前蛋白质组学领域的研究热点之一。,(,蛋白质组学的常用技术,(,(,(样品制备(,,,,,, ,,,,,,,,,,,)技术 样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 样品制备通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析，也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋白质组研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞定位进行分级。这 , 第一部分文献综述样不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。 对,,函床组织样品进行研究，寻找疾病标记，是蛋白质组研究的重要方向之一，但,临床样品都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一。若不解决细胞异质性问题，任何对于发生病变的细胞的蛋白质组分析都将包括大量的背景干扰。最近在组织水平上的蛋白质组样品制备方面有新的进展，如激光捕获微切割技术,弱盯;,,,,,,, ,,;,,,,,,,;,,衄，,,,,较好的解决了组织细胞异质性问题。“:,是在不破坏组织结构”保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下一，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，成功地解决了组织中的细胞异质性问题，从而可以进行纯细胞的蛋白质组研究。,, ,,年由,,,;, ,,;,等人最初发明【们，,,,,年美国,埘,,, ,,,,,,,血,公司将其化，并发展成商业化的自动化操作系统，用于后基因组研究，尤其是蛋白质组研究，目前已经用于膀胱癌与结肠癌等样品的制型那】。缺点是分离能力有限，只能得到,, ,,,,,,, ,,,个细胞，而质谱鉴定时蛋白质应该在,,,,,,加,,之间，故在蛋白质分析时受到一定影响【,】。 ?,(,(,(蛋白质的分离技术,(,(,(,双向凝胶电泳(脚,(,,,,,,,,,,, ,,,;,,,,,,,;,,,，,(,,) 双向电泳?,(,,,?,,,,,, ,,;;,,,,,,,,,,，,(,,)是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另两种是质谱技术和蛋白质组信息学)，也是蛋白质组研究中的首选分离技术，可以对样品中复杂的蛋白质进行整体性的分离。双向电泳方法于,,,,年由,，,,盯,,,【,,】首先提出并成功地分离约, ,,,个,?豇蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化( ,,,,根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。第一向为等电聚焦(，,,,,;,,,;妣,,,,,,，?,)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的,,是载体两性电解质,,梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立,,梯度;,,世纪,,年代初建立起来的固相,,梯度(,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,,，职,)刀巳,，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成,,梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的,,梯度。玎,,胶实验的重复性好。第二向为十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳(,,,—,,,,,;,,,锄,,;,;, ,,;;昀邮,,，,,,(,,,,)，它是按蛋白质分子量的大小进行分离，双向电泳的最新进展是用,,干胶条代替两性电解质加上与干胶条相配套的电泳仪如,,,,,凹州,, , 湖北大学硕士学位论文;;,、口,,,,,,,等进行第一向等电聚焦，不仅极大地提高了电泳的分辨率，也提商了结果的重复性(尤其是不同实验室之间结果的可比性。,(,,最大的应用是能分离相同分子量的同分异构体以及经过翻译后修饰的蛋白质，蛋白质经过诸如磷酸化后，其电荷数量发生改变。通常蛋白质的磷酸化形式可以与未磷酸化的对应物分离开，在双向电泳胶上出现一串水平斑点,,,?,,,。 双向电泳由于具有高分辨率和高灵敏度已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具【,,，,,，。在双向电泳应用中所面,,缶的问题:许多疏水性蛋白质(如膜蛋白)不溶于样品缓冲液，相对分子质量过大(,,,,,,)，极端酸性或碱性蛋白在电泳过程中易丢失，,(,,不能分妗,秃孔榉忠妆桓吆孔榉终诒危档土朔直媛省,鞍自谔崛『拖讨械亩?旱奈廴尽?诓挥跋旆直媛是榭鱿碌纳涎慷嗌俚榷际巧写饩龅奈侍狻,保常玻膊钜炷旱缬荆ǎ洌椋妫妫悖颍悖睿簦椋幔欤椋睢纾澹?,,,;,,,,,,,,,,,，,，,,) 为改进双向电泳的重复性和灵敏度，最近发展了一种荧光染料标记的双向电泳技术即差异凝胶电泳，其方法是将两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，在同一凝胶内进行电泳，因此可以对来自正常组织和癌变组织的样品蛋白质表达差异进行分析。与常规的双向电泳技术比较，,，,,更加简单，劳动强度降低，效率提高。因此，该技术可用于蛋白质的差异鉴定，尤其是用于大样本实验，”,。,(,,,(,高效液相色谱(,,,，, ,,响,卸,; ，,？,,, ;,,,,,,,伊,,,,，, ,,;) 高效液相色谱适用于单一蛋白质或简单样品蛋白质组的分离与纯化。它与质谱结合，利用蛋白质等电点、疏水性和分子量的特性进行蛋白质分离鉴定，借助计算机联机检索，实现蛋白质分离鉴定一次完成，能满足高通量、自动化分析的要求。与双向电泳比较，揉作简单、速度快且灵敏度高。但由于一维的,,,;仅能分析一些不太复杂的蛋白质体系，而对复杂的多肽混合物常不能满足分离的要求。利用蛋白质不同特性，用多个分离柱对蛋白质进行多次高效液相分离的多维色谱,,,,,,(，,)分离的方法在某种程度上满足了对复杂蛋白质混合分离鉴定的要求，常用于膜蛋白及低丰度蛋白质的分离鉴定。 高效液相色谱(,,,;)对于蛋白质组研究，其存在明显不足:不能定量分析如蛋白质的差异表达分析;对过酸及分子量太小的蛋白质仍不能分离四。,(,(,(,毛细管电泳技术(,,,,,,,,, ,，,,,,,,,,,,,,，,,) 毛细管电泳技术是,,世纪,,年代由,,;,?,和,,,,;,提出的高效分离分析技术。即在高电场强度作用下，对毛细管(内径,,,,?,)中的待测样品按分子质量、电荷、电泳迁 , 第一部分文献综述移率等差异进行有效分离。主要包括毛细管区带电泳(;,,)、毛细管等电聚焦(;,,)和筛板(,,,毛细管电泳(筛板,,,(,,)。它的主要特点是弥补了双向凝胶电泳无法实现自动化分析的不足，可实现在线自动分析，并可用于分子量范围不适于,(,,的样品分析。缺点在于对复杂样品的分离不完全。,(,(,(,同位素标记亲和标签技术(，,,,,,,—?,;, ,,,,,, ,,,, ，(?,,) 同位素标记亲和标签技术是用同位素标记帮助蛋白质组定量研究的技术，基本原理是将某一状态的蛋白混合物标记后作为内标准，与另一状态的蛋白混合物混合酶解，消化后的复杂多肽混合物通过亲和标签用生物素亲和层析柱将标记的多肽分离，最后分离的样品可以用【,(,,分析或用,,(,,,,,直接由蛋白序列信息来确定蛋白。这一技术克服了,(,,的缺点，能全自动化，可以用于高通量蛋白质组，可以精确检测疏水的膜蛋白，等电点和分子量偏大或偏小的蛋白，同时还能够测定其中蛋白质序列【,,,。使它的分析范围远大于,(,,。,,,,在定量及差异表达检测上有巨大的优势，但也面临一些问题。,;,,该技术的缺点是只对含半胱氨酸残基的蛋白质有效，而不能测定其他的蛋白质和多肽。另外，目前商品化试剂的高价位也影响了该方法的普遍应用。，,,,最大的挑战在于样品高度复杂，质谱分析获得数据的能力与这种复杂性相比显得不足，但随着，,,礅术的不断进步与完善，它仍将是蛋白质组差异表达研究中的主要技术之一。,(,(,(蛋白质的鉴定技术,(,(,(,图象分析技术(，,,,; ,,,,,,,) ,(,,图谱上每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。在一系列高质量的,(,,凝胶产生(低背景染色，高度的重复性)的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。,(,(,(,微量测序(,,,,?？,?,,,) 蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱(,,,)可鉴定由,(,,分离的蛋白。,(端氨基酸序列分析常用,,,趾降解法;,端氨基酸序列分析常用羧肽酶法、化学降解法。但最普通的,,末端,,,觚降解仍然是进行鉴定的主要技术，目前已实现蛋白质微量测序的自动化(尽管这一 , 湖北大学硕士学位论文方法测序速度较慢，费用偏高，灵敏度 不如质谱，但它测定的肽序列非常准确，成为蛋白质鉴定的重要依据。 ?,(,(,(,氨基酸组成分析 氨基酸组成分析氨基酸组成分析可提供蛋白质一级结构:常用酸水解、放射性标记法和蛋白酶水解，通过测定蛋白质中各种氨基酸所占的摩尔百分数或摩尔比率，与数据库中已知蛋白的理论值比较。该方法具有经济快速等优点，但灵敏度较低。,(,(,(,质谱(,蠲, ,,,;,,,,,仃,，,,)相关的鉴定技术【,,,,,,,(,,(,(,肽质量指纹谱(,,,锄, ,,嚣,,,,;删,,，,,,) 肽质量指纹谱(,印,,,, ,勰, ,,,,;删,,，,,,?是目前蛋白质组研究中较常用的鉴定方法，该技术于,,,,年被多个研究小组分别独立提出。用酶(最常用的是胰酶)对由,(,,分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的,(末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量(,,， ,，,,,,—,,，或为,,，(,,)，这一技术能够完成的肽质量可精确到,(,个分子量单位。所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比(理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的)。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白(若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则.