复方大果木姜子乳膏体外抗HSV1病毒的实验研究_2385

复方大果木姜子乳膏体外抗HSV1病毒的实验研究_2385 复方大果木姜子乳膏体外抗HSV1病毒的实验研究 【摘要】 目的通过对复方大果木姜子软膏?号、?号、?号3个制剂处方水提、醇提物体外抗HSV1病毒作用的研究，优选出一个最佳组 方提取工艺，为进一步将其开发成一种安全有效的治疗单纯性疱疹病毒 的中药新药提供依据。方法通过细胞培养法，采用观察细胞病变(CPE)和噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性，观察复方大果木姜子软膏提取物 抗HSVTI）为评价指标，比较各处 方的抗病毒活性强弱。结果复方大果木姜子软膏?号，?号，?号三个 处方其水煎液及醇提液都有不同程度的体外抑制HSV1在Hep2细胞中增殖的作用；其中?号处方的水提取物作用最强。结论 选用复方大果木姜子软膏?号处方采用水煎提取作为制剂研究的最优处方工艺。 【关键词】 复方大果木姜子软膏； 细胞培养实验方法； 抗病毒活性； 处方筛选 大果木姜子Cinnamomum migao H. W. Li系樟科樟属植物米槁的干 燥果实，是贵州十大苗药之一。现有的研究明，大果木姜子具有增加 血循环、改善心肌缺血、抗流感病毒［1～4］ 等作用。通过前期的实 验研究已证明了大果木姜子精油具有良好的体外抗病毒作用（大果木姜 子精油体外抗HSV1病毒实 一种治疗单纯性疱疹病毒的复方药物，本研究采用细胞培养技术对大果 木姜子精油与其它药物组成的?号，?号，?号3个处方，进行抗HSV1病毒活性研究，现将实验结果报道如下。 1 材料与仪器 1.1 试剂材料 RPMI1640培养（GIBCO公司）；胰酶（GIBCO公司）；新生牛 血清（杭州四季青生物制剂公司）；平衡盐液：Hanks液；噻唑盐（MTT，北京天港邦定生物医学科技有限公司），其它试剂均为分析 纯。 MTT溶液：称取50 mgMTT，放入小烧杯中，加入50 ml维持液，过0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，分装于小试管中，放于－4?冷藏室中保存，两周内有效。 RPMI1640培养液：含10%新生牛血清的RPMI1640培养液（含1×105 u?L-1青霉素，100 mg?L-1链霉素，0.2%heps）。维持液：成分同营养液，但小牛血清浓度为2%。临用前用5.5%碳酸氢钠液调pH值为7.4，4?冰箱保存备用。 消化液：胰蛋白酶液（0.25%胰蛋白酶加入0.01%EDTA，0.22 μm的微孔滤器除菌）。使用前用5.5%NaHCO3调整pH值为7.6。 1.2 药物的制备以大果木姜子精油为主，分别配伍：珊瑚姜、杠 板归、飞龙掌血、苦参、土荆皮、蛇床子、花椒等药物组成?～?号 方。?号、?号、?号试验药物用70%的乙醇加热回流提取?号，? 号，?号3个处方，另加入超临界萃取的大果木姜子精油及0.5%吐温80作为增溶剂，搅拌混匀，即得。?号，?号，?号试验药物用水 煎煮提取?号，?号，?号3个处方，另加入超临界萃取的大果木姜子 精油及0.5%80作为增溶剂，搅拌混匀，即得。以上药物用0.22 μm的微孔滤器除菌。 本实验中所列药物的浓度是按原生药浓度计算（大果木姜子精油按 出油率为10%计算）。 1.3 仪器二氧化碳细胞培养箱(Thermo electron corporation)；超净工作台(苏州净化设备厂)；数字照相机：Nikon digital camra TEF1200F；倒置显微镜：尼康 TS100F；低速离心机：LD42(北京医用离心机厂)；通用酶标仪 BIOTEX ELX800 uv（美国产品）。 1.4 细胞细胞株：Hep2人喉癌细胞(细胞株由贵阳医学院免疫 学教研室保存)。 1.5 病毒株病毒株：HSV1，由贵阳医学院基础医学院——组织培养及干细胞研究中心提供。在Hep－2细胞上复壮三代，传代增殖 后，分装使用。 2 方法 2.1 病毒滴度的测定用含2%新生牛血清的RPMI－1640维持液将病毒稀释成10，102，103，104，105，106，107，108，109，1010倍10个浓度，按常量分别加入已长成单层细胞的96孔细胞培养板中，置于37?，5%CO2温箱内孵育2 h，弃去含病毒维持液，更换正常细胞培 养液，继续培养，分别于1，2，3，4，5，6，7 d在倒置显微镜下观察记录细胞病变(CPE)程度。同时正常细胞对照。计算细胞半数感染量 (TCID50)。 2.2 药物对细胞的毒性检测细胞用胰酶消化后，用培养液配成细 胞密度为1×105/ml单细胞悬液，接种于平底型96孔培养板中（每孔加入0.2 ml），适应生长24 h，至细胞生长呈单层。?～?号药液分 别用维持液进行二倍量系列稀释，把不同浓度的药液加入到培养板中 （100 μl/孔），每个剂量组设4孔细胞。用透明胶带封口后，置于培 养箱中继续培养，同时设另设正常细胞。培养72 h后，观察细胞病变(CPE)情况；并用噻唑蓝(MTT)比色法［5］检测细胞活性计算存活细胞 的百分比。按Reed-Meuench法计算各处方药物对细胞的半数毒性浓度 (50% Cytotoxity Concentration,CC50)。 细胞存活率(%)=试验孔平均OD值对照孔平均OD值× 100%药物对细胞生长的半数毒性浓度(CC50) CC50＝Antilog［B + （50 - <50%抑制百分率/ >50%抑制百分率-＜50%抑制百分率）×C］式中C=A-B；A=log(>50%药物浓度)；B=log(<50%药物浓度) 2.3 测定各处方对HSV－1病毒液的治疗作用除第1列外（正常细胞对照列）其余各孔将100 TCID50浓度的HSV－1病毒稀释液0.1 ml加入到已生长呈单层细胞的96孔细胞培养板中，于37?，5%CO2孵箱中吸附2 h后。分别加入用维持液将?～?号制剂药液已稀释成不同浓 度的制剂溶液0.1 ml/孔，每个浓度4孔，每种剂量组孔设4个重复孔，同时设细胞对照及病毒对照。放入37?，5%CO2培养箱中培养72 h，按上述MTT比色法测定细胞的活性，计算存活细胞的百分比。按 Reed-Meuench法计算各处方对病毒治疗的半数有效浓度 (50% Effective Concentration，EC50)。 病毒抑制率的计算： 病毒抑制率%=［实验孔(药物+病毒)平均OD值-病毒对照孔平均值］(细胞对照孔平均值-病毒对照孔平均值×100% 药物对细胞生长的半数有效浓度(EC50) EC50＝Antilog［B+（50 - ＜50%抑制百分率/ ＞50%抑制百分率- ＜50%抑制百分率）×C］式中C=A-B；A=log(＞50%药物浓度)；B=log( ＜50%药物浓度)。 3 结 果 3.1 病毒滴度通过 Reed-Meuench法计算病毒的半数感染量 TCID50为105/100μl。实验使用病毒攻击量为100 TCID50。 3.2 药物对细胞的毒性通过观察?～?号制剂药液的最大无毒浓度CC0分别为：100 mg/ml；?、?号制剂CC0分别为50 mg/ml。MTT法测定细胞存活率显示?～?号制剂药液在浓度分别为100 mg/ml 时，细胞的抑制率为102%，88%，91%，80%；?～?号制剂在浓度 50mg/ml 时，细胞的抑制率为90%，76.1%，说明在此浓度下对细胞已 基本没有毒性。?～?号制剂的半数细胞毒性浓度（CC50）分别为：200，200，＞200 ，200，122.6，95.5 mg/ml。 3.3 制剂处方对HSV1病毒的治疗作用实验结果表明，?～?号制剂处方在不同浓度下，都具有降低HSV1所致的CPE作用，且病毒抑制率随着药物浓度增加与药物浓度呈正相关。根据公式 TI=CC50/EC50，通过实验计算出各处方制剂体外抗HSV1病毒的治疗指数。?～?号制剂体外抗HSV1病毒疗效结果见表1。表1 实验药物体外抗HSV1病毒疗效对比（略） ?～?号制剂处方制剂都有对病毒治疗作用；其中?号制剂处方 MIC浓度最小，治疗指数最大：＞256.4 4 讨论 4.1 对于药物的评价需要考虑其药效与毒力的相对关系，这个相 对关系可用TI 表示。以治疗指数TI作为分析判断指标，结果：?号 制剂液最优，即用?号处方水煎提取工艺，体外抗病毒疗效最优。 4.2 增溶剂空白对照实验证明，吐温－80在浓度为0.125%时，培养72 h后，细胞没有出现细胞病变情况；且对病毒没有产生明显的抑 杀作用，说明选用吐温－80作为增溶剂是可行的。 4.3 实验结果表明各处方对HSV-1病毒的抑制都有一定的治疗作 用，且治疗作用与药物的浓度呈明显的量-效关系。 【参考文献】 ［1］覃仁安，孙学蕙，邱德文.米槁心乐滴丸抗心肌缺血作用的 实验研究［J］.中国药房，1997，8（6）：251. ［2］孙学蕙，隋艳华，邱德文.大果木浆子油对麻醉猫血流动力学 的影响［J］.中国中药杂志，1995，20（10）：622 . ［3］孙学蕙，叶家齐，冯兴芬，等.大果木浆子油对离体内脏平滑 肌的药理作用［J］.中药药理与临床，1990，6（2）：32. ［4］邱德文，谢宝忠，孟宪容，等．大龙合剂抗流感病毒的实验 研究［J］.贵阳中医学院学报，1991，（2）：53. ［5］张卓然.实用细胞培养技术，第1版［M］.北京：人民卫生出版社，1997. 声明：版权归原作者所有，如果侵犯了你的版权，请第一时间和我联 系，我将立刻做出处理！！！