动工胞核胞浆蛋白制备试剂盒

动工胞核胞浆蛋白制备试剂盒 免费免费 胞核胞浆蛋白制备试剂盒 Nuclear-Cytosol Extraction Kit 货号:P060090 一、描述 本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞质蛋白，提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性，并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。 二、试剂盒组份 组份 100T CEB- A 50 mL CEB- B 3 mL NEB 20 mL 三、保存条件:4? 四、实验条件和参数 1. 所有的操作都应在冰浴中进行， 所有的试剂在实验前都要预冷; 2. PCV:细胞离心后的体积，该体积用于估计试剂加入的量，PCV因细胞类型不同而有所 差异; 3. 下表是细胞数、PCV和加入试剂的对应关系，根据细胞类型的不同可根据实际情况进行 相应的调整。 5665 ×10 细胞数量 1 ×10 5 ×10 5 PCV(,l) 10-20 60-100 25 300-500 CEB- A (,l) 50-100 CEB- B (,l) 1.2-1.5 3-6 3-6 5-10 NEB(,l) 20 100 五、实验步骤 1. 材料的获得:(1)当贴壁细胞生长到70-90,时弃去培养基，用预冷的PBS 洗涤两遍， 然后用1mL 预冷的PBS 刮下细胞转移至预冷的1.5mL 微量离心管中，4?离心，800 ×g,5 min 收集细胞，用移液枪尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞PCV(离心后的 细胞体积);(2)若是悬浮细胞则转入合适的预冷的离心管中，800×g,5 min 收集细 胞，用预冷的PBS重悬洗涤细胞两次，4?离心，800×g,5 min 收集细胞，用移液枪尽 可能取去上清，勿留残液，估计细胞PCV;(3)如果是组织样本，将组织剪切成小块， 加入适量的冰冷PBS洗涤两次， 800×g，5 min，弃上清，估计离心后的体积。 2. 加入5倍PCV体积的CEB- A(即50-100 ,l的细胞加入250-500 ,l的CEB- A)【可选步骤: 使用前每mL CEB- A加入1μl DTT，5μL PMSF(用户自配:浓度100mM，溶于异丙醇)， 5μL蛋白酶抑制剂】，涡旋混合仪剧烈振荡30s，放置冰上10,15min，并每隔5分钟在 漩涡混合仪上振荡15秒; 免费免费 免费免费 3. 加入1/20体积的CEB-B，涡旋混合仪振荡10秒，放置冰上1min(此步可选:此步适宜于 制备高纯度的核蛋白，但该步可能使少量的膜蛋白出现在胞浆蛋白中); 4. 1000g 4?离心5分钟，沉淀即是核粗提物，上清则是胞浆蛋白; 5. 尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，12000g 4?离心取上清，即得胞质蛋白， 加入20,的甘油于-20?或-70?保存; 6. 用100μl CEB- A洗涤沉淀，1000g 5min弃上清, 7. 在离心沉淀物(细胞核)中加入100μL预冷的NEB ( 可选:使用前每ml NEB 加入1μL DTT，5μLPMSF，5μl蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上30min，每 间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds; 8. 4?离心，12000×g,,5min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白; 9. 上述提取的胞质蛋白和核蛋白进行蛋白定量(Braford法或BCA法)后分装并保存于 -70?，避免反复冻融。 说明, 61. 按照说明书操作,每10个细胞可得到50-75μg蛋白， 2. 该实验中裂解的时间是重要的,裂解时间过短则细胞裂解不完全,导致低的蛋白产率, 裂解时间长则可能导致胞浆蛋白中有核蛋白的污染， 3. 细胞裂解因细胞类型而异。如果细胞难以裂解则可选用第3步,或者可以使细胞通过22 号针头,重复三次,使得90,以上的细胞破碎， 4. 在得到的核蛋白中含有25,的甘油和420 mM的 NaCl， 5. 在该试剂盒中未加入蛋白酶抑制剂,用户在使用时可自行加入,本试剂盒在不加入蛋白 酶抑制剂时仍可得到高浓度的蛋白。 免费免费 免费免费 免费免费 免费免费 1、学校辩论赛上。 正方辩:人为他人而活。 反方辩题:人为自己而活。 反方提问正方:“对方辩友既然是为了他人而活，那你能给我买个肉夹馍么,” 正方:“„„能。” 反方:“那你别比赛了，现在就去买吧。” 正方:“„„” 2、有一次四级考试我做监考，当时我在讲台上坐着，看到下面一名男生鬼鬼祟祟，一只手在上面写，一只手在下面动，嘴里还念念有词。 我心想这肯定是在作弊，于是走过去一看，TMD这哥们手里赫然拿着一串佛珠„„ 3、上课，哥们在手机上玩切水果，切切切。突然他把游戏暂停，因为手上有汗，在衣服上蹭来蹭去。 我就问:“你干嘛呢,” 他抬起头举着手，对我说:“磨刀～” 4、上机课无聊我就玩游戏，玩模拟器版的1945(飞机游戏)，玩了一上午。 中午和一群同学去食堂打饭，边走边侃，我说:今天打一早上的飞机，手都打痛了～~ 招来一群人狂笑。。。 5、一次物理课，讲到安培定律。 老师问我们判断一个带电流导体在磁场中受力方向用左手还是用右手定则，有说用左手有说用右手的，久久没有确定的答案。。 无奈之下老师说道:“男左女右,” 1、儿子问:我数了好多遍，明明英语是28个字母，为啥说是26个呢。 爸爸疑问道:你现在数下给我看看, 他用手指数字母ABCD......到W就把“达、不、了”给算上了。 2、爸爸:“房间里好冷啊。” 儿子:“你可以站到墙角去。” 免费免费 免费免费 爸爸:“为什么啊„” 儿子:“因为墙角有90度。” 3、有个小孩了，考试只考了18分，然后他拿红笔添了一横，变成了78，然后又在 。 7的上面多加了半圈，然后。。就变成了98 后来卷子拿给他妈妈看，他妈妈说:这么明显的改动，你以为我会看不出来你其实考了78分吗, 4、小学历史课上，老师问同学道:“谁知道地球围着什么转呀。” 许多同学都举手了，老师叫小明回答，小明说:“地球围着太阳转。”老师又叫 几个同学回答，同学都和小明回答得一样。历史老师又问:“那你们谁知道最早提出地球围着太阳转的人是谁。” 同学们齐声说到:“小明。” 1、一日，煮鸡蛋碰上了煎鸡蛋，煎鸡蛋说:“蛋哥啊~做蛋不要太滑了。” 然后煮鸡蛋说:“蛋弟呀，做蛋不能太油了～” 煎鸡蛋。。。。。。 2、紫薇:尔康，你幸福吗, 尔康:你忘了吗，我一直姓福。 3、身体有点不舒服，去看医生。 “哦，不舒服啊,来，咳嗽一下我听听„„好，再咳两声„„嗯，你这个情况啊我清楚了:你呢，是咳嗽。” 4、“有女朋友吗,” “有了。” “有钱人啊你。” “......” 5、老婆:“今天情人节，你是要爱惜钱包呢,还是保重身体,” 1、有三个人去看戏，一个是聋子，一个是瞎子，一个是歪脖子。 看完了戏，演员问他们:“戏怎么样,” 聋子说:“还行，就是没有声音。” 免费免费 免费免费 瞎子说:“烂透了，根本就没人演～” 歪脖子说:“挺不错的，就是戏台有点歪。” 2、三毛去发型屋做发型，对发型师说:给我编个麻花辫。发型师不小心弄掉了三毛的一根头发。 三毛叹口气说:那来个中分好拉。 可是发型师不小心又弄掉了根。 三毛一看火了:你丫的想让我披头散啊,～ 3、乡间有个小偷，夜里来到老头家窥探，正好被从外面回来的老头看见。 小偷慌忙夺路而逃，情急之下连从别人家偷来的羊皮袄也顾不得了。 老头从地上拾起小偷丢下的羊皮袄，穿在身上一试很合身，心里非常高兴。 由于这次白白捡了个大便宜，以后他每次夜里回到家时，见到门庭平安无事，心里就很失望，总是皱紧眉头，不住地念叨着:“今夜怎么就没来小偷呢,” 4、话说有一个美女深夜被打劫，劫匪“把身上值钱的东西都拿出来～”，美女遂从之，劫匪拿了东西又仔细盯了美女一会“把衣服全脱了～” 美女心想终究还是逃不过，遂从之。 男子认真看她脱完后“算你老实，没藏东西”于是掉头就走了。。。 5、有一个人患有高度近视，半尺之外，几乎什么都看不清。 一天晚上，他捡到一个爆竹，便靠近灯火辨认，不料触火而响。 旁边有一个聋人，见此，拍着他的背问:“你刚才捡到了什么东西,怎么一到手就飞散了,” 1、一天爸爸给儿子讲故事。 爸爸:“在春秋时代„” 儿子:“说清楚是春还是秋,” 爸爸:“有一个诸侯„” 儿子:“到底是猪还是猴啊,” 爸爸:“„” 2、儿子今年三岁半，最近爱上角色扮演的游戏。 儿子说:“爸爸我是饺子，你把我吃掉吧～” 于是我老公就非常投入的在儿子肚子上乱拱。嘴里还吧嗒吧嗒发出声音逗得孩子咯咯直笑。 儿子边笑边问:“爸爸我好吃不,” 免费免费 免费免费 老公说:“好吃呀～比妈妈包的饺子好吃多了。哎呀，宝贝你是什么馅的饺子呀,” 想去便便的儿子很认真地说:“爸爸，我是屎馅的～” 3、一个人的儿子被蚊子叮了，他给儿子风油精并对儿子说:“风油精中含有一种东 西，蚊子闻了就害怕，就不会来咬你了。” 儿子说:“要是它捏着鼻子回来怎么办,” 4、今天朋友发给我一张她8个多月大女儿的照片，照片中小宝宝手拿着吃了一半的香蕉，撇着嘴在哭。 我很惊奇的问朋友，“她会吃香蕉呀”, 朋友回答:“是啊。”。 我又问:“那她为什么哭得这么伤心”, 朋友的回答把我笑喷了:“穿得太厚了，她胳膊又短，吃了一半够不着了”。 《 初识flash与动画》教学 广州市广东华侨中学 陈丽宾 一、 教学内容分析 1、本节的主要内容及在本章中的地位 本节课是学习动画制作的第一节课，学生有着浓厚的兴趣但又有点“神秘” 、感。由于绝大部分学生是第一次接触flash，因此，本节课重点是介绍帧的概念动画原理。通过对逐帧动画的修改来熟悉Flash界面，掌握常用操作，深刻理解动画原理，为后续深入学习打下良好的基础。 2、教学重点、难点: 重点:理解帧的概念、动画原理，掌握flash基本操作 难点:理解帧的概念、动画原理 二、 教学对象分析 在学习flash前，学生已学过windows、office等，对计算机的基本操作有了一定的感性认识，对进一步学习flash动画制作有一定的操作基础。由于动画直观生动，能够点燃学生学习动画的热情，为教师提供良的教学环境，所以，本节课学生应该有兴趣学，也能学好。 免费免费 免费免费 三、 教学目标 1.知识与技能 ?熟悉flash mx 2004的界面 ?掌握对图片的导入、缩放、旋转操作 ?理解帧的含义、动画原理 ?基本能进行帧频的改变，帧的复制等操作 2.过程与 通过对导入的系列图片所形成的逐帧动画进行播放和逐帧修改，理解帧的含义、关键帧的概念、动画的原理，了解传统动画的制作方法。 3.情感态度价值观 调动学生学习动画制作的积极性 四、 教学策略 对导入的系列图片所形成的逐帧动画进行剖析，理解帧的含义、动画原理，在此基础上逐帧修改，制作不同效果的逐帧动画，在操作过程中熟悉flash界面，掌握Flash基本操作，通过播放及对播放参数的修改，进一步加深理解动画原理，了解传统的逐帧动画制作，为下节课制作关键帧动画埋下伏笔。 五、 教学媒体选择 带大屏幕的多媒体教学网络课室。 六、 教学过程 1、教学内容的组织与呈现方式 ?演示-讲解:动画原理 ?演示-操作:熟悉flash基本操作，完成“导入小鸟飞翔的序列图片，修改各帧，使小鸟可以随意飞翔”任务 ?演示-练习:进行帧的复制和翻转，修改各帖的旋转度等，完成“通过复制帧、翻转帧、改变飞行方向等，使小鸟能飞回原位。”任务 ?启发-探究:多个对象的动画制作---层的操作，完成“不同小鸟或其它动物同时运动”任务 ?小结-思考:什么是关键帧,逐帧动画,传统动画的优缺点, 2、教学过程 设计意图 教学环节 教师教学 学生活动 演示与讲解 介绍数字图像类型，用flash制作的了解图片的两1(引入 判断与联想 图像属于矢量图。适量图体积小，放大不种类型 失真，更适于在因特网上传播。 免费免费 免费免费 3( 演示与讲解:介绍flash界面，如时熟悉flash界启动后了解 启动flash 间轴、舞台、属性面板等。 面 演示并剖析:小鸟.fla 1(导入小鸟系列图片(jpg)，形成逐帧动 画 理解帧的含2( 比较与理解 义、关键帧、逐帧动画 2(时间轴上每一小格就是一帧，含有图逐帧动画 片的帧就是关键帧，连续关键帧形成的动 画就是逐帧动画。 演示与讲解:动画原理 1(动画播放:小鸟在原地飞翔 4( 跟随操作，并进行播理解动画原2(动画原理:人的视觉残留原理 动画原理 放或影片测试 理、帧频 3(帧频:修改帧频后再播放，观察小鸟 飞翔的速度，理解帧频的含义。 掌握对象的“位置、掌握对象“位演示与观察:改变帧与动画效果 旋转度/大小” 改变5( 1( 修改各帧小鸟位置 置、旋转度/方法，制作小鸟可以2( 修改某帧小鸟的飞行方向 帧的修改 大小”改变方随意飞翔的动画效3( 修改某帧小鸟的大小 法 果(完成基本任务) 演示:逐帧动画的制作 1( 将前八帧复制粘贴至第九帧处 制作逐帧动画，动画 6(* 2( 选中刚复制的后八帧并进行帧翻转 效果:使小鸟由远飞了解帧复制与3( 播放，观察效果，找出不足之处 帧的复制到近(大)，又由近帧翻转操作 4( 修改后八帧小鸟的方向及大小，使小与翻转 飞回到远方(小) 鸟由远飞到近(大)，又由近飞回到远(完成提高任务) 方(小) 设问:如何增加一动作对象, 完成不同小鸟(或其1(增加一图层(操作演示) 它动物)同时运动的*图层的理解7(* 层 2(在图层2的第一帧导入另外一组动画效果(拓展任与运用 图片，仿照图层1的操作，完成第二务) 个对象的动作(启发学生) 1(对帧、关键帧、逐帧动画、动画 原理的理解 掌握改变对象8( 归纳总结 位置、大小、2(改变对象位置、大小、方向的操小结 作方法 方向等操作。 3(思考:传统动画制作的优缺点, 七、 教学评价设计 本节课将按梯度(由简到繁)设置三个任务: ?基本任务:导入小鸟飞翔的序列图片，修改各帧，使小鸟可以随意飞翔。 (约60分) ?提高任务:通过复制帧、翻转帧、改变飞行方向等，使小鸟能飞回原位。 (约80分) 免费免费 免费免费 ?拓展任务:不同小鸟(或其它动物)同时运动(约100分) 学生只需挑选一个任务进行提交即可，如只交提高任务，教师当堂打分或存盘后打分。巡堂时发现有特色作品即用大屏幕演示，并加以表扬鼓励。 八、 教学反思 上完本节课后，感觉学生对动画制作有了浓厚的兴趣，特别是通过对逐帧动画的各种操作，学生基本上都能理解帧、关键帧、逐帧动画、动画原理，掌握flash基本操作，如逐帧改变小鸟位置、大小、方向的操作，为后续的关键帧动画制作打下了良好的基础。 大部分学生可以根据“操作指南.doc”进行学习，完成不同层次的教学任务，95%的学生能完成基本任务，80%的学生能完成提高任务，36%的学生能完成拓展任务，达到了预期的教学目标，取得了比较满意的教学效果。 附学生《操作指南》: 第一节 动画原理(初识flash) 一、本节课目标 1. 熟悉flash mx 2004的界面 2. 掌握对图片的导入、缩放、旋转操作 3. 理解帧、关键帧、逐帧动画的含义、动画原理 4. 学会对帧频的改变，帧的复制、翻转操作 5. 初步学会对层进行简单的操作 二、学习资源 1(教师用PowerPoint“动画原理.ppt” 2(教师提供小鸟等动物图片素材、动画实例(欣赏) 3(实例欣赏:“文字显示.fla”、 “人物旋转.fla” 三、本节课任务 1(基本任务:导入小鸟飞翔的序列图片，修改各帧，使小鸟可以随意飞翔。(60分) 2. 提高任务:通过复制帧、翻转帧、改变飞行方向等，使小鸟飞回原位。(80分) 3. 拓展任务:导入不同小鸟(或其它动物)同时运动(100分) 挑选一个任务进行提交(可以只给提高任务)，当场给分或存盘后打分。 四、操作步骤( 参看教材P81~P84) 1(导入小鸟系列图片(jpg)，形成逐帧动画 2(时间轴上每一小格就是一帧，含有图片的帧就是关键帧，连续关键帧形成的动画就是逐帧动画。 3(动画播放:小鸟在原地飞翔 4(动画原理:人的视觉残留原理 免费免费 免费免费 5(修改帧频后再播放，观察小鸟飞翔的速度，理解帧频的含义。 6(修改各帧小鸟位置、方向、大小，使小鸟可以随意飞翔。(基本任务) 7(将前八帧复制粘贴至第九帧处，选中刚复制的后八帧并进行帧翻转，播放，观察效果，找出不足之处 8(修改后八帧小鸟的方向及大小，使小鸟由远飞到近(大)，又由近飞回到远方(小) 五、思考与探究: 1(老师同时提供了bmp、 jpg、 gif三种图片，你是如何认识这几种图片的, 2(播放动画“文字显示.fla”、 “人物旋转.fla”，能否总结传统动画(逐帧动画)的 优缺点, 3(拓展任务:实现同一层多个对象运动，有无先后顺序,如果多个对象要同时运动 应如何处理, 小桥流水Flash动画 范宇侠 胡宇明 这个Flash动画效果实现的是小桥流水的效果。小桥下的水静静地流淌着，小桥的倒影和水中的金鱼可以让我们想起了童年的生活。但最重要的这是一个比较实用和常用的效果。 教学目标:学生掌握小桥流水的实现方法，如何设计一只可爱的金鱼;学会运用另一种渐变动画类型——形状渐变动画，以及在动画中使用遮照功能。 教学难点:1.混色器中颜色滑快的运用;2.制作形状渐变动画时两个关键帧中的对象属性要一致; 3.在使用遮照功能时要注意那些内容是需要遮照的，要怎样实现。 教学过程: 展示小桥流水Flash动画，学生注意观看，指出动画中有那些对象有过运动， 打开原程序，注意观察时间轴上的有几个图层，图层的图标和以前学到过的有什么不同，以及时间轴的补间等。打开库看一下里面有几个元件几元件的属性。 具体制作小桥流水Flash动画 1(设置场景的大小为500px×300px，背景色为#10A9CC，帧频为12fps。 2(导入小桥。按快捷键Ctrl+F8打开“创建新元件”面板创建一个“小桥”图形 元件。然后导入一座小桥图片，如图1-1所示。 图1-1 3(制作鱼尾。新建一个“鱼尾”影片剪辑元件。在元件的场景中绘制一个鱼尾，如图1-2所示。 免费免费 免费免费 图1-2 4(按快捷键Shift+F9键打开“混色器”面板，并如图1-3所示进行设置。“混色器”下拉菜单中选择“线型渐变”。其中三个滑块的颜色分别是#F5800A、#F8D356(透明度为70%)和白色(透明度为50%)。设置好后用“颜料桶”工具给鱼尾上色。 图1-3 4(如图1-4所示建立“鱼尾”层。分别在第5、10、15、20帧上插入关键帧。然后把每帧中的鱼尾设置成图1-5中不同的形状，当然笔者使用洋葱皮命令是为了大家能够看得更清楚一点，实际上这5个鱼尾应该是重叠的。单击“鱼尾”层，使该层的所有帧成阴暗的被选取状态。然后在“属性”面板的“补间”下拉菜单中选择“形状渐变”选项建立形状渐变动画。 图1-4 5(制作金鱼。创建一个“金鱼”影片剪辑元件，如图1-5所示建立“胸鳍”、“鱼头”、“鱼身”等层。除了“鱼头”层外，其它三层都是由“鱼尾”元件通过“变形”面板变形而得到，这也体现了Flash设计中尽量重复使用元件来减小文件体积，提高效率的原则。在“鱼身”层中，只要设计一个红色的鱼身，然后让鱼身发生一点形变，产生一点动的效果就可以了。 图1-5 免费免费 免费免费 6(制作流水。新建一个“流水”层。然后如图1-6所示创建元件的各层:“小桥1”层、“小桥2”层、“遮罩”层。 图1-6 7(按快捷键Ctrl+L打开库，把库中的“小桥”元件拖到“小桥1”层中。然后单击选中该层的第60帧按F5键插入帧。接着单击“隐藏/显示”按钮 隐藏“小桥1”层中的元件。然后再把库中的“小桥”元件再拖到“小桥2”层中。单击选中该层的第50帧按F6键插入关键帧。注意，“小桥1”层和“小桥2”层中的“小桥”元件应该相同。 8(在“遮罩”层中制作一个由一条条高度为8px的线条组成的遮罩块，每条小条之间要保证有一定的间隙。接着按快捷键Ctrl+G将其组合。如图1-7所示。 图1-7 9(单击“遮罩”层的第15、30、45、60帧并按F6键插入关键帧。然后把各帧中的遮罩元件上下移动一下，并建立补间动画。目的是使其上下移动，形成流水的间隙效果。只要保证遮罩物能完全遮罩住小桥就可以了。 10(从库中把“金鱼”元件拖拽到“小桥2”层中的适当位置，可随意的再复制出几条金鱼，并可在“属性”面板中将其色彩改成黑色。也可自己设计几条小蝌蚪放在该层中。那样，效果就更有童趣，更加春意盎然了。 11(回到主场景。如图1-8所示建立“小桥”层和“倒影”层。然后从库中把“小桥”图形元件拖拽到“小桥”层中。再把“流水”影片剪辑元件拖拽到“倒影”层中。并使用“变形”面板调整到适当位置。 图1-8 小桥流水的效果到这里就做好了。一个完整的Flash动画就做好了。 小结 在整个Flash动画的制作过程中要注意，在运用形状渐变动画时两个关键帧中的对象属性要一致，最好是选中关键帧后再在属性面版的中间下拉菜单中选择形状。在使用遮照时要注意遮照的位置，及遮照层覆盖的内容。布置学生预习书上的P141红星闪闪的例子。 免费免费