造血干细胞移植

造血干细胞移植 造血干细胞移植(henmotapoietic stem cell transplantation, HSCT)是指将同种异体或自体的造血干细胞植入到受者体内，使其造血功能及免疫功能重建，达到治疗某些恶性或非恶性疾病的目的。造血干细胞不仅存在于骨髓，而且在外周血，脐血亦有造血干细胞存在。根据造血干细胞来源不同，HSCT分为，骨髓移植、外周血干细胞移植和脐血移植等;根据供者来源不同分为自体和同种异体(包括同基因和异基因的)HSCT两类，异基因造血干细胞移植又分为亲缘与非亲缘HSCT，近年来又开展了非清髓异基因HSCT和单倍体HSCT。自体造血干细胞移植在年龄上没有严格限制，亦无HLA配型的限制，无移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)，移植后并发症少，易植活等，但肿瘤易复发是其最大缺点。异基因造血干细胞移植年龄一般限制在50岁以下，要求有HLA相匹配的供者。GVHD同时伴有移植物抗白血病(graft verus leukemia, GVL)作用，肿瘤复发率低。如果有HLA配型相匹配供者的条件，多主张做异基因造血干细胞移植。 一、骨髓移植 异基因骨髓移植 (allogeneic bone marrow transplantation,al-lo-BMT) 【适应证】 (一)恶性疾病 1(急性白血病 由于在疾病的不同阶段进行allo-BMT的患者，其疗效差异很大。把握移植时机非常重要。 (1)急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia, AML)患者:?50(或60)岁以下，无前驱血液病(antecedent hematologic disease)，标准化疗治疗达完全缓解者，而细胞遗传学检查为有利核型[如:inv16, t(16;16),t(8;21)等]者可行自体造血干细胞移植;中危核型[如:正常，仅为+8，t(9;11)等]者可行自体或异基因HSCT;不利核型(如:3个以上的复杂核型，-7， --5，5q等)者或前驱血液病、治疗相关的继发性AML者应尽早行allo-HSCT。?诱导缓解治疗无效 1 或缓解后复发的AML者应尽早行allo-HSCT。?AML M3型，由于维A酸等诱导分化治疗联合化疗疗效较好，一般主张在第二次完全缓解(CR2)后自体或allo-HSCT，如PML/RARα融合基因(—)，可行自体HSCT，如第二次诱导治疗未缓解，则行allo-HSCT。另外，M3型经标准诱导治疗失败，应行allo-HSCT。 (2)成人急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia-a, ALL)，特别是高危或存在一引起染色体异常t(4;11),t(8;14)或t(9;22)的ALL患者在第一次完全缓解(first complete remis-sion,CRI)后，allo-BMT。对未缓解者应争取allo-HSCT。目前多个移植中心的结果提示急性白血病缓解后尽快行造血干细胞移植，其疗效远高于持续化疗。 2(慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)对50岁以下的患者应早做allo-BMT，确诊后1年以内的慢性期患者做allo-BMT效果较佳，第二次慢性期(CP2)患者allo-BMT的疗效虽不及第一次慢性期者，但骨髓移植仍是CML-CP2目前最有效的治疗方案。而加速期或急变期的疗效差，尽管移植后复发移植相关死亡率高，成功率低，但此时有效的治疗方法仍为allo-HSCT。CML加速期或急变期时根据病情转变急性白血病类型选择诱导治疗方案，争取使其再回到慢性期，行allo-HSCT或应用甲磺酸伊马替尼达血液学或细胞遗传学反应后再行allo-HSCT。 3(骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)根据MDS的国际预后评分系统(International Prognostic Scoring System,IPSS)，将MDS分为:低危、中危-1、中危-2、高危四组(见3-9-1和表3-9-2)。一般认为中、高危组的患者尽早行HSCT效果较好，具体适应证为:?病情不稳定的低、中危-1组或病情稳定的中危-1组，年龄?55岁，或体能状态良好(ECOG0,1,2)者。?年龄?55岁或体能状态良好的中危-2与高危组患者，对于年龄,55岁，体能状态良好者，可行非清髓allo-HSCT。 表3-9-1 MDS的IPSS 积 分 预后 因素 0 0(5 1(0 1(5 2(0 骨髓原始细胞(%)(Marrow blasts) ,5 5-10 - 11-20 21-30 核型(Karyotype) 良好 中间 不良 血细胞减少(cytopenias) 0-1系 2-3系 表3-9-2 MDS的风险分组1) 风险分组 综合评分 2 低危 0 中危-1 0.5-1.0 中危-2 1.5-2.0 高危 ,2.5 1)NCCN Practice Guideline in Oncology-v.1.2004 4(多发性骨髓瘤 病情为?期以上多发性骨髓瘤患者应考虑HSCT，适应证:?初期化疗有效或稳定的患者。?补救治疗有效或稳定的患者。?自体HSCT后病情进展的患者。?复发难治患者。 5(霍奇金病 目前这类患者多行自体骨髓移植(autologous BMT, ABMT)对不适合做ABMT者，如瘤细胞已累及骨髓而又有HLA相匹配供者的患者，主张行异基因骨髓移植或外周血干细胞移植。 6(非霍奇金淋巴瘤 ?进展型慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)病情进情，有进一步治疗指征者，可选择HSCT。?滤泡性淋巴瘤:由于现有的标准治疗方案难以达到治愈目的，HSCT是值得探讨的方法。对治疗有反应或无反应的患者，应用蒽环类化疗方案+放疗或CD20单抗达CR或PR进行自体或异基因HSCT;复发病例应尽早做自体或异基因HSCT。?弥漫大B细胞淋巴瘤:对于局部病变放、化疗只有部分反应者，进展期病变经三至四个疗程治疗达部分反应者，应接受自体或异基础HSCT。?高度侵袭性淋巴瘤:包括套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、周围T细胞淋巴瘤等，病情进展快，预后差，应积极进行allo-HSCT。 7(恶性组织细胞病，是一种恶性程度很高的恶性血液病，其治疗效果差，BMT可提高疗效甚至长期缓解或治愈。 (二)非恶性疾病 1(再生障碍性贫血 BMT是再障特别是重型再障(severe aplastic anemia, SAA)的主要治疗手段之一，其疗效与下列因素有关:?年龄,20岁患者疗效最佳。?移植前是否输血，输血者易发生排斥及GVHD。?疾病的严重程度，SAA进展快，一经确诊应尽快做BMT。 2(急性放射病。 3(其他 阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH)、珠蛋白生成障碍性贫血、重症联合免疫缺陷症等，目前仅占很小比例。 上述疾病，不管是恶性疾病，还是非恶性疾病，BMT时患者应具备下列条件:?年龄,50或55岁。?全身一般状态好。?无心、肺、肝、肾等重要脏器损害。?无严重或未控制的感染。? 3 无严重药物过敏。?无严重精神障碍史。 值得注意，近年来HSCT技术的不断完善以及非清髓HSCT的应用，HSCT的适应证扩大，年龄限制已放宽到65岁左右，有脏器功能障碍及并发症者仍可考虑非清髓HSCT。 【术前准备】 1(核实诊断，拟定BMT整体计划。 2(了解药物过敏史、输血史。 3(心、肺、肝、肾等重要脏器功能检查及评估。 4(控制感染，清除感染灶。 5(骨髓穿刺及活检，明确HSCT前疾病的状态;检查是否存在髓外白血病(如:脑脊液或中枢神经系统、睾丸、卵巢等检查)。 6(检测肝炎病素、巨细胞病素、EB病素等。 7(HLA配型 主要组织相容性复合体(major histocompa-bility complex, MHC)与移植免疫密切相关，在人类为白细胞抗原(human leucocyte antigen, HLA), HLA是一组定位于人类第六号染色体短臂上紧密相连的基因复合体，它包含400万个碱基，超过200个基因。这组基因群编码的抗原与移植物排斥、免疫调节有关。对异基因造血干细胞来说，影响最大的基因是HLA-?类抗原HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-?类抗原HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP。配型方法有: (1)血清学法:用已知HLA特异性血清与被测者的淋巴细胞作用，从而测出淋巴细胞HLA抗原。可检测出18种HLA-A、35种HLA-B、8种HLA-C、14种HLA-DR。而近年以DNA测序方法发现HLA多态性达几百种之多，显然，血清血分型难以满足临床需要。 (2)混合淋巴细胞培养:因为HLA的D位点有较复杂的多态性，用血清学的方法检测的难度较大。可用此方法对D位点是否相合进行证实。但随着高分辨HLA分型技术的发展，已逐渐趋于淘汰。 (3)分子生物学法:血清学配型相合的患者仍有30%的基因学配型不相合，目前基因配型已开始应用于临床，保证了HLA配型的准确性。常用方法有PCR-RELP(限制性片段长度多肽性)、PCR-SSO(序列特异性核苷酸探针)、PCR-SSP(序列特异性引物)、PCR-SSCP(单链构象多态性)、PCR-DNA序列分析等。 8(供者的选择 (1)HLA完全相合的同胞供者:占异基因BMT的绝大多数，理论上同胞间找到HLA完全相合供者的机会为25%。 4 (2)HLA不相合的同胞或父母单倍体供者:在同胞兄弟姐妹供者与患者之间作HLA配型，有一两个或者三个位点不合，也可以进行BMT，供者HLA配型不同于患者的抗原有两类来源。对患者而言，一类为未遗传母亲抗原(noninherited maternal antigen,NIMA);另一类为未遗传父亲抗原(noninherited paternal antigen,NIPA)。另外，父亲或母亲作为供者，为子女损献骨髓或子女作为供者为父亲或母亲损献骨髓。 (3)无血缘关系供者:世界范围内骨髓库的建立对无同胞供者的患者提供了机会。每建立约25万-30万的HLA库，则每个患者均有可能找到一个HLA相合的供者。截至2002年全球共登记骨髓损献志愿者约800万人。英美等国已成为了广泛的骨髓供者库。HLA遗传达室具有种族特异性。目前最大的华人骨髓库是我国台湾慈济骨髓损献中心，拥有志愿者约22万人。我国忠者的无关供髓者大多来自我国台湾。我国大陆于1992年建立了此库，近年发展较快，已为国内多家单位等待移植的患者提供HLA配型相合的骨髓。 (4)供者的选择步骤与要求:首选供者HLA完全相合的同胞供者;其次为HLA相合的非血缘关系供者;再考虑HLA配型一个位点不合以及两三个位点不合的同胞供者，其中优先选择NIMA者，再次为子女与母亲之间的移植，最后选择子女与父亲的移植。 (5)供者要求:健康体检合格，无遗传性、先天性疾病，无严重或未控制的感染。供者年龄一般,55岁。一般认为年轻供骨髓易于植活并较少发生GVHD。 9(供、受者的特民间标记检测 作为以后判断是否植活指标(如:ABO血型，细胞遗传学标记，分子生物学检查等)。 10(供者骨髓采集术术前准备 包括从术前1个月开始至术前1日采集自体血600-800ml备用。 【操作规程或要点】 1(预处理 骨髓移植前，患者需要接受一个疗程的超大剂量化疗，有时再加大剂量全身放疗，这种方法称作预处理。预处理的目的有以下三点: (1)最大程度杀灭体内恶性细胞或骨髓中的异常细胞群。 (2)抑制机体的免疫功能以减轻受者对移植物的排斥反应，使骨髓容易植活。 (3)摧毁受者体内原有的造血细胞，给植入的造血干细胞准备生长的空间。 目前预处理方案有两类: 1)全身放疗(total body irradiation, TBI)加化疗(见表3-9-3):TBI 6-14 Gy×1日， 2—1日;环磷酰胺1.8g(m?d)或60mg/(kg?d)×2日，—3日，—4日。 5 22)非TBI(单纯化疗，表3-9-4)方案:环磷酰胺1.8g(m?d)或60mg/(kg?d)×2日，—3日，—4日;白消安1mg/kg q6h×4-9日—9日，—8日，—7日，—6日。 上述预处理方案被称为经典方案，为许多BMT中心沿用，以后发展的预处理方案也是以此为基础的。一般根据病种或病情选择包括TBI或非TBI两种预处理方案之一。 表3-9-3 全身照射(TBI)的预处理方案 方案 总剂量 每日剂量 用法 时间(d) 2)3)Cy/TBI:Cy 120mg/kg 60mg/kg iv(1h) -6, -5 TBI 12-14.40Gy 2-2.4Gy(×2/d) -3, -2, -1 4)1)Cy//TAI:Cy 20-120mg/kg 10-60mg/kg iv(1h) -4, -3 TAI 4-7.5Gy 4-7.5Gy -1 方案 总剂量 每日剂量 用法 时间(d) 5)Cy/VP/TBI:Cy 120mg/kg 60mg/kg iv(1h) -6, -5 VP 30-60mg/kg 30-60mg/kg iv(2h) -4 TBI 12-13.5cGy 2-2.25Gy(×2/d) -3, -2, -1 6)TBI/TT/Cy 7)/ATG: TBI 15Gy 1.25Gy(×3/d) -9, -8, -7, -6 TT 10mg/kg 5mg/kg iv(1-2h) -5, -4 Cy 120mg/kg 60mg/kg iv(1h) -3, -2 ATG 120mg/kg 30mg/kg iv(5-6h) -6, -5 –4 TBI/VP:TBI 12-13-5Gy 2-2.25Gy(×2/d) -3 VP 60mg/kg 60mg/kg iv(2h) -9, -8, -7 8)22AC/TBI:Ara-C 36g/m 3g/m(×2/d) iv (2h-q12h) -6, -5, -4 TBI 12Gy 2Gy(×2/d) -3, -2, -1 9)22AEL/TBI:MEL 110-140mg/m 110-140mg/m Iv(1h) -3 TBI 12Gy 2Gy(×2/d) -2, -1, 0 1)用于治疗再生障碍性盆血的剂量;2)Cy:环磷酰胺;3)TBI:全身照射:4)TAI:全淋巴结照身;5)VP:足叶乙苷;6)TT:塞替哌(Thiotepa);7)ATG:抗胸腺球蛋白;8)AC:阿糖胞6 苷;9)MEL:美法伦。 表3-9-4 非全身照射的预处理方案 方案 总剂量 每日剂量 用法 时间(d) Cy 200mg/kg 50mg/kg iv(1h) -5, -4, -3, -2 Cy/ATG:Cy 200mg/kg 50mg/kg iv(1h) -5, -4, -3, -2 ATG 90mg/kg 30mg/kg iv (8-10h) -5, -4, -3 Bu/Cy: Bu 16mg/kg 4mg/kg 每日6h口服1次 -7, -6, -5, -4 Cy 120mg/kg 60mg/kg iv (1h) -3, -2 Bu/MEI: Bu 16mg/kg 4mg/kg 每6h口服1次 -5, -4, -3, -2 22MEL 140mg/m 140mg/m iv (1h) -1 1)Bu 160mg/kg 4mg/kg 口服 -5, -4, -3, -2 22MEL 100-200mg/ m 100-200mg/ m iv (1h) -1 22BEAM: BCNU 300mg/ m 300mg/ m iv (2h) -6 2)22Etposide 400-800mg/ m 100-200mg/ m iv (2h) -5, -4, -3, -2 22Ara-C 800-1600mg/ m 200-400mg/ m iv (2h) -5, -4, -3, -2 22Mel 140mg/ m 140mg/ m iv (1h) -1 22CBV:BCNU 300-600mg/ m 100-200mg/ m iv (2h) -8, -7, -6 22Etoposide 750-2400mg/ m 250-800mg/ m iv (2h) -8, -7, -6 2Cy 4.8-7.2g/ m 1.2-1.8g/m iv (1h) -5, -4, -3, -2 22BAVC: BCNU 800mg/ m 800mg/ m iv (2h) -6 3)22Amsacrine 450mg/ m 150mg/ m iv (2h) -5, -4, -3 22Etoposide 450mg/ m 150mg/ m iv (2h) -5, -4, -3 22Ara-C 900mg/ m 300mg/ m iv (2h) -5, -4, -3 22LACE: CCNU 200mg/ m 200mg/ m 口服 -7 22Etoposide 1g/ m 1g/ m iv (2h) -7 22Ara-C 4g/ m 2.0g/ m iv (2h) -6, -5 22Cy 5.4g/ m 1.8g/ m iv (1h) -4, -3, -2 22CCB:Cy 5625mg/ m 1406.3mg/ m iv (2h) -6, -5, -4, -3 7 4)22Cistoplatin 165mg/ m 41.2mg/ m iv持续 -6, -5, -4, -3 22BCNU 600mg/ m 600mg/ m iv (2h) -3 5)22CTCb: thiotepa 500mg/ m 125mg/ m iv持续 -7, -6, -5, -4 22Cy 6g/ m 1.5g/ m iv持续 -7, -6, -5, -4 6)22Carboplatin 800mg/ m 200mg/ m iv持续 -7, -6, -5, -4 7)22ICE:lfosfanide 16g/ m 4g/ m iv (2h) -6, -5, -4, -3 22Carboplatin 1.8g/ m 600mg/ m iv持续 -6, -5, -4 22Etoposide 1.5g/ m 500mg/ m iv 2h(Bid) -6, -5, -4 1)Bu:白消安;2)Etoposide:鬼臼乙叉苷;3)Amsacrine:安亚丁;4)Cistoplatin:顺铂;5)Thiotepa:塞替哌;6)Carboplatin:卡铂;7)Ifos-famide:异环磷酰胺。 表3-9-2、表3-9-4摘自Apperley J, Bacigalupo A, Friedrich W, et al. Principles of conditioning Regimens. In:Apperley JF, Gluchman E, Grawohl A, et al. Blood and Marrow Transplanta-tion The EBMT Handbook 2000 Revised Edition. 92-109 2(骨髓采集术 (1)抗凝剂的配制:1640液或生理盐水1000ml加入肝素12500U/支共5支，并用抗凝剂冲洗骨穿针或采髓针。在手术室于硬膜外麻醉下，选择左右前、后骼棘，采用多点多部位穿刺，每次穿刺用20ml注射器(内含以上配制的肝素液2.5ml抗凝)抽吸5-10ml骨髓血。 (2)过滤:国外多采用Thomas技术，用不锈钢网两次过滤，网孔分别为62和88目;国内多采用针头过滤的简单方法，即用16和9号针头各过滤1次，然后收集骨髓细胞液于输血袋中。 83(采集骨髓血量的估计 使造血重建的骨髓有核细胞最低阈值为(2-4)×10/kg，一般为 83×10/kg。如供、受者间ABO血型不合，去除红细胞时常丢失部分骨髓血的有核细胞，因此，采集骨髓的有核细胞数的还应增加。 4(血型不合的骨髓血处理 有三种情况: (1)如将受者与供者血进行交叉配血时，主试验(即受者血清+供者红细胞悬液)有凝集反应，副试验(即供者血清+受者红细胞悬液)无凝集反应。如受者为A型或B型，供者为AB型;或受者O型，供者A型或B型或AB型;通常称为主血型不合，其处理方法: 1)沉降法:在采集的骨髓血中加入6%羟乙基淀粉(hy-droxyethyl starch,HES，分子量45万)沉淀红细胞，两者的体积比为骨髓血:HES为4:1混匀后静置约半小时，取其上层富含干细胞的血浆回输给受者。 8 2)去除受者体内ABO系统的凝集素:通过血浆交换法降低受者体内的抗A或抗B凝集素。 (2)如将供者与受者血进行交叉配血时，副试验(即供者血清+受者红细胞悬液)有凝集反应，如受者为A型或B型，供者为O型;或受者AB型，供者O型;通常称为次血型不合。其处理方法:一般供者骨髓血不必特殊处理，可直接输给受者。若供者凝集素滴度,1:2000，或凝集素滴度,1:2000，但输入骨髓血的量很大，可能引起受者溶血反应，最好是通过离心分离的方法去除供者骨髓血中的血浆，然后再将骨髓输给患者。 (3)供、受者间主次血型均不合(供受者一个为A型或B型，一个为B型或A型):如将供者与受者血进行交叉配血时，主试验和副试验均有凝集反应。需同时采用针对主要和次要不合的措施。 5(骨髓血的回输 采集完后，骨髓血应在6小时内输完，每袋最后约100ml应丢弃，以防脂防及颗粒输入体内。 【并发症的防治】 移植并发症的有效治疗是提高移植成功率的重要组成部分，主工并发症包括:感染、出血性膀胱炎、GVHD、间质性肺炎、肝静脉闭塞综合征等。 (一)感染 异基因造血干细胞移植患者在移植期间经历了三个阶段，第一阶段由于患者移植时接受超大剂量化疗及放疗预处理，免疫功能受到来重破坏，粒细胞缺乏，以及口腔肠道黏膜屏障接线员害，同时不定期包括巨噬细胞、T细胞和NK细胞的功能抑制，极易发生严重感染，死亡率很高，应积极防治感染:第二阶段主要为急性GVHD发生时期，T细胞功能受损，这一阶段的长生病民allo-HSCT的类型有关，HLA配型相合的亲缘怀allo-HSCT，一般较少发生GVHD，而非亲缘性移植易发生急性GVHD，可延长至数月;第三阶段则为慢性GVHD发作时期，常有T细胞、B细胞功能异常。以上每一阶段的感染都有一定特征，应根据患者不同时间、不同情况进行处理。 1(全环境保护 包括移植前10日至移植后造血功能基本恢复期间居住在空气层流洁净室，减少患者体内外带菌负荷。 2(移植前清除患者体隐藏的感染灶，如龋齿、鼻窦炎、肛瘘、痔疮等。 3(预防用药 (1)清除肠道中的细菌，口服肠道不吸收的抗生素，如庆大霉素、新霉素、万古霉类、多黏菌素E等。防治厌氧菌感染;用甲硝唑。 在移植期间，特别是第一阶段是感染的高发时期，在此期间是否用广谱抗生素预防革兰阴性 9 杆菌或阳性球菌，目前意义不一。 (2)预防肺孢子早病:用复方磺胺甲唑。 (3)预防真菌感染:应用氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素、大蒜素、二性霉素B等。预防应用氟康唑400mg/d可减少侵袭性真菌感染，特别是念珠菌感染的风险，但对曲霉感染无效，局部或全身应用低剂量二性霉素B预防真菌感染，尚水证明其肯定疗效，伊曲康唑对曲霉有效，但口服吸收有效，目前伊曲康唑口服液克服了其胶囊剂口服难吸收的缺陷，可能成为今后预防allo-HSCT真菌感染的有效制齐。 (4)预防病毒感染:阿昔洛韦具有较好预防单纯疱疹病素感染的作用。巨细胞病素(cytomegalovirus, CMV)血清学阳性的供、受者可预防性应用更昔洛韦(ganciclovir; 丙氧鸟苷，DHPG)、膦甲酸钠、大蒜素、免疫球蛋白等。更昔洛韦对?型、?型单纯疱疹病毒及水痘带状疱疹病毒的作用机制与阿昔洛韦相似，更昔洛韦在细胞内的消除半衰期长达24小时以上。对巨细胞病毒感染有良好作用。用于骨髓移植排CMV病毒者，以预防发生巨细胞病毒肺炎。用法:每日 95-10mg/kg，分2次静脉滴注，疗程10-21日。主要不良反应是骨髓抑制，中性粒细胞,0.5×10/L时需停药。膦甲酸钠注射液(Foscarnet Sodium injection)为广谱抗病毒药物，作用机制为直接抑制病素特异的DNA多聚酶和逆转录酶。本品对?型、?型单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等有抑制作用。初始剂量:60mg/kg q8h静脉滴注(,1小时)，2-3周;维持量为每日90-120mg/kg，剂量、给药间隔及连续应用时间须根据患者的肾功能与用药的耐受程度予以调节，肾功能不全者需减量用药。 4(抗感染治疗 移植后造血功能还未重建以前，对于体温,37.5?，除外输血、输液和过敏等因素外，应积极查找感染灶与病原菌，争取在抗生素应用前进行血尿、粪等培养，同时早期积极应用强效广谱抗生素抗感染治疗。在感染未明确以前，先给予经验性抗感染治疗，以后根据病原菌检查结果调整抗生素。 (1)经验性抗感染治疗步骤:首先，第三代头孢菌素或第四代头孢菌素(如头孢吡肟等)或联合氨基糖苷类，甚至碳青酶烯类(如泰能等);如发热3-5日末控制，再考虑可能有革兰阳性球菌感染，立即加用万古霉素或替考接宁等;如再发热3-5日仍未控制，应尽早护真菌治疗。 (2)真菌感染的治疗:侵袭性真菌感染在免疫功能低下患者的发生率及病死率很高，其病死率高达45%-90%，造血干细胞移植患者为其高危患者，侵袭性真菌感染早期诊断非常困难，目前缺少敏感的特异检查技术，因此，对于移植后持续发热应用广谱强效抗生素3-5日无效的患者应考10 虑真菌感染，早期经验性抗协菌治疗。二性霉素B是一种广谱高效抗真菌药物，由于其毒副作用特别是肾毒性限制其广泛应用。但从小剂量开始逐渐增加剂量，提高了患者对二性霉素B的耐受性。新剂型脂质体二性霉素B减少了肾毒性，也提高了二性霉素B的剂量，但仍存在秀多问题尚未解决，包括最佳剂量，以及与普通二性霉素B相比其抗真菌疗效等。氟康唑主要用于治疗念珠菌感染，对曲霉无效，用法:400-800mg/d，氟康唑的耐药问题逐渐引起临床重视。伊曲康唑为广谱抗真菌药物，不仅对念珠菌有效，而且对曲霉也有效，目前伊曲康唑注射液适应于粒细胞减少发热患者经验治疗，用法:初2日200mg/次，每日2次，以后，200mg/d，每日1次，14日后改为口服维持治疗。 新的抗真菌药:新研制的三唑类抗真菌药具有广谱抗真菌作用，对念珠真菌属(包括氟康唑和伊曲康唑耐药株)、新型隐球菌、曲霉属、组织胞浆菌等均有良好抗菌活性，如伏立康唑(voriconazole)有口服及注射剂。棘白菌素类(Echinocandins)为另一种机关报型抗真菌药，属乙酰环六肽类，供注射用，本类药物为葡聚糖合成酶抑制剂，抑制真菌细胞壁的合成，如卡泊芬净(caspofungin)对曲霉、念珠菌属等均有良好的抗菌作用，对肺孢子虫病也有作用。 5(加速造血恢复 骨髓植后粒细胞缺乏期是感染的高峰时期，加速机体的造血恢复，缩短白细胞减少、粒细胞缺乏的持续时间，可明显降低感染发生率。方法:基因重组粒/粒-单核细胞集落刺激因子(rhG/GM-CSF):5-10μg/(kg?d)，皮下注射，+5日开始应用，直到粒细胞绝对值, 90.5×10/L. (二)出血性膀胱炎 引起出血性膀胱炎的原因较复杂，与环磷酰胺、白消安、病毒、放射损伤和GVHD等因素有关，最常见原因为环磷酰胺。预防方法: (1)补液:每日补液5000-6000ml左右为宜，尤其在用环磷酰胺前4小时与最后一次用环磷酰胺后6小时适当增加输液速度更为重要，鼓励患者勤排尿。 (2)利尿。 (3)碱化尿液:使尿液pH值维持在7-8之间。 (4)α-疏基乙基磺酸钠盐(Mesna)，可减少环磷酰胺的毒性，用法:在用环磷酰胺后0、3、6、9小时各给药1次，静脉滴注，总量为环磷酰胺的12%-160%。 (三)间质性肺炎 本病一般发生在移植后前3个月内，主要因CMV感染引起，死亡率很高，间质性肺炎的主要临床表现有进行性呼吸困难，低氧血症。目前缺乏特效的治疗方法，主要在于预防预防用药:更昔洛韦或膦甲酸钠，还有用免疫球蛋白、大蒜素等预防大蒜素:1-2mg/(kg?d)，0-+90日。 11 (四)肝素静闭塞综合征(hepatic veno-occlusive diease,HVOD或VOD) VOD是一种心肝内小静脉纤维性闭塞为主要病理改变的疾病，VOD多发生于移植后1个月内，主要临床表现为肝区疼痛、肝肿大、黄疸、腹水、体重增加，严重者发生多脏器功能衰竭(肾、肺、心脏)。目前尚无特效方法治疗VOD，应以预防为主，用前列腺素E(prostaglandin E, PCE)预111防VOD有较好效果，PGE,0.3μg/(kg?d)，治疗:目前主要是对症支持治疗。有报道重组组织纤1 溶酶原激活物(recombinant tissue plasminogen aciva-tor, rh-gPA)联合小剂量肝素治疗有一定疗效。 (五)移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD) GVHD是allo-BMT的主要并发症和致死原因之一。一般100日以内发生的为急性GVHD，100日以后发生的为慢性GVHD。GVHD主要累及的靶器官为皮肤、肠道和肝脏。根据急性GVHD的严重程度分为四度慢性GVHD分为局限性广泛性(多器官受损)两类。 1(GVHD发生的风险因素 (1)供、受者HLA不完全相合的程序。 (2)供、受者之间性别不同(女性供者，男性患者)。 (3)移植前供者被异基因免疫活化(如输血等)。 (4)受者年龄较大。 (5)血清检测CM,阳性。 (,)供者淋巴细胞输注。 ,(急性,,,,分期与分度 见表,9-5和表3-9-6。 表3-9-5 靶器官当性GVHD分期 分期 皮肤 1,0 无皮疹 胆红素,2mg/d1 腹泻量,500ml/d 1+ 体表皮疹,25% 胆红素2-3mg/d1 腹泻量,500ml/d 2+ 体表皮疹25%-50% 胆红素3-6mg/d1 腹泻量,1000ml/d 3+ 全身皮疹、红斑 胆红素6-15mg/d1 腹泻量,1500ml/d 4+ 皮肤剥脱、水疱 胆红素,15mg/d1 腹前或肠梗阻 1)1ml/d1=17.1μmol/L 12 表3-9-6 急性GVHD分度 分度 皮肤 肝脏 肠道 功能损害 ?(轻度) 1+—2+ 0 0 0 ?(中度) 1+—3+ 1+ 1+ 1+ ?(重度) 2+—3+ 2+—3+ 2+—3+ 2+ ?(危及生命) 2+—4+ 2+—4+ 2+—4+ 3+ 3(急性GVHD的预防 (1)环孢素(ciclosporin A, CsA)与短程甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)联合使用，为目前广泛使用的预防方法。 22MTX 15mg/m+1日静脉用，10mg/ m分别于+3日，+6日，+11日静脉用。 CsA2.5mg/(kg?d)，分次给药，如无明显GVHD，则自第40日开始逐步减量，当血肌酐,226.4μmol/L(2mg%)时必须完全停药，第50日开始每周递减5%，直至6个月后完全停药。应用CsA治疗中，要定期(每周)监测CsA血清浓度，使其维持在200-400ng/ml。 22(2)单用MTX的预防:MTX15mg/ m+1日，10mg/ m分别于+3日，+6日，+11日用，以后 210mg/ m每周1次，共历经100日，此预防方法可降低移植后白血病的复发率。 (3)FK506(Tacrolimus,他克莫司):FK506是一种强效免疫抑制剂，与CsA作用相似，可替代CsA，但不可与CsA合用。一般起始剂量为0.03mg/(kg?d)，24小时持续静脉滴注，每周监测血药浓度，将血药浓度维持在10-20ng/ml。 (4)霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil, MMF, 骁悉):MMF作用机制分阻断T细胞和B细胞增生并下调黏附分子的表达，MMF与CsA联合应用可有效预防GVHD，用法:2g/d口服，主要毒副作用为白细胞闰少及胃肠道溃疡。 (5)清除供者T细胞:主要用于HLA配型不完全匹配或单倍体供者骨髓，有较好预防效果，但增加移植后白血病复发的风险。 对无亲缘关系BMT或HLA配型不完全匹配及单倍体MBT而不清除供者T细胞的患者还可加用抗胸腺细胞球蛋白、抗CD25单克隆抗体及霉酚酯预防急性GVHD。 4(急性GVHD的治疗 (1)在CsA与MTX联合预防GVHD基础上应用甲泼尼龙是治疗初期GVHD的最常用药物，甲 13 泼尼龙的剂量为2-20mg/(kg?d)，对有效的病例应逐渐减量维持。一般应用甲泼尼龙2mg/(kg?d)治疗初期患者，判断其无效的经验:?甲泼尼龙治疗3日后病情仍在进展。?甲泼尼龙治疗7日后病情无改善。?甲泼尼龙治疗14日后病情仍未完全控制者。 (2)治疗失败的病例需要接受二线治疗: 1)大剂量甲泼尼龙:5-20mg/(kg?d). 2)抗胸腺细胞球蛋白(anti-ghymocyte globulin, ATG):ATG是治疗急性GVHD的常用第二线药物，一般剂量:10-15mg/kg，隔日应用，疗程:7-14日。应用ATG后应积极防治感染。 3)各种单抗，如:OKT3，抗IL-2受体单抗(抗CD25)，抗TNF单抗。 4)新免疫抑制剂:MMF与FK506等。 5)布地奈德为肠道难吸收的糖皮质激素活性药物，控制肠道GVHD有效。 5(慢性GVHD预防 慢性GVHD多为急性GVHD发展而来，故预防慢性GVHD的主要方法是减少急性GVHD的发生和减低其发病程度。 6(慢性GVHD的治疗 局限性慢性GVHD的患者通常不需治疗，只需密切观察。 广泛性慢性GVHD的患者，联合应用泼尼松和CsA是目前认为最有效的，泼尼松1mg/(kg?d)，CsA6mg/(kg?d),q12h，两药交替隔天应用。定期监测CsA血药浓度，根据CsA血药浓度调整其用量。 (六)移植失败 移植失败主要有两方面原因: 1(供者的干细胞未在受者体内生长。 (1)患者没有输入足够的干细胞。 (2)干细胞体外损害:如清除供髓的T细胞时，可对造血干细胞有不同程度的损伤，损伤严重可导致移植失败。 (3)受者骨髓造血环境不良:如骨髓纤维化等。 2(宿主的免疫系统排斥 (1)再障患者移植前免疫系统致敏:如移植前输血，特别是输供者血，经产妇等。 (2)去T细胞的骨髓增加了排斥反应的风险。 应针对以上原因预防。 (七)白血病复发 BMT后白血病复发是影响BMT疗效的重要因素之一，白血病复发多发生在移植后前2-3年内，14 复发率由高到低排列为:同基因BMT,去T细胞BMT,无GVHD者,仅有急性GVHD者,仅有慢性GVHD者,兼有急性和慢性GVHD者，其复发还与移植时白血病的阶段和洒色体核型等有密切关系，以白血病的不同阶段为例:AML CRI患者的可能复发率20%-25%，第1次复发或CR2者为40%，AMI进展期60%;ALL高危型CRI 25%—35%，标危型CR2 45%，高危型CR2 55%，进展期75%;CML慢性期20%，加速期或急变期50%—80%。 1(预防 ?移植前提高抗白血病治疗质量，积极急取尽早做BMT。?过继免疫治疗(adoptive immunotherapy);如输注IL2、LAK细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induce killer,CIK)等。?检测肿瘤微小残留病(minimal residual dis-ease, MRD)，早期防治。?供者淋巴细胞输注(donor lympho-cyte infusion, DLI):参见“非清髓性异基因造血干细胞移植”部分。 2(治疗 BMT后白血病复发的患者预后差，首先应争取化疗再次达到完全缓解，然后进行第二次非清髓性异基因造血干细胞移植或BMT或外周血干细胞移植(peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT). 自体骨髓移植(autologous bone marrow transplanation, ABMT) 【适应症】 (一)恶性血液病 1(急性白血病 无HLA配型相匹配供者的患者，移植的最佳时机同allo-BMT。特别是细胞遗传学检查核型良好者，以及M3型CR2检测PML/RARα融合基因(—)者。 2(CML 因ABML很难消除Ph染色体(+)克隆，复发率高，一般不主张做ABMT。 3(多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM) 由于MM患者年龄偏高，故ABMT的移植相关并发症及死亡率低于allo-BMT，但ABMT后复发率较高，为降低复发率可施行第二次ABMT其适应症:?初期化疗有效或稳定的患者。?补救治疗有效或稳定的患者。 4(霍奇金病(Hodgkin Disease, HD) 一般通过联合化疗+放疗获得治愈或长期生存，大约有40%的进展病例复发，还有5%-10%对初治无效，对这些病例，最佳选择为大剂量化(放)疗联合自体造血干细胞移植。 (1)初诊时预后不良的HD而无骨髓受累者，包括初治不能缓解或缓解后复发者，对于复发病例可先行两三个疗程强化再诱导，尽可能减少体内瘤细胞负荷后移植。 (2)耐药或不能诱导达CR者，一旦明确后尽早移植。 15 5(非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)参见基因骨髓移植“适应症”。 (二)实体瘤 实体瘤对化疗、放疗敏感，但常规剂量达不到治愈目的，需要提高放化疗剂量的某些肿瘤，ABMT提供了其治疗方法。与恶性血液病比较，实体瘤早期骨髓未受侵犯，肿瘤污染机会少，其疗效不亚于恶性血液病。 1(乳腺癌 大多数有效的抗乳腺癌的化疗药物表现为剂量依赖性抗肿瘤效应，这些化疗药物方案包括烷化剂和其他药物联合，如:环磷酰胺、左旋苯丙氨酸氮芥、塞替哌、BCNU、顺铂或卡铂等。但随剂量提高其毒性反应亦随之增加，其最高剂量的限制主要在于骨髓抑制，如果接受自体骨髓移植，这些药物的剂量可以比标准剂量增加3倍以上，从而大大提高乳腺癌的疗效。成为目前实施自体骨髓移植最多的疾病之一。 (1)初治的?期、?期及炎性乳腺癌在常规诱导化疗(含多柔比星的方案)达CR或接受GR者。 (2)复发乳腺癌对规诱导化疗方案敏感(达CR或PR)等。 (3)?期腋下淋巴结转移6个以上及有其他不良预后因素者，作为术后常规辅助化疗后的强化治疗手段。 所有患者均应在移植后行常规的内分泌治疗。 2(卵巢癌 应用自体造血干细胞移植治疗卵巢癌是一种可望延长生命期的有效治疗方法。 3(小细胞肺癌 在局限性小细胞肺癌中，造血干细胞移植作为巩固治疗手段效果较好，患者的缓解时间延长，少数患者获得长期存活。 4(儿童实体瘤 如神经母细胞瘤、Ewing肉瘤等特别适用，这些肿瘤对数种化疗药物和放疗高度敏感，但晚期患儿预后不良。 5(其他 对恶性黑色素瘤、脑肿瘤、头预部肿瘤、硬化型胃癌、肉瘤等也有应用造血干细胞移植进行治疗的报道。 【术前准备】 基本同allo-BMT 【操作规程或要点】 (一)骨髓采集术 骨髓采集术同allo-BMT，供者是患者自己。 (二)采集骨髓血量的估计 16 8使造血重建的骨髓有核细胞最低阈值?0.5×10个/kg，如要进行体外净化处理，以上骨髓有核细胞数应加倍，留作补救备用，以防万一。 (三)预处理 根据原发肿瘤选择相应的方案。 (四)分离 ABMT需要采信骨髓血一般800-1200ml，由于容量大，直接冷冻保存有一定因素，而且还可出现红细胞溶、血凝块以及冷冻必需的二甲亚砜(dimthyl sulfoxide, DMSO)的用量增加，增加了回输时对患者的不良拓应。因此，需要分离去除骨髓血中的红细胞，其分离方法: 1(沉降法 (1)自然沉降法:简单，无需特殊设备，但费时，影响造血干细胞活性。 (2)加速沉降法:用右旋糖酐、羧甲基淀粉钠、羟乙基淀粉、白蛋白、明胶、甲基纤维等大分子聚合物中任意一种加入采集的骨髓血中，加速红细胞沉淀，使造血干细胞在体外常温下暴露的时间缩短，是一种简单快速的有效方法。 2(普通低温离心法 通过密度梯度离心法分离出骨髓有根细胞。 (五)体外净化 白血病ABMT的主要缺点是复发率高，体外净化是通过减少采集骨髓的残留白细病细胞来防治复发一种方法，有物理方法、药物方法、生物方法、免疫学方法以及这些方法的联合应用等。日 +常常用有效的体外净化方法为免疫磁珠分离法(参见“CD34细胞移植”中的“自体造血干细胞移植体外净化”部分)。 (六)保存 1(4?保存 4?保存方法简便，如普通冰箱即可进行，一般就用4?保存72小时的自体骨髓进行ABMT的病例，称植后患者的造血功能均能顺利重建。而且可以省去上述分离步骤，为大多数不具备冷冻条件的医疗单位所接受。 2(-196?冷冻保存 分离的骨髓有核细胞是液加入等量的冷冻保护液(包括组织培养液，20%DMSO和10%人AB型血清)以1-2?/min的速度程控降温，直到-80?后，立即投入液氮中冷冻保存(-196?)。从理论上讲造血细胞可保存存10年左右。 3(-80?冷冻保存 用5%DMSO(细胞内冷冻保护液)和6%羟乙基淀粉(HES)(细胞外冷冻保护液)作混合冷冻保护液冻存造血细胞，可以不经程控降温直接放入-80中冻存造血干细胞，造出细跑可保存1年左右。 17 (七)解冻与回输 当临床需要回输时，将冻存的骨髓有核细胞(造血细胞)置于40?恒温水箱中快速解冻，。约1-1.5分钟，解冻后立即回输，回输关留取标本测定造血干细胞的活性。如:台盼蓝拒染法、形态学检查及骨髓造血干细胞培养等。 【并发症的预防】 ABMT与allo-BMT相比，并发症减少，最大缺 1(移植前提高市白血病治疗质量，积极争取尽早做ABMT。 一般在诱导治疗完全缓解后，选择三四个强效化疗方案，或大剂量化疗(Ara-C或MTX或VP-6等)使体内残存白血病或肿瘤细胞减少至最低限度，防治髓外白敌国管，争取在CRI进行ABMT。 2、体外净化 适合有骨髓侵犯的肿瘤及复发的白血病。 3(检测MRD，早期防治。 4(过继免疫治疗(adoptive immunotherapy)如输注供者淋巴细胞、IL-2、LAK细胞、CIK细胞等。 5、诱导GVHD而产生有临床意义的GVL作用，如用CsA等，目前还在探索阶段。 (二)复发的治疗 对症支持治疗，再诱导缓解化疗、争取第2次非清髓性异基因造血干细胞移植或ABMT或PBSCT。 二、外周血干细胞移植 (peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT) 健康人在平稳状态下，外周血干细胞含量约为骨髓中的1/10-1/100。经有效方法动员后，外周血干细胞可增加数十倍，至数百倍。因此PBSCT不需麻醉手术采集骨髓，而且肿瘤细胞污染少，造血功能重建快，即使骨髓有种瘤细胞侵犯或者骨髓放射损伤者亦适合。PBSCT与骨髓移植相比， +能采集到更多的造血干细胞，便于造血干细胞体外处理(如CD34细胞纯化等)。上述优点便PBSCT技术迅速发展。 【操作规程或要点】 (一)干细胞的动员目前的主要动员方法有三种。 18 1(细胞毒性药物 如环磷酰胺(Cy)、阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素、米托蒽醌、依托泊苷(足叶乙苷、VP-16)等，这些药物可单独使用，也可联合使用，细胞毒性药物的选择，应尽可能 22遵守原发病的治疗方案。总之，大剂量的动员效果好，如:Cy4-7g/m，Ara-C2-3g/m，VP-16 2.0g/ 2m 2(细胞因子单独使用 主要有G-CEF、GM-CSF、IL-3等，目前多为G-CSF和GM-CSF单独或联合使用。 近年来，细胞因子主要动员健康的供者提高外周血于(祖)细胞。如前所述，平稳状态下，健康人的外周血干(祖)细胞含量很少，作为移植的干细跑来源程序是远远不的，因此，必须用动员方法使PBSC增加数十倍至百倍以上，若不加动员即行采集所需的循环血量很大。比较G-CSF、GM-CSF以及G-CSF+GM-CSF三种不同动员方法，发现G-CSF组和G-CSF+GM-CSF组优于单用GM-CSF组。应用细胞因子的不良反应仅表现低、中度发熟，轻微骨痛，短期内消失。用法:G-CSF5μg/(kg?d)皮下注射或静脉滴注，6日左右。 3(细胞毒性药物与细胞因子联合使用，这是目前对肿瘤患者最常用的动手方法，其优点在于既能动员足够量的干细胞，又可杀灭体内的肿瘤细胞，且动员效率明显高于上述两种方法。由于细胞毒性药物与细胞因子联合使用的动员方法具有明显优势，目前一般不采用单纯化疗作动员剂。常用联合化疗(遵守原发病的化疗方案)与GM-CSF联合方案较好，化疗后白细胞计数最好在0.1 9×10/L以下使用G/GM-CSF，G/GM-CSF的用法:皮下注射，直到采集完为止。 (二)采集 动员后，外周血中干细胞增高持续时间很短，要抓住采集最佳时机。由于动员前患者情况很大的可变性及外周血单个核细胞复的一致性，而且白细胞、单个核细胞(mononuclear cella, MNC) +不能完全代表CD34细胞，所以采集前必须监测外周血干(祖)细胞的质和量，只有掌握采集的最佳时机，采集到一定的干细，才能保证移植成功。 +1(检测 PBSCT时要对移植物中造血干(祖)细胞的数量进行检测。MNC、CD34细胞比例，CFU-GM产率均为简易方法，且间接反映造血干(祖)细胞含量可作为采集的有效指标。 (1)MNC:是更简单易行的检测方法，一般认为MNC的峰值与干(祖)细胞的峰值一致。但个体差异较大，多数学者认为MNC计数不是可靠指标。 +++(2)CD34细胞数:CD34细胞与造血干(祖)细胞有很好的相关性，由于CD34细胞的检测快速、准确，已被各移植中心采用。 (3)GM-CFU产率:亦是造血干(祖)细胞的有效指标，但需培养2周后才有结果，对指导 19 采集没有意义，只能作为回顾性分析指标。 +2(有集时机 如何确定最佳采集时机尚无定论。一般认为应由检测的外周CD34细胞峰值决定。下列一些指标可作为外周血干细胞(peripheral blood stem cell,PBSC)采集时机的参考: 9?PBSC动员化疗结束后2-3周。?外周血细胞升到(1-2)×10/L时。?若单用G-CSF动员，宜 99+在WBC升至(5-10)×10/L时。?血小板升到,50××10/L时。?外周血CD34细胞,1%时(正常0.2%?0.1%)。但具体采集时机尚要根据当时患者具体情况而定。 3(采集PBSC的估计 PBSCT的关键技术是如何将骨髓中的造血干细胞动员到外周血中，采 +集到足够数量的PBSC以便移值后造血恢复，特别是血小板，一般回输的PBSC中CFU-GM、CD34细 5+胞和MNC数要求至少达到下列标准(各家报道不尽相同，仅供参考):CUF-GM数,2×10/kg;CD34 685细胞数,2×10/kg;MNC数,7×10/kg;MNC数,7××10/kg (三)冻存 PBSC的采集一般需要3-4次才能达到造血重建所需要的量，而且从PBSC的采集到回轮要经过移植前的预处理阶段，所以每次所采集的细胞必须经低温保存，其保存方法有4?保存。-80?保存和—196?保存三种。参见“自体骨髓移植”的保存部分。 (四)预处理 见“异基因骨髓移植”部分 (五)回输 当采集PBSC时混入较多的血小板和血浆时，会增加凝集的机会，可应用少量抗凝剂(如肝素)预防。由于在冷冻与解冻过程中常导致一些细胞破坏，破碎的细胞及产物以及防冻剂(DMSO)可引起一些不良反应，经对症处理可控制，很少发生严重并发症。 非清髓性异基因造血干细胞移植 传统的异基因造血干细胞移植的预处理方案为清髓性的，通过清髓性的预处理来彻底根除恶性疾病，并提供足够的免疫抑制以防治移植物排斥。然而许多血液系统肿瘤细胞并不能因为大剂量放、化疗而根除，其根除作用在于异基因造血干细胞移植后免疫怀的移植物抗肿瘤效应。由于清髓性预处理方案过于强烈，常常造成很高的移植相关并发症与死亡率，使造血于细胞移植存在一定风险。 非清髓性异基因造血干细胞移植(non-myeloablative allo-geneic hematopoietic stem 20 cell transplantation,NST)是应用低毒性、非清髓性预处理方案诱导供、受者这间的免疫耐受，以获得移植物植入，最终通过移植物白血病(graft versus leukemia, GVL)或肿瘤(graft versus tumor, GVT)达到根治恶性肿瘤的目的。 NST的优势: (1)年龄范围扩大，50-60岁的患者，甚至70岁患者。 (2)能用于疾病状况较差或有脏器功能障碍，不能作传统HSCT者。 (3)移植相关并发症减少，死亡率降低。 (4)对年轻患者后期危险性减少(如生长发育迟缓、内分泌腺病、不育症等)。 (5)对混合嵌合体，通过DLI发挥GVL作用。 由于上述优势，NST应用逐渐增多，目前已扩大到非恶性疾病(如再生障碍性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、SLE等)。 【操作规程或要点】 (一)预处理 1(非清髓性预处理概念 非清髓性预处理方案未完全清除体内的造血细胞，如不回输造血干细胞自体将相对迅速地造血恢复(,28日,，一旦移植物植物，就会出现混合嵌合体。如移植物被排斥，自体造血快速恢复。与此不同的清髓性预处理后，要使造血快速恢复，必须进行造血干细胞移植。 2(常见非清髓性预处理方案 2(1)氟达拉宾(fludarabin):30ml/(m?d)×6日;白消安(Busulfan):4mg/(kg?d)×2日;ATG:5-10mg(kg?d)×4日。 (2)氟达拉宾(fludarabin):30mg/(m2?d)×6日;TBI:200cGy×1日。 2(3)氟达拉宾(fludarabin):30mg/(m2?d)×4日;美法仑(Melphalan):140-180mg/(m?d)×1日。 2(4)氟达拉宾(fludarabin):30mg/(m?d)×3日;白肖安(Busulfan):4mg/(kg?d)×2 2日;Cy:350mg(m?d)×3日。 (二)造血干细胞动员、采集、回输以及移植后并发症的防治等，基本同外周血干细胞移植及骨髓移植。 (三)免疫抑制剂应用 NST过程中，移植物的有效植入，非清髓性预处理的免疫抑制比骨髓抑制更重要，要维持供 21 者嵌合体稳定，还必须持续应用免疫抑制剂。免疫抑制剂除了抑制受者T淋巴细胞克服排斥反应，还抑制供者T细胞防治GVHD，但过强的抑制作用将会削弱移植物抗白血病或肿瘤(GVL/T)作用。因此，NST的免疫抑制剂的剂量，持续时间等问题，要根据据供、受者之间的免疫平衡状态，供者嵌合体的稳定性等决定。一般情况下应用免疫抑制剂的方案:环孢素(CsA)联合短疗程MTX(用法同骨髓移植章节)或加用霉酚酸酯(MMF)1.0/次，每日两次;如无GVHD，CsA可应用3-6个月，MMF:0-30日左右。 (四)供者嵌合体监测 1(供者ABO血型嵌合体监测 供、受者之间ABO血型不合的移植时，患者的ABO血型由移植前的血型转变为供者ABO血型，称为供者ABO血型嵌合体。供者ABO血型嵌合体的形成提示供者红缰胞系统的人。但移植后血型一般转变较迟，不能反映早期移植物的植入。 2(染色体或基因检测分析 当供、受者之间性别不同的移植时，染色体核型分析，可很好反映移植的植入，有些疾病存在染色体或基因异常，可作标记染色体或基因，如Ph染色体、t(8:21)、bcr/abl基因等，如移植后标记染色体或基因消失等。 3(短串联重复序列多态性分析 对于不同个体，短串联重复序列具有高度的长度多态性，该分析是目前检测异基因造血干细胞移植后移植物植入最先进、可靠的方法。NST后，如DNA多态性图谱中既出现供者条带，又有患者条带，则为混合嵌合体，如移植后患者有供者条带，而无患者移植前条带，为供者完全嵌合体;如患者移植后不出现供者条带，而是出现移植前受者条带，则为未植入或完全排斥。 (五)供者淋巴细胞输注(DLI) 造血干细胞移植后，供者的淋巴细胞可削弱受者T淋巴细胞对移植物的排斥，而促进移植物的植入，同时可通过供者淋巴细胞产生抗白血病作用。 1(DLI时机 移植后，过早输注可能会加重GVHD，目前DLI作为防治肿瘤复发为目的者，多主张在移植30日后，造血重建形成嵌合体，又无?度以上的GVHD。 2(方法 DLI有两种:一种为单次大剂量淋巴细胞输注(bulik dose regimen, BDR)，另一种为细胞数量递增的淋巴细胞输注(escalating dose regimen, EDR)，EDR在诱导GVL同时，不发生GVHD，是目前常用方法。 +778883(CD3细胞数递增 1×10?5×10?1×10，平均DLI 1.2×10/kg(0.05×10/kg-2.7×8+10/kg)。当供、受者HLA不完全相合的移植时，CD3细胞回输量要低于HLA完全相合者，一般为 +CD3细胞104/kg为宜。 22 三、其他造血干细胞移植 +CD34细胞移植 ++CD34抗原是一种跨膜糖蛋白，CD34在造血干细胞上表达最强，随着干细胞分化为定向祖细 ++胞，其表达逐渐减弱直到消失。研究证实，许多恶性肿瘤细胞不表达CD34抗原，这正是利用CD34抗原分选和富集正常造血细胞的基础。 1(自体造血干细胞移植体外净化 由于检测肿瘤微小残留病(MRD)敏感技术的应用，已经有越来越多的证据证明PBSC仍有种瘤细胞污染。 +CD34抗原在恶性肿瘤细胞与造血干细胞表达差异为自体造血干细胞的体外净化提供可能，一 ++般而言，肿瘤细胞膜上CD34抗原的表达与否常与该肿瘤细胞起源的正常细胞的表面密切相关。CD34表达的恶性肿瘤包括:慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺瘤、 ++神经细胞瘤等。因此，对于CD34的恶性肿瘤患者的外周血干细胞进行CD34细胞分选与富集，然后进行PBSCT，可有效清除残留肿瘤细胞，减少复发。 +2(异基因外周血CD34细胞移植 对于HLA不相合或半相合造敌国细胞移植，可防治急性GVHD，将采集的外周血干细胞产物经 ++分选富集CD34细胞后，不仅获得高纯度足量的CD34细胞用于临床移植，还可去除二至五个对数据的T淋巴细胞，这对异基因供、受者之间移植后减少GVHD的发生有十分重要意义。 +3(CD34细胞分选 +目前应用较多的CD34细胞分选方法为免疫磁珠分离法，其中CliniMACS临床细胞分选系统是目前临床应用较理想和广泛的细胞分选系统之一。 +首先，将G-CSF等动员的外周血经血细胞分离机(如Cs3000plus)分离获得单个核细胞，CD34细胞被免疫磁珠特异标记，磁性标记完成后，CliniMACS自动将细胞通过位于永久性磁场中的分选柱，磁性标记的阳性细胞被吸附在分选柱中，未标记的阴性细胞则流出分选柱，而将两者分离。然后，CliniMACS将分选柱移出磁场，再将吸附于柱上的阳性细胞洗脱出来，收集备用。用CliniMACS +分选系统分选后，CD34细胞的纯度和回收率为96%和67%以上，T细胞去除率达95%以上。 23 四、脐血干细胞移植 脐血(umbilical cord blood, CB)通常当作废物而被丢弃。1988年Broxmyer等提出脐血含有丰富的干细胞，可供造血干细胞移植。同年，Gluckman等首先采用有亲缘关系的脐血治疗Fanconi贫血获得成功。这一继骨髓、外周血和胎肝之后的新的造血干细胞来源，引起国际上广泛重视。已接受脐血移植的病种包括:血液系统恶性肿瘤、实体瘤、遗传性血液病、代谢性疾病等。脐血具有:丰富的造血干细胞、来源广泛、供者无危险、GVHD轻、可进行HLA数据库管理等优点。研究结果表明，成人也可以成功地接受脐血干细胞移植。可以预计，脐血将成为非亲缘关系受者移植时较好地干细胞来源。 脐血HLA配型: 用血清学和分子生物学等方法分析有核细胞的HLA-?、?抗原及其基因片段。?借助同种血清检测有核细胞表面抗原，如HLA-A、B、C、DR等。?DNA分析:如用等位基因特异性寡核苷酸探针或限制性长度多态分析来检查。 同胞间脐血干细胞移植 【脐血选择】 1(HLA配型选择脐血 根据HLA-?:A、B位点及HLA-?:DR位点配型，首选HLA配型完全相合的脐血，如只有部分相合，按DR,B,A的顺序选择。 74+2(脐血细胞数选择脐血 脐血单个核细胞数:,2×10/kg，CFU-GM:,1.5×10/kg，CD34 5细胞,1.5×10/kg。 【脐血采集】 1(供者的条件 选择新生儿与其母均健康的脐血。产妇分娩时坻 发热，产妇无贫血，妊娠足月，非早产儿，产妇胎儿无遗传性疾病，无新生儿儿窒息、水肿、黄疸、羊水内无胎粪，胎盘剥离分娩时间,12小时。 2(采血时间 新生儿娩出后立即开始采血，采血完毕时间不超过分娩后5分钟。 3(采血方法 在距新生儿肚脐5-7cm处用两个血管钳夹住脐带，再在两钳间将脐带切断。待新生儿离开后采集。抗凝剂:有肝素，ACD(枸橼酸盐和葡萄糖)和CPD A24 (cirate/phos-phate/dextrose/adenine，枸橼酸盐/磷酸盐/葡聚糖/腺苷)。其中，CPD A为等张，中性pH值，而且不受所采集CB体积的影响，现多被采用。采集用带16号针头内有CPDA约23ml的采血袋，适合采集170ml以内的脐血。采集前用2%碘酊和75%乙醇溶液依次消毒脐带欲穿刺处，通过脐静脉穿刺收集脐血。一般每个胎盘可采集42-240ml。 4(分离 6%HES按1:5(HES: CB)体积比加入抗凝脐血混匀，然后在原收集袋离心(10?,50g,5分钟)，收集富含单个核细胞(mononuclear call，MNC)的上清液到一个,160ml的血浆袋中，离心(400g，10分钟)移出上清液，最后把沉淀的MNC加入20ml血浆混悬。取少许标本检则和计数。 5(冻存 -80?可保存1年，-196?可保存10年，需要时可随时解冻。同胞间脐血干细胞活性受损。 6(血样检测 取一份脐血样做细菌与真菌培养和HLA型分析。另外取母血做必要的血清学检查，包括抗HIV-1与HIV-2、CMV、HTLV-1、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等。 每一份脐血收集完成后，应进行规范化管理，要认真仔细填写卡片，包括:供血资料:产科姓名、年龄、床号、住院，血型，化验检查，新生儿性别、体重、血型等，以备查访;采集情况:采血日期及时间，采血方式，采血量等;血样监测情况;分离保存及活性;MNC计数及HLA型分析，保存日期与编号等。 非血缘关系的脐血干细胞移植 脐血来源于脐血库，通过HLA配型及脐血细胞数量选择脐血。 脐血干细胞移植的术前准备、操作步聚、适应证和并发症及其防治基本同上述。以往脐血移植都是在儿童身上进行的，临床研究提示，一份脐血所含的干细胞量可供成人造血重建。 脐血干细胞移植存在的问题及展望; (1)脐血量有限，无法根据患者体重大小调节输入剂量。 (2)具有潜在的传递先天性疾病的可能。 (3)如果移植失败，无备用供者的骨髓或外周血采集。 (4)植活慢，增加了感染、出血的机会。 脐血体外扩增方法的改良和优化、双份或多份脐血的应用等将有助于扩展脐血在临床干细胞移植领域的应用范围，增加移植、特别是成人移植成功的机会。 25 26