DNA检验技术在法医的应用及亲子鉴定（可编辑）

DNA检验技术在法医的应用及亲子鉴定（可编辑） DNA检验技术在法医的应用及亲子鉴定 DNA检验技术在法医的应用 及亲子鉴定 武汉大学三级教授 美国马里兰大学兼职教授 闫 平 结束 3、排除概率计算原理 排除概率的大小取决于遗传方式和群体基因频率。现以MN血型为例说明排除概率的计算原理。设M和N基因频率分别为p和q，在Hardy―Weinberg平衡状态下，群体中基因频率和基因型频率保持世代不变，下列表达式反映了群体中基因频率和基因型频率的数学关系。 (二)DNA序列多态性 DNA序列多态性(sequence polymorphism)的形成与DNA碱基长度无关，主要与DNA某位点一个或多个核苷酸在不同个体中变异有关。DNA序列多态性有时采用测序法直接检测各个位点的碱基差异，比如线粒体DNA测序，有时采用间接检验，比如HLA DQa采用特异性探针杂交法，ABO基因型则采用酶切ABO等位基因扩增产物，由于酶切产物碱基长度不同而间接的显示由于碱基变异而引起的DNA序列多态性。HLA、PM、ABO、MN、酶基因型、血清型及线粒体测序等，均为DNA序列多态性。 DNA长度多态性及序列多态性二种分类法，较全面的概括了 所有DNA多态性检验内容。 (三)线粒体DNA 线粒体是含有染色体外基因组的小细胞器。它的基因组独立于核基因组，呈母系遗传。线粒体DNA mtDNA 为环状DNA，有16569碱基对，含37个编码氧化磷酸化过程相关物质的基因，还有一个复制控制区称为D―环区。该区在个体间呈现多态性，可用于人类个体识别。 人类mtDNA在英国剑桥Sanger实验室首次完成了全 序列测定。这个最初测定的序列 基因库编码:M63933 作为比对的参考序列，通常被称为Anderson序列或剑桥序列。 在检测个体间的差异上，线粒体DNA不如其他方法有用，但mtDNA对陈旧骨、牙、严重腐败或焚烧的残骸以及单根毛干的检测成功率比核DNA高。 通常mtDNA在很多代当中的传递都是稳定的，通过mtDNA检测可以估计几代人间的亲缘关系。 五、个人识别结果评估: 通过分析检材遗传标记为案件侦查提供线索，为审判提供科学依据。 统计学理论是遗传标记分析作为科学证据的基础。法医个人识别时，包括DNA在内的任何遗传标记分析都是基于这种统计学理论。 DNA遗传标记多态性程度远远高于血型，DNA遗传标记具有大量的等位基因及基因型。足以区别群体中的不同个体，也易于实现高概率认定。因此人们常常说，DNA分析使法医学检验实现了从只能否定嫌疑人到可以肯定嫌疑人的飞跃。这里，“否定”与“肯定”涉及到评估法医个人识别的科学证据意义，而这类评估至少需要考虑遗传标记的系统效能和遗传标记对于具体个案的鉴定能力两方面因素。 1、遗传标记个人识别的系统效能 遗传标记的多态性程度越高，应用该遗传标记进行法医学个人识别的效能就越高。系统效能可用个人识别能力(discrimination power，DP 定量。个人识别能力指从群体中随机抽取两名个体，其遗传标记表型不相同的概率。 2、遗传标记对具体个案的鉴定能力。 DNA遗传标记的系统效能更多地是针对选择遗传标记而言的。对于具体个案鉴定，法医学专家通过使样本的一系列表型组成一个稀有现象的策略来提供科学证据。 个人识别通过比较两个样本的一系列表型，从而判断两个样本是否来自同一个体。检测的基因座数越多且型别一致，证据的作用越大。例如，谋杀案中，现场血痕与嫌疑人13个STR表型相同。以频率来估计概率，这种表 型组合在群体中的稀有程度可由表型频率按照乘法定律求得 见表 。 虽然血痕既可能是嫌疑人留下的，也可能是其他人留下的。我们可以评估在其他人中发现这种表型组合的概率。 在同一性鉴定中，法医统计学更倾向用似然率 Likelihood，LR 来评估遗传分析提供的证据强度。似然率基于两个表型组合来自同一个体的假设衡量证据的强度。例如，现场血痕DNA和嫌疑人血液DNA表型组合均为X，可以考虑两种假设:?现场血痕是嫌疑人所留 原告假设 ;?现场血痕是一个与案件无关的随机个体所留 被告假设 。似然率是假设;?条件下现场血痕与嫌疑人的表型组合都是X的概率与假设;?条件下现场血痕与嫌疑人的表型组合都是X的概率之比。似然率越大，支持假设?的证据强度越大。 六、法医DNA检验的发展趋势。 1、法医DNA数据库 随着DNA分型技术的发展及应用，建立DNA数据库已成为法医遗传学最主要的发展方向之一。法医DNA数据库主要包括在罪犯人群中构建的前科库及由现场检材的DNA分析结果构成的现场库。该库的作用在于有案件发生时，从现场采集罪犯遗留的血痕、精斑或唾液等检材进行DNA分型，与前科库内数据比较，为侦察提供犯罪嫌疑人可能是何人的线索;两者不吻合时，排除库内人员是犯罪嫌疑人，缩小侦察范围，提高破案效率。同时，现场检材的DNA分析结果还可与现场库中数据比较，进行串并案，为系列案件及以往未破案件提供科学证据与侦破线索。此外还有一些为某种特殊目的而建立的数据库，如失踪人员父母及子女数据库，可通过网络查询认定失踪人员，并对一些无名尸体、碎尸和空难、交通事故等中的受害者进行身源认定。 英国是世界上建库最早的国家。1993年英国皇家刑事审判专门调查委员会建议警察可以提取嫌疑人体内样本用于DNA检验，1994年《刑事审判与公共秩序法》授权法庭科学服务中心进行DNA数据库的研究，1995年4 月该条例正式成为大英法律，确保了DNA数据库建设的合法性。欧洲国家法庭科学机构网络 简称ENFSl 的DNA工作组计划使各成员国建立的DNA数据库兼容并数据共享，选择推荐vWA、FGA、TH01、D3S1358、D8S1179、D18S51及D21S11七个基因座建立欧洲DNA数据库。 1991年美国国会通过了关于建立DNA数据库的法案，为建立全美的DNA数据库提供了法律依据。FBI有关DNA技术执行的是《法庭科学DNA检验实验室质量认证》和《犯罪嫌疑人DNA数据库实验室质量确认标准》。美国、澳大利亚、芬兰、西班牙、比利时、瑞士、加拿大、意大利、丹麦、新西兰、英国、挪威等国家及中国香港地区采用了CODIS系统建设DNA数据库。 国内虽未就建设DNA数据库立法，但近年来已在DNA数据库的建立方面进行了一些有益的探索。 2、混合样品检验 迄今为至，多人份样品混合后确定各个个体基因型，仍为法医DNA检验的难，随着DNA检验技术的发展，是否可通过定量分析峰面积、测序等技术来区别不同个体的等位基因，国外已有人探索，相信不久将来会解决这一问题。 3、DNA芯片技术在法医检验中的开发应用 把检验多个不同的多态性位点的多种探针固定于特殊载体上，当检材中DNA与该载体上探针分子杂交时，由于不同位点DNA可与相对应的探针同时特异性杂交，一次检验可以得到多个DNA位点多态性结果。由于固定DNA探针的特殊载体很小且附着很多种不同探针，似计算机芯片，装载有无穷信息，所以叫做DNA芯片 DNAchip 技术，又叫基因芯片 Genechip 技术。随着DNA芯片技术在法医检验中的开发应用，相信能使法医DNA检验上一个新台阶。 4、人类基因组计划对法医DNA检验的影响 人类基因组计划就是要测定人基因组中所有3×109bp碱基序列，一般有4个步骤: 1 确立基因在染色体上的排列，建立遗传图谱; 2 用限制性内切酶切割目的基因， 获得物理图谱; 3 测序; 4 综合分析结果，构成完整人基因组碱基序列。随着人类基因组计划的完成，可能会找到多态性程度更高的DNA片段，使法医DNA种属检验、个体识别及亲子鉴定等翻开新的一页。 5、酶型血清型检验 蛋白质水平多态酶型及血清型检验在传统法医物证检验中发挥了重要作用，随着DNA研究的深入，目前在DNA水平上可进行多种多态酶及血清型检验，包括GPT、PGM1、EsD、ADA、GLOI及Rh、C3、C6、Tf等，克服了蛋白质容易变性失活等缺点，延长了检验时间，并且节约检材。 法医DNA分型的任务是为侦察罪犯、审理案件提供科学证据。法医学应用的DNA长度多态性主要指串联重复序列，结构特征为基序呈串联重复排列。按基序长短及产生多态性的机制，可以简单分为小卫星DNA和微卫星DNA。法医应用最多的是STR分型。序列多态性是指DNA分子中某位置上碱基排列的个体差异。法医使用的序列多态性目前最主要的是线粒体DNA序列分析。法医对DNA个人识别证据的评估，至少需要考虑遗传标记系统的效能和具体案件的鉴定结果，给法庭提供一个量化的科学证据。应该强调的是，如果只简单地做少数几个DNA遗传标记，鉴定所提供的证据强度是有限的，而联合使用多个DNA遗传标记，可提高证据强度。 亲子鉴定 亲子鉴定 parentage testind 是应用遗传标记，根据遗传规律对被控父母与子女血缘关系的鉴定。 涉及父母与子女关系的亲权纠纷 disputed parentage 可见于:?私生子，女方指控某男子是孩子的生父;?已婚夫妇，丈夫怀疑孩子非他所生;?怀疑医院调错婴儿;?失散儿童及失散亲属的确认;?超生子女的血缘鉴定;?财产继承纠纷;?移民案件的血缘鉴定;?拐骗儿童案;?强奸致孕案，嫌疑人否认他涉案时。 用于鉴定亲子关系的遗传标记，应该是一种简单的遗传性状，遗传方式已被确定，具有遗传多态性，最少见基因 的频率一般大于0.01，具有比较高的排除亲子关系能力。在出生时，该遗传标记已完全表现，并且终生不变，不受年龄、疾病及其他环境因素的影响。 检测遗传标记需用标准化方法，标准化方法的必备条件为:?基因座定义和具有的特征已有文献报道。 ?种属特异性、灵敏性、稳定性研究已实施。?有可供使用的群体遗传数据。群体遗传数据包括从有关人群中获得的该基因座等位基因频率和单倍型频率。?用于亲子鉴定的实验方法与用于群体遗传数据分析的实验方法完全相同。 目前可接受的标准实验方法有:红细胞血型、白细胞血型、红细胞酶型、血清型、单基因座探针限制性片段长度多态性 DNA纹印 及单基因座扩增片段长度多态性，包括用聚合酶链反应 PCR 检测的可变数目串联重复多态性 VNTR 和短串联重复多态性 STR 。其他实验方法对于亲子关系鉴定可能也有效，可作为补充实验，例如多基因座探针限制性片段长度多态性 DNA指纹 ，但不能代替标准化实验方法。 一、亲子鉴定基本原理 1(遗传学三定律 孟德尔是现代遗传学的奠基人，遗传学三定律中有两个为其本人研究发现，第三个定律由摩尔根发现。这三个遗传学定律是法医DNA个体识别及亲子鉴定总的理论基础。 ?(孟德尔第一定律――分离律 孟德尔假说，配子结合发育成的个体，含有成对的因子 等位基因 ，每一对因子可以是相同的，也可以是不同的。如果相同，则这一对因子就是纯合子 homozygote ，如果不同，就是杂合子 hetemzygote 。在形成配子时，一对基因相互分离，各到不同配子中去，每个配子只有该等位基因中的一个基因，在受精时，不同配子间的两个等位基因又以同等机会互相结合，形成合子。人们将孟德尔提出的这个重要原理称为分离律 1awofsegregation 。 根据孟德尔分离律，表现为显性性状的个体，有可能是纯合子 AA ，有可能是杂合子 Aa ，虽其表现型 phenotype 均相同 同 为显性 ，但基因型 genotype 不同，分别为AA、Aa。分离律主要阐述等位基因之间的遗传规律。 ?(孟德尔第二定律――自由组合律 孟德尔的实验表明，非等位基因在配子形成时可以自由组合到不同生殖细胞中，人们将这条法则称为孟德尔第二定律，即自由组合律 1awof independent assortment 。自由组合律主要阐述不同染色体之间基因的自由组合规律。 ?、连锁和交换定律 现代研究表明，孟德尔自由组合律适合于分布在不同染色体上的基因，对于位于同一条染色体上相距较近的非等位基因，则不能适用。 摩尔根等提出了连锁和交换定律。同一条染色体上的遗传因子连在一起一同遗传的现象，称为连锁(linkage)，二个同源染色体上遗传因子的相互交换，称为交换(crossing over)。同一条染色体上不同基因是否有连锁关系，与基因间距离大小有关，距离越近，越不易交换，越具有连锁关系。 亲子鉴定的基本原理有以下两点: ?在肯定孩子的某个等位基因是来自生父，而被控父亲 alleged father, AF 并不带有这个基因的情况下，可以排除他是孩子的生父。显然，检查的遗传标记越多，非生物学父亲被排除的概率就越大。 ?在肯定孩子的某些等位基因是来自生父，而被控父亲也带有这些基因的情况下，不能排除他是孩子的生父。这时可以计算如果判断他是孩子生父，理论上的把握度究竟有多大。 在一个双等位基因遗传标记系统中，排除和不排除亲子关系的各种格局如表所示。在一个家庭中，血型的遗传规律可概括为:?孩子不可能带有双亲均无的等位基因;?孩子必定得到双亲每方的一对等位基因中的一个;?除了在双亲都带有相同基因 如A 的情况下，孩子不可能带有两个相同基因 AA ;?某个基因在双亲中的一方或双方为纯合子时 AA ，必定要在孩子中表现出来 A 。双等位基因遗传标记系统亲子鉴定的基本原理可以推广用于多个等位基因的遗传标记。如 STR系统。 二、否定父权 排除亲子关系可以归纳为如下两种情况: ?孩子带有母亲和被控父亲双方都没有的一个基因，?孩子没有被控父亲必定要传递给其后代的一个基因。 在大多数的亲子鉴定案例中，一般已知母亲是孩子的生母，问题是要鉴定父亲是否为孩子的生父。如果母亲不带有孩子的某些基因，那么可推断这些基因一定来自生父。根据遗传规律，排除父子关系有四种类型 见表l 前两类被称为直接排除;后两类是根据阴性反应结果检出纯合子，被称为间接排除。 1、错误否定父权的危险性 测试的遗传标记增多，遇到遗传变异的可能性也增加。遗传变异使亲子之间的遗传关系呈现为不符合遗传规律。如果缺乏这方面的知识，容易错误否定父权。遗传变异主要有:沉默基因、替代等位基因、基因缺失、血型变异、基因互换、基因突变、弱抗原、嵌合体、镶嵌抗原、生理与病理性变异等。尽管遇到遗传变异概率很低，为了避免潜在遗传变异的影响，亲权鉴定须由专业技术人员严格把关，排除父权至少应根据两个以上遗传标记。 2、非父排除概率 非父排除概率指不是小孩生父的男子能被遗传标记排除的概率。不是小孩生父的男子被误控为生父时，理论上可以根据遗传标记检测予以否定。但在遗传标记的鉴别能力较差时，无血缘关系的男子与小孩的遗传标记偶然也会符合遗传规律，因而不能否定他与孩子有亲子关系。例如，单独使用一个血型时，有时不能提供排除的信息。假设母亲和孩子都为B型，则A，B，O和AB四种表型的男子，都有可能是孩子的生父。为此需要检查更多的遗传标记。对孩子的生父来说，不论检查多少遗传标记，都不可能找到排除他与孩子有亲子关系的证据;而对于不是孩子生父的男子，随着检测遗传标记的增加，他被排除的概率就越大。 不同遗传标记多态性程度高低不同，无关男子因偶然机会不能被排除的概率也有高有低，因此有必要 知道不是小孩生父而被控为生父的男子，应用某一种遗传标记检测有多大的可能性能被排除父权。这就是通常所说的父权排除概率 excluding probabili-ty of paternity, EP ,确切地说是非父排除概率，它是衡量遗传标记系统在亲子鉴定中实用价值大小的客观指标。 DNA检验技术在法医的应用 一、DNA存在的部位: 细胞有原核细胞和真核细胞之分。原核细胞比真核细胞小，结构也简单得多，它除了表面的细胞膜以外，没有成形的细胞核，也没有其他细胞器，但有一个被称为染色体的环状DNA分子，它和RNA、酶等组成一个基因转录转译系统，此外，细胞质中还可含有一些小分子DNA，称为质粒。真核细胞比原核细胞大，有细胞膜(植物细胞膜外还有细胞壁)、细胞核(包括核膜、核质、染色质及核仁等)、细胞质、细胞器(线粒体等)。 高等动物由真核细胞组成，有二套遗传物质，即DNA，一套位于细胞核染色质内，一套位于细胞器线粒体内。细胞的遗传物质没有组织特异性，有个体、种属特异性。 真核细胞染色质的主要成分是DNA和蛋白质。人的每个体细胞有23对46条染色体，为双倍体，其中22对44条为常染色体，男女共有，另外一对决定性别，为性染色体，女性为XX，男性为XY。每对常染色体中之一分别来自父、母亲，叫做同源染色体。人的精子及卵子中仅有23条染色体，为单倍体。以着丝粒为界，每一条染色体的两臂分别命名为p(短臂)及q(长臂)，p、q两臂以着丝粒为中心又细分为区、带等。(见下图) 线粒体是细胞呼吸及能量代谢中心，含有DNA及核糖体，有自己的一套遗传系统，能按照自己的DNA信息编码合成一些蛋白质，组成线粒体的蛋白质约有10%就是由线粒体本身DNA编码合成的。 二、遗传标记: 1、遗传多态性(genetic polymvr phism):在随机交配无血缘关系的群体中，个体的一种遗传性状存在两种以上具有相对差异类型的现象称之为遗传多态 性。 2、平衡多态性:遗传多态性可能以不同的类型按一定比例在几代仍维持不变称为平衡多态性。 3、遗传标记:具有平衡多态性的遗传性状，作为标志用以识别携带它的个体、细胞、染色体或用以研究家系和群体的遗传方式时，称为遗传标记。 遗传标记分为:表型 、基因和基因型。 基因――是指位于染色体上的一段DNA序列，能够表达出特定的功能，决定特定的遗传性状。 基因座――基因在染色体上的位置。 等位基因――位于同源染色体上，相同座位的一对基因称为等位基因。 基因型(genotype)是指该基因座上成对等位基因的组成。 纯合子与杂合子 : 一个基因座上成对的等位基因相同时，称该基因座为纯合子;不同时称为杂合子。 表型(pheno type)是指通过一定手段观察到的个体性状。 三、DNA的结构与理化特性: 1、DNA的基本结构: DNA的基本结构单位是核苷酸，由磷酸，糖和碱基组成。核酸分为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)和核糖核酸(ribonllcleic acid)两大类。 每一个核苷酸分子含有一个戍糖(核糖或脱氧核糖)分子，一个磷酸分子和一个含氮的有机碱。 有机碱分子分两类:一类是嘌呤，一类是嘧啶。 嘌呤包括腺嘌呤(adenine, A) 鸟嘌呤(guanine, G) 嘧啶包括 胸腺嘧啶(thymine,T) 胞嘧啶(cytosime,C) 尿嘧啶(uracil,U) 戍糖分子上第一位碳原子与嘌呤或嘧啶结合，就成为核苷。如果是脱氧核糖形成的核苷就是脱氧核糖核苷，如果戍糖是核糖，形成的核苷就是核糖核苷。 一个核苷与一个磷酸的分子结合，就构成一个核苷酸(nucleotide,nt)磷酸与核糖或脱氧核糖结合的部位通常是核糖或脱氧核糖的第3位或第5位碳原子。即3’端和5’端。 多个核苷酸以磷酸顺序相连而成长链的多核苷酸分子，即构成核酸的基本结构。一般核苷酸链少于50个核苷 酸的称为寡核苷酸。 DNA的碱基构成有4种 A，G，T，C RNA的碱基构成为A，G，U，C 4种。 DNA分子是双链的，这两条链的走向是相反的，是反平行的。 多核苷酸长链是通过磷酸和戍糖的3’、5’碳原子共价相连而成的，因此长链的两端是不同的，一端是3’端(3’C-OH)，一端是5’端(5’C-PO4)。DNA分子的一条长链是以5 ’到3’,另一条长链是从3’到5’。 两链的碱基互相以氢链相连成对，这就是碱基对(basepair,bp)，一般用bp数表示DNA分子大小。 A总是与 T配对，A、T之间以2个氢键相连; G总是与 C配对，G、C之间以3个氢键相连。 DNA二条长链不是直线形的，而是互相缠绕而成螺旋形的分子。 真核细胞中的DNA碱基序列，很多都是没有表达功能，没有基因的特征，不能表达为蛋白质，即为内含子(intron)，有基因功能的不超过10%，为外显子(exon)。 人有46条染色体，约有40亿碱基对，人DNA有基因功能的不过10%。真核细胞DNA的另一个特点是有许多重复的碱基序列。 人线粒体DNA为双链环状。 2、DNA的复制与变性和复性。 1953年Waston和Crick提出DNA双螺旋模型及DNA自我半保留复制学说。 DNA复制过程: ?DNA分子2条链分开成单链; ?每一条链上所露出来的碱基各自与一个游离核中的互补核苷酸碱基相连，即A和T，G和C相连。 ?在DNA聚合酶的催化下形成新链，新链由一条旧链和一条新链组成。 DNA的变性和复性 双链DNA加热至生理温度以上(接近100OC)数分钟时，双链间氢键断裂，最后双链完全分开并成为无规线团，这一过程叫做DNA变性(denaturation)或融解。(又称为热变性) 加热，过高或过低的PH，有机溶剂，尿素，甲跣胺等试剂均可使DNA变性。PH过高引起的变性称为碱变性。 DNA变性是可逆的，只要消除了变性条件，分开的两条互补链又 可重新结合，恢复原来的链结构，这过程称为复性。 根据核酸分子变性和复性的性质，通过碱基配对使不同来源的两条多核苷酸链的相互结合称为核酸的分子杂交(hybridization)。 四、DNA多态性检验: DNA多态性(DNA Polymorphism)是指一定染色体一定部位DNA碱基长度或组成在人群中存在差异。 DNA多态性形成的主要原因是基因的突变。法医学应用的DNA多态性分为长度多态性(length polymorphism)和序列多态性(sequence polymorphism)两类，前者指等位基因间片段长度差异，后者指等位基因间的碱基序列差异 法医学所用长度多态性的结构基础是串联重复序列，特征为一段称为基序(motif)的DNA呈串联重复排列。 按基序长短及产生多态性的机制，可以简单分为小卫星DNA和微卫星DNA。若基序数增减主要由不等交换机制产生，则基序较长，如8,100bp，称为小卫星DNA(minisatellite DNA)或可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeats, VNTR);若基序数增减主要由复制滑脱机制产生，则基序较短，如2,6bp，称为微卫星DNA(microsatellite DNA)或短串联重复序列(short tandem repeats, STR)。基序的序列是相对不变的。不同个体间不同的是基序的重复次数。例如，小卫星DNA中基序的重复次数在不同个体间的变化极大，在一些个体可能是数十次左右，在另一些个体可能是数百次。这种DNA的高度变异性是进行个体识别和亲子鉴定的基础。 (一)长度多态性分型 长度多态性是个体遗传特征在群体中的反映，对个体遗传标记的表型或基因型分型的技术方法分为限制性片段长度多态性 restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP 和扩增片段长度多态性 ampli-fication fragment length polymorphism，Amp,FLP 。 1、限制片段长度多态性 从不同的组织或细胞中获取大分子的DNA，一般采 用蛋白酶K消化、酚和氯仿抽提蛋白质、乙醇沉淀DNA的方法。对提取到的DNA定量后，经限制酶切割成大小不同的片段，琼脂糖电泳分离后按分子大小排列。用特定DNA探针与含有串联重复序列的DNA片段进行Southern杂交并自显影。不同个体串联重复的基序数目不同，自显影胶片上显示的片段大小就不同。限制片段长度多态性检测主要包括以下步骤。 1 DNA的限制性酶切 用适当的限制酶切割DNA分子。选择限制性内切酶的原则是:?重复序列中无该限制酶的酶切位点，以保证重复序列的完整性;?选择具有较少识别序列的酶，酶切所产生的片段不至于太多，容易由电泳分离。 (2)DNA限制性片段的电泳分离; (3)DNA片段的Southern印迹 电泳分离后，切片段转移到支持膜上。选用的支持膜通常是硝酸纤维素膜或尼龙膜。此法最先由Southern建立，故称为Southern印迹法。用碱使支持膜上DNA变性，解链成单链分子，再进行分子杂交。 (4)分子杂交 固定在支持膜上的变性DNA片段与DNA探针进行分子杂交。DNA探针是已知核苷酸序列的带有标记物的单链DNA片段。DNA探针的标记物分为两类:放射性同位素标记和非放射性物质标记，后者主要有辣根过氧化物酶、地高辛、碱性磷酸酶、生物素及光敏生物素等。采用缺口平移法、随机引物延伸法、末端标记法及光化学标记法等标记到单链DNA分子上形成探针。 (5)杂交信号的显示 杂交后洗去游离的探针，膜与X射线片重叠，置于暗匣中，杂交DNA片段中的DNA探针通过放射自显影使X射线片感光，X射线片显影后在杂交DNA片段对应位置出现黑色条带，得到DNA图谱。不同个体串联重复的基序数目不同。 法医RFLP分析的是基因组小卫星DNA，根据探针特性有两种类型。一种是多基因座探针(multi-lo-cus probe, MLP),可以同时与多个小卫星的VNTR杂交，形成多基因座RFLP图谱，称为DNA指纹(DNA fingerprint)。另一种是单基因座探针(single-lo-cus probe，SLP)，仅与一个小卫星基因座的等位片段杂交，形成单基因座RFLP图谱，称为DNA纹印 DNA pfrie 。 DNA纹印中的单基因座探针含有特定基因座的单拷贝序列，杂交时使用高度严格的条件，一个探针只能检测一个小卫星区域，形成单个基因座的RFLP图谱。图谱中杂合子呈现为两条带，纯合子呈一条带。DNA纹印电泳时要加已知长度的DNA片段作为相对分子质量标准，通过自动扫描设备识别并构建回归方程，等位片段长度由回归方程估计。 与DNA纹印不同，DNA指纹的技术核心是多基因座探针 multi-locus probe，MLP 。探针由小卫星的串联重复序列构成。人类基因组中一系列小卫星DNA的核心序列具有相似性，在不严格的杂交条件下，相似但并不完全相同的串联重复序列都可以与探针结合,从而能同时揭示多个小卫星基因座的多态性，形成DNA指纹。 2、扩增片段长度多态性 扩增片段长度多态性 amplification fragment length polymorphism，Amp-FLP 指通过PCR扩增对基因组中有长度多态的基因座分型。 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction，PCR 是一种模拟天然DNA复制过程而建立的体外核酸扩增方法。PCR原理是利用DNA聚合酶的催化作用，以靶DNA作为，由一对引物引导DNA合成，使两引物间的靶DNA片段得到特异性的扩增。扩增产物的特异性由引物的序列所决定。所谓引物 primer 人工合成的与待扩增的DNA片段互补的单链寡核苷酸片段。 根据PCR原理，针对具有长度多态的串联重复序列的侧翼序列设计一对引物，PCR扩增后，电泳分离PCR产物。杂合子扩增产物为两条长度不等的片段，纯合子为一条片段。 Amp-FLP分析技术充分发挥了PCR技术的高灵敏度和串联重复序列高多态性的优势，在检测灵敏度、准确性、技术程序上比RFLP优越，使法医DNA分析实现了 高效、灵敏、准确的目标。在法医工作中应用最多的是短串联重复序列(short tandem repeats，STR)分型。 STR基因座的特点 STR是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列。基序由2-6个碱基对构成，呈串联重复排列，主要由基序拷贝数目的变化产生长度多态性。一般认为，人类基因组平均每6-10 kb就有一个STR基因座，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源。 3、DNA长度多态技术的比较 DNA指纹的高度个体特异性克服了传统法医遗传标记鉴别能力低的缺陷，使法医个人识别和亲子鉴定实现了从仅能排除到高概率认定的飞跃，被誉为法医遗传分析的里程碑。尽管取得了重大突破，但DNA指纹在法医遗传学实践中确实有一些局限性。例如，检测灵敏度低，需要相对较大数量的细胞材料。更大的问题还在于DNA指纹自身无法克服的缺陷: 1(无法确定的等位基因，无法统计等位基因频率。 2(对任何一条带，无法确定是由纯合子或杂合子产生。 3(无法确定每条带所代表的基因座及染色体定位。 4(无法确定各基因座之间的独立性。 尽管DNA指纹被认为可以代表个体特异性的独一无二的条带模式，接近于经典的指纹。但是，它不易进行常规的统计学分析和构建计算机数据库，这阻碍了它在法庭中的应用。许多国家的法医鉴定已不再使用多基因座探针为核心的DNA指纹技术。当前，大多数国家采用了以单基因座多态性为基础的DNA分析技术，包括Amp-FLP和DNA纹印。 表17-6 13个STR特定表型组合在群体中出现的概率 遗传标记 现场血痕STRI表型 嫌疑人STR表型 表型频率P 群体中存在该表型组合的概率(IIP) TYOX D3S1358 FCA D5S818 CSFlPO D7S820 D8S1179 TH01 VWA D13S317 D16S539 D18S51 D21S11 8―11 15―16 22―23 1―12 11―12 11―12 13―14 7―9 14―17 8一11 9―11 14―15 29―31 8―11 15―16 22―23 1l一12 11―12 11―12 13―14 7―9 14―17 8―11 9―11 14―15 29―31 0(323 0(242 0(103 0(154 0(190 0(143 0(075 0(294 0(131 0(105 0(144 0(086 0(092 0.323 0.078 0.008 0.001 2 0.000 23 0.000 033 0.000 002 5 0.000 000 074 0.000 000 009 7 0.000 000 001 0 0.000 000 000 1 0.000 000 000 01 0.000 000 000 001 不同DNA长度多态技术的优缺点比较 Amp-FLP 如STR DNA纹印 DNA指纹 0(05―50ng 最多两条带 分辨明确 0(1-1 kb 可分析严重降解检材 可分析混合斑 概率计算以基因频率为依据 要达到极高个体识别能力需同时检测多个基因座 引物有种属特异性 引物退火条件严格 多聚酶错掺率1,，但不影响长度多态分析 10~50 ng 最多两条带 分辨明确 0.5~4 kb 可分析部分降解检材 可分析混合斑 概率计算以基因频率为依据 要达到极高个体识别能力需同 时检测多个基因座 探针有种属特异性 杂交条件严格 配对精确 500,1 000 ng 15条带以上 有些分辨困难 4kb以上 降解到4kb以下不能分析 混合斑分析困难 概率计算不是根据基因频率，因为不能确定基因座个体识别能力极高 探针与人和动物广泛交叉反应杂交条件不严格 错配率30,,40, 排除和不排除亲子关系的格局 母亲 AA AA Aa Aa Aa Aa aa 孩子 AA Aa A A Aa aa Aa aa 被控父亲 AA或Aa Aa或aa AA或Aa AA或Aa 或aa Aa或aa AA或Aa Aa或aa 不排除亲子关系 被控父亲 Aa AA Aa _ AA Aa AA 排除亲子关系 排除父子关系的类型 类 型 直接排除 间接排除 母亲 1 VWA 15―17 2 D20S16l 15―18 3 Rh E+ 4 MN 孩 子 VWA 14一17 D20S161 15―18 EE N 被控父亲 VWA 16―18 D20S161 17―20 Rh E一 MM p+q 2 p2+2pq+q2 母亲表型 频率 孩子表型 相对概率 可排除非父表型 相对概率 排除概率 M p2 M P N q2 P3q2 P2 MN Q M P2 P4q N q2 N Q M P2 P2q3 q2 MN P N q2 Pq4 MN 2pq M P/2 N q2 P2q3 2pq N P/2 M P2 P3q2 MN血型系统的排除概率合计 Pq 1-pq 遗传标记 被控父亲 母亲 孩子 TH01 VWA FES D19S400 D19S253 D8S1179 D21S1409 D21S2055 D5S818 D7S820 FGA 9-10 17―177 11-13 12-12 11-12 13-187 7-7 17-20 7―97 6-10 18-22 9-10 16-18 11-11 12-13 12-13 14-15 10-11 18-26 8-10 7-7 20-24 9-10 16-18 11-13 12-13 11-13 15-16 7-10 17-18 8-8 6-7 18-20