体细胞克隆的小鼠胚胎在附植前后发育的研究

体细胞克隆的小鼠胚胎在附植前后发育的研究 维普资讯 ////0>. 试验研究 广东畜牧兽医科技年第 卷 第 期 体细胞克隆的小鼠胚胎在附植前后发育的研究 彭礼繁 ,罗光彬 ,。,陈自洪。.沈阳农业大学动物胚胎工程实验室,沈阳 辽宁; .美国西北大学医学院儿科系,芝加哥 美国: .广西大学动物繁殖研究所,广西 南宁 摘 要:采用成年小鼠的卵丘细胞核、胎儿成纤维细胞作核供体细胞来进行核移植,研究小鼠卵母细胞 的去核程序和影响重构胚附植前发育的激活条件;随后将重构胚与供体细胞系共培养后获得囊胚阶段的小 鼠重构胚,并将其移植到受体鼠体内后获得了%克隆胚胎。结果明,小鼠卵母细胞质能够进行重编程 来支持旱期的胚胎发育。 关键词:克隆;胚胎培养;核移植;小鼠 中图分类号: . 文献标识码: 文章编号: ? ? ?目前,大多数研究在胚胎干细胞中采用同源 购自大连医科大学实验动物中心,合格证号: 受体来进行基因敲除,以研究其基因功能, 。创 辽 ?;普通级近交系雌鼠,本实验 造功能突变性缺失的同源受体,在大鼠中已普遍 室饲育。 ’ 。 . 主要仪器设备 拉针仪? 、锻针仪 使用,但在其他哺乳动物上还没有得到应用,尤其 是在小鼠上。先天性突变的小鼠是人类疾病的 、电融合仪 一 、芯入哨子管 重要模型。使用小鼠作为动物模型来进行的基 ,均为日本 生产;荧光显微镜 因研究,已经在活跃的染色体组织中得到了证实一 、生物显微镜附显相系统。 小鼠模型基因研究中的主要限制性因素是,难一、实体生物显微镜 ?,均为 以制造出功能突变性缺失的同源受体 基因克 生产。培养箱 ,香港 ;倒置 隆 。迄今,小鼠的胚胎干细胞还无法产生出生殖 显微镜及显微操作系统,德国 公 司 ;电子天平,德国赛多利斯公司 ;生物 系嵌合体,因此就无法进行基因敲除。 目前,用胚胎干细胞来生产克隆后代,主要是 超净工作台一,中国江苏苏净集团安泰公 将培养过的细胞核转移入去核的卵母细胞中,并让 司 ;酸度计 ?? ,美国 公司 ;多 管架自动平衡离心机 一 ,湘仪离心机有限 这种重构胚在体外发育嘲,进而获得经过基因修饰 公司 ;立式 自动 电热压力蒸汽灭菌器 的克隆动物。导入突变基因的供体核经核移植也能 得到具有相同的突变基因的后代。在一些物种中提 一 ,上海申安医疗器械 厂 ;自动三重纯 水蒸馏器一 ,上海亚荣生化仪器厂 。 供供体核的细胞通常是经过培养的细胞,用这种方 . 。 药品与试剂、 、 、透明质酸酶、 式可以生产基因敲除克隆动物嘲,而要达到这个目 标首先要生产出核移植小鼠。已报道的小鼠核移植 胰酶、 、缓冲液、胎牛 血清 、高糖 、 、聚乙烯吡咯烷酮 等,均 多采用小鼠胚胎中卵裂球的细胞核忉,随着小鼠基 购于 公司。孕马血清促性腺激素 ,人 因敲除技术的发展,目前又采用其他大量的细胞或 绒毛膜促性腺激素 ,购于宁波第二激素厂。 培养过的细胞来生产克隆动物个体。 其它试剂均购于沈阳化学试剂厂。 本试验采用成年小鼠的卵丘细胞核和胎儿成 . 方法 纤维细胞来进行核移植,经体外培养使这些重构 。 .卵母细胞的收集 小鼠自由采食和饮 胚从卜细胞阶段发育到囊胚阶段。 水,控光 光照/ ,经一周的适应性饲养后, 与方法 腹腔注射/只,后注射 / . 材料 只,进行超数排卵。于注射后 . ~处死 . . 实验动物 ~ 周龄昆明白系雌鼠, 收稿日期:? ? 维普资讯 ////. 体细胞克隆的小鼠胚胎在附植前后发育的研究一彭礼繁,等 试验研究小鼠,摘取输卵管,置实体显微镜下观察,撕开输卵 中, ?、% 条件下培养 后,再用% 的 消化数分钟,转入 锥形瓶中。 管膨大部,收集卵丘卵母细胞复合体。将 经过 沉淀得到大组织碎块,将这些悬浮物移 移入含 .%透明质酸酶的 溶液中处理 ,机械吹打将卵丘细胞去除,将带有第一 入到另一个 的 她 试管中, 离心 。在该新鲜培养基中得到悬浮细胞。将 极体的卵母细胞或胞质中有突起的卵母细胞全都 移入新鲜的溶液中,在 ?,%培养箱中 其放置在直径的培养皿中,在 ?, %培养条件下培养 。为了得到可使用的供体细 培养到去核前。注意:在 中不能含有磷酸盐成 胞,在使用前,在不含血清的 .%的胰酶中 分,否则将会对随后的胚胎发育产生毒害作用,使 消化 ,再用 培养基清洗两遍。清洗后的细 其发育停滞于第一次卵裂】。 卵母细胞的去核 用把持针吸住培养后 胞在 . 的 培养基中悬浮,此时温度维持在 的卵母细胞,使卵母细胞的第一极体或胞质中的突。这些细胞转移到% 的 肛 中培养 后,转入 一/溶液中培养 .。挑 起位于 点的位置,再用玻璃微管对准 点的位 置并刺穿透明带,调节把持针的压力将卵母细胞和 选其中的活细胞,进行传代培养。 刺入透明带的玻璃微管一同释放。然后,调节玻璃 . . 供体核的注入 将供体细胞和受体卵母细 微管将刺穿透明带在把持针下部来回轻微摩擦直 胞放置在 微滴中。用内径 的注射针将供 至出现少许破裂,再将玻璃微管拔出。调节把持针 体核注入去核的卵母细胞中 该注射针在 %的压力对准该卵母细胞中透明带破裂的位置轻微 中浸泡后用 .. 过滤器过滤的去离子水清洗 的吸取,使卵母细胞的第一极体或胞质中的突起被 过。该注射针吸取少量的汞柱后,在使用前置于 吸入管中。最后,使卵母细胞从把持针上释放。在该 的 培养液中 。在 装置的推动力 过程中,不要使用细胞松弛素。将去核的卵 下,吸入了供体核的注射针先穿透受体卵母细胞的 母细胞放于 中,在培养箱中培养到注核前。 透明带,再进入卵母细胞中。该注射针进入到受体 中 / 处,胞质膜在注射针尖端出现了明显的向内 . . 供体细胞的准备 卵丘细胞:收集方法同卵母细胞收集。将收集到的卵丘 细胞置于 ? 凹陷。利用. 装置的推动力或轻微的吸力使注 的 培养基中,并在 内使用。注射前,使用注 射针穿透胞质膜,再将注射针中的供体核放入其受 射针将其来回吹吸连同 装置的电脉冲压力 体中图 。以上操作都在含 / 的 培 来获得卵丘细胞核。 养基中进行。注核完毕后,将这些重构胚放在 培 胎儿成纤维细胞:将妊娠 的雌鼠处死,取 养基中恢复 。然后,放在和 出子宫角,置于含有青霉素 / 和链霉素 /的无 、 的 培养基中激活/缓冲溶液的表面皿。依次取出胎 ~ , ?,% 。下进行培养。最后,将这些重构 儿,剪碎,去掉内脏。将剪碎后的胎儿组织在中 胚放在 中进行培养。 清洗两次,置于含胰酶 . % / 和结 果 . 的平衡盐液滴的 表面皿 . 用于核移植试验的小鼠品系选择 本试验各 、 ? 圈 小鼠卵母细胞的去核 , 用把持针轻微吸住卵母细胞,再用玻璃微管刺破其透明带; 玻璃微管连同透明带在把持针下部摩擦直至该透明 带出现破裂;调节去核针轻微压力把胞贡突起从透明带下吸出; 含有核物质的胞质外溢到透明带外。维普资讯 ////. 试验研究 体细胞克隆的小鼠胚胎在附植前后发育的研究一彭礼繁,等 一 一霸 图 利用 装置推力将卵丘细胞注入 。 将卵丘细胞吸入注射管中,反复吸吐以破坏其细胞膜; 通过装置的推力将含有卵丘细胞核的注射针插入 到透明带下; 不用装置,缓慢将注射针推入卵胞质中; 将注射管继续向内推进,胞质膜在注射管尖端出现向 内凹; 注射管在细胞质膜上打孔后,供体核被推入到卵胞质中。 装置高频率低振幅对注射管进行了震荡。 表 小鼠受精卵在培养基中的发育情况 表 核移植后小鼠重构的体外发育情况 用了 只 和 只系实验小鼠来进行超排, 针对准胞质突起的透明带轻微的挤压,将含有 再与同品系的公鼠交配。 鼠冲出了 个原核 纺锤体的少许胞质挤出。去除细胞核,卵细胞快速 的恢复原形。最后用 ?试剂对挤出的 胚,鼠冲出了 个原核胚。然后将这些原核胚 少许胞质进行着色,来证明该去核操作的可靠性。 放在 中培养。从表 中看到:交配后 天,从输 . 小鼠卵丘细胞核组成的重构胚在植入前 卵管中冲出的 一细胞胚数量有明显的差异。 冲 的体外发育情况 卵丘细胞是通过超数排卵获得 出 个 一细胞胚,而系只冲出了 个。 天 的,它是核质比率中核偏大的一种小细胞,可用作 后, 有 个 一细胞胚,而系只有 个 一 细胞胚。 天后, 有 个囊胚,而 系则无囊 供体细胞。将该供体细胞在注射针中来回吹吸, 使其细胞膜松散而获得卵丘细胞核,再将其注入到 胚。二者问存在有明显的差异。这也说明了: 鼠 去核的卵母细胞的卵胞质下 图 。这些重构胚 的排卵情况和受精卵在培养基中的发育情况要明 显好于系鼠,可用于下一步的试验研究。 再放在激活液中激活 ~,再培养在 培养 基中。这些重构胚的体外形态的正常发育率比较高 .?卵母细胞的去核 用透明质酸酶将卵丘 表 。本试验将 个卵进行了去核和注核操 细胞分离后,在 卵母细胞的透明带下进行显微 作,其中在体外培养基中有 个重构胚存活。存活 去核操作 图 。用去核针在有胞质突起的透明 的重构胚中,有 %重构胚经培养发育到 一 带下划破一个裂缝,再从该部位拔出。然后,用去核维普资讯 ////. 体细胞克隆的小鼠胚胎在附植前后发育的研究一彭礼繁,等 试验研究?一????????图 卵丘细胞作为核供体的核移植重构胚的体外发育情况 这些重构胚经激活后在 中培养 天。 显示了在培养基中培养了 , , ,. , 天后所观察到的一细胞,一细 胞,一细胞,一细胞后和囊胚阶段的重构胚形态; 显示了在培养基中培养了 ,, , . , 天后所观察到的 一细胞,一细 胞,一细胞,一细胞后和囊胚阶段的受精胚形态。 细胞期,同时有 %重构胚经培养发育到 一 有经过激活的卵有 个发育到 一细胞期,但是这 细胞期。体外培养 天后,有 %的重构胚发育到 些卵中却不能继续向后发育。但是,如果这些裸卵 一细胞期; 天后,有 %的重构胚发育到 一细胞 从 中被分离后立即进行激活,这些卵孤雌发 期。 天后,有的重构胚发育到囊胚阶段 图 。 育到囊胚阶段的比例显著提高。 个正常排卵后 . 小鼠胎儿成纤维细胞核组成的重构胚在 获得的卵立即进行~ 的激活处理,有 个 附植前的体外发育情况 胎儿成纤维细胞作为核 卵 % 在培养基中发育到囊胚阶段,而超排处 移植的核供体。这些胎儿成纤维细胞传 ~ 代后, 理后获得的卵也经过同样的激活处理, 个卵中 在无血清的培养基中培养 天获得大量的间期细 有 个卵% 在培养基中发育到囊胚阶段。 胞。将这些胎儿成纤维细胞核注入去核卵母细胞 讨论 中,再放在含有。激活液中激活。本试验对 在本实验中,用卵丘细胞和胎儿成纤维细胞 个卵进行了去核和注核操作,其中在体外培养基中 核进行重构,获得的重构胚在体外能够发育到囊 有 个重构胚存活。存活的重构胚中,有 %的重 胚阶段。这些重构胚发育到囊胚阶段,主要是取决 构胚经 培养发育到 一细胞期,同时有 %的 于注入的细胞核来源。卵丘细胞和胎儿成纤维细 重构胚经 培养发育到一细胞期表 。体 胞都能够重编重构胚的体外发育,这种发育潜力 外培养了 天后,有%的重构胚发育到一细胞 不会由标记基因的转染和供核细胞的选择与传代 期; 天后,有 %的重构胚发育到 一细胞期。 天 等因素的影响而减弱。因此,培养后的小鼠细胞核 后,有 %的重构胚发育到囊胚阶段 图 。 能够支持重构胚的体外发育。 本实验采用正常的卵母细胞作为对照组,采 小鼠的卵母细胞在分离后将会立即被激活 . 用同条件的处理方法,但是没有注入外来核物质。 。 从本试验中可以看出:未受精的卵母细胞也可 这些卵母细胞置于 培养基中一段时间后,又进 以发育到 一细胞期,但发育率比较低,说明未受 行 。激活操作。在本试验中, 个没有经过 精的卵母细胞发生自发激活。这种 一细胞发育率 激活的卵母细胞中有 个卵发育到 一细 会由于化学激活的影响而得到进一步的提高,这 胞期,但是不能继续向后发育。这些卵母细胞不经 些卵的随后发育潜力也会受到化学激活时间的制 其他处理,最后放在 培养基中培养。 个没 约,因为分离后立即对这些卵进行化学激活,会使