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HPLC法同时快速测定血浆中更昔洛韦、阿昔洛韦和喷昔洛韦的浓度

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HPLC法同时快速测定血浆中更昔洛韦、阿昔洛韦和喷昔洛韦的浓度HPLC法同时快速测定血浆中更昔洛韦、阿昔洛韦和喷昔洛韦的浓度 HPLC法同时快速测定血浆中更昔洛韦、阿 昔洛韦和喷昔洛韦的浓度 药物分析杂志ChinJPharmAnal2006,26(9)一1199一 HPLC法同时快速测定血浆中更昔洛韦,阿昔洛韦和喷昔洛韦的浓度 石翠斌,白小红,姜丽芳,吴树鸣 (1.山西省大同市三医院药剂科,大同037008;2.山西医科大学药学院,太原030001) 摘要目的:建立同时快速测定血浆中更昔洛韦,阿昔洛韦,喷昔洛韦浓度的方法.方法:血浆经AccuBONDODS—C.固相萃 取小柱净化...
HPLC法同时快速测定血浆中更昔洛韦、阿昔洛韦和喷昔洛韦的浓度
HPLC法同时快速测定血浆中更昔洛韦、阿昔洛韦和喷昔洛韦的浓度 HPLC法同时快速测定血浆中更昔洛韦、阿 昔洛韦和喷昔洛韦的浓度 药物杂志ChinJPharmAnal2006,26(9)一1199一 HPLC法同时快速测定血浆中更昔洛韦,阿昔洛韦和喷昔洛韦的浓度 石翠斌,白小红,姜丽芳,吴树鸣 (1.山西省大同市三医院药剂科,大同037008;2.山西医科大学药学院,太原030001) 摘要目的:建立同时快速测定血浆中更昔洛韦,阿昔洛韦,喷昔洛韦浓度的方法.方法:血浆经AccuBONDODS—C.固相萃 取小柱净化富积后,采用HPLC法进行测定.色谱柱:SinochromODS—BP(250mln×4.6nlm,5;xm),柱温:40?,流动相: 0.015tool?L磷酸二氢钠(稀磷酸调pH3.14)一甲醇(90:10),流速:1.0mL?min,,荧光检测波长:=270nm,= 373nm,内标物:鸟嘌呤.结果:血浆内源性杂质对样品测定无干扰,3组分在10min以内全部洗脱完毕并能完全分离.更昔 洛韦,阿昔洛韦,喷昔洛韦的线性方程测定分别 为:Y=0.024947+0.084400C(r=0.9992).Y=0.016342+0.078968C(r= 0.9999),Y=0.038859+0.44034C(r=0.9998);线性范围分别为0.10,50.0,0.10,50.0,0.04,20.0;xg?mL,;检测限( N=3)分别为0.05,0.05,0.01;xg?mL,;各组分提取回收率均大于70%,方法回收率在90%,110%之间,Lt内和Lt间精密 度的RSD均小于6%.结论:本法简便,快速,灵敏,准确,可用于核苷类抗病毒药的体内分析及临床药学研究. 关键词:更昔洛韦;阿昔洛韦;喷昔洛韦;固相萃取;反相高效液相色谱法 中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254—1793(2006)09—1199—05 Simultaneousandrapiddeterminationofaciclovir,ganciclovirand penciclovirinplasmawithsolid—phaseextractionandHPLC SHICui—bin,BAIXiao—hong,JIANGLi—fang,WUShu—ming (1.DepartmentofPharmacy,DatongNo.ThreeHospital,ShanxiProvince,Datong037008,China; 2.ShanxiMedicalUniversityPharmaceuticalCollege,Talyuan030001,China) AbstractObjective:TodeveloparapidandsimpleHPLCmethodforthesimultaneousdeterminationofaciclovir, ganciclovirandpenciclovirinplasma.Methods:Afterbeingpurifiedbysolidphaseextractioncartridges,samples wereachievedandseparatedbyaCl8columnwithamobilephaseof0.015mol?L-1phosphatebuffer(adjustedto pH3.14withdilutephosphoricacid)一CH3OH(90:10)ataflow— rateof1.0mL?min,,temperaturesetat 40oC.andmeasuredbyfluorescencedetectionusinganexcitationwavelengthof270nmandanemissionwave— lengthof373nm.Guaninewaschosenastheinternalstandard.Results:Thedrug— freeplasmadidnotinterfere withthedrugsandinternalstandard,allcomponentswereelutedin10minutesandseparatedeachother.Thelinear equationswereY=0.024947+0.o844ooc(r=o.9992)f0rganciclovir,Y=0.016342+0.078968C(r=0.9999) foraciclovirandl,=0.038859+0.44034C(r=0.9998)forpenciclovir,respectively.Thelinearityrangedfrom0.1 to50.0ixg?mL,forbothganciclovirandaciclovirandfrom0.04to20.0ixg?mL, forpenciclovir.respective— ly.Atasignal—to—noiseratioof3:1,thedetectionlimitwas0.05g?mL一 'forbothganciclovirandaciclovir and0.01ixg?mL, forpenciclovir,respectively.Theextractionrecoveriesofthesedrugswereallhigherthan70% andmethodrecoveriesvariedfrom90%to110%.Theprecisions(RSD)ofwithin— dayandbetween—daywereall lessthan6%.Conclution:Thismethondissimple,rapid,accurateandsensitive.Itcanbeusedt odeterminethe concentrationsofganciclovir,aciclovirandpenciclovirinplasmasimultaneouslyandrapidl y,andcanbeappliedto theclinicalpharmaceuticalresearchinvivo. HPLC Keywords:ganciclovir;aciclovir;penciclovir;solid——phaseextraction;RP——十山西省自然科学基金资助(No.20031104) }十通讯作者Tel:(0352)5801789 一 12oo一药物分析杂志ChinJPharmAnal2006,26(9) 阿昔洛韦aciclovir(ACV),更昔洛韦ganciclovir (GCV)和喷昔洛韦penciclovir(PCV)等,是目前临 床上常用的核苷类抗病毒药,这3种药物在体内均 主要以原形经尿排泄,肾功能障碍会影响药物血浆 浓度和排泄速率,致使药物作用增强,甚至产生毒性 反应.现在该类药物愈来愈多地被作为器官移植病 人的预防用药而使用,而器官移植病人又极易发生 肾功能衰竭…,所以很有必要对其血药浓度进行监 测.另外PCV乳膏与GCV(静脉滴注)或ACV(口 服或静脉滴注)合用,抗病毒作用相加,临床疗效可 明显增强J,因此建立简单易行的监测体内多种核 苷类抗病毒药血药浓度的快速测定方法实为重要. 关于这类药物在体液中的色谱分析,已有大量文献 研究,但几乎都是单一药物分析,多组分同时测定 作者未见报道,本实验就对用固相萃取一反相高 效液相色谱法同时测定血浆中这3种药物浓度的 检测方法进行了研究.提出了快速同时测定 GCV,ACV,PCV血药浓度的简便方法,为核苷类 抗病毒药的体内分析及临床药学研究提供了科学 的依据. 1仪器与试药 Shimadzu高效液相色谱仪(LC一10AT~泵, RF—IOA札荧光检测器);浙江大学N2000色谱工作 站;ShangpingMD110—2电子天平(上海电子天平 仪器厂);XW一80A旋涡混合器(上海医科大学仪 器厂);800型离心沉淀器(上海手术器械厂);Accu. BONDODS—c8(100mg,1mL)固相萃取小柱(美 国安捷伦公司LotNo.:A1A40304A). 鸟嘌呤对照品,阿昔洛韦对照品均购自中国药 品生物制品检定所;更昔洛韦原料药(批号: 20010108,含量:100.00%)由湖北天门制药厂提供; 喷昔洛韦精制对照品(批号:200400301,含量: 100.45%)由重庆华邦制药股份有限公司提供;乙 腈,甲醇均为色谱纯;其他试剂均为分析纯;实验用 水为二重蒸馏水. 2实验方法 2.1对照品溶液及内标溶液的配制 精密称取ACV对照品50mg于50mL量瓶 中,加0.1mol?L氢氧化钠溶液5mL使溶解,用 水稀释至刻度,即得1mg?mL一的ACV储备液; 精密称取GCV原料50mg,PCV对照品20mg分 别置50mL量瓶中,用水溶解(40?水浴),并稀 释至刻度,即得1mg?mL的GCV储备液和0.4 mg?mLPCV储备液,4?冷藏备用.用时分别 精密量取这3种储备液适量,用水稀释成含 GCV,ACV均分别为250,125,60,30,3,0.5g ?mL..,含PCV分别为100,50,20,10,1,0.2 g?m的混合标准溶液. 精密称取鸟嘌呤对照品60mg于25mL量瓶 中,加0.1mol?L氢氧化钠溶液适量使溶解,用水 稀释至刻度,即得2.4mg?mL的内标储备液, 4?冷藏备用.用时精密量取1.0mL内标储备液 于100mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得 24g?mL内标溶液. 2.2色谱条件色谱柱:SinochromODS—BP (250mm×4.6mm,5m);柱温:40oC;流动相: 0.015m0?1.L磷酸二氢钠(稀磷酸调pH3.14)一 甲醇(90:10),经0.45m微孑L滤膜过滤;流速:1.0 mL?min,;进样量:20L;荧光检测波长:入=270 nm,入:373nm. 2.3血浆样品的预处理取0.5mL血浆样品于4 mL聚丙烯离心管中,加入水和24g?mL一内标溶 液各0.1mL,涡旋30s,再加入0.5mL饱和氯化钠 溶液,涡旋1min,静置3min,离心(3000r?min) 5min,然后精密量取1.0mL上清液加于已活化(甲 醇和水各1mL依次过柱)的固相萃取小柱,再加入 0.5mL约18%的氯化钠溶液,离心(2000r? min一)5min,弃去淋洗液;用0.19mol?L稀磷酸 和乙腈的混合溶液(97:3)0.5mL冲洗固相萃取小 柱,离心(2000r?min)5min,收集洗脱液,经 0.45m微孑L滤膜过滤后取20进样. 3实验结果 3.1色谱图为比较血浆经固相萃取小柱萃取前 后的效果,取空白血浆20直接进样,得色谱图 1一A;取0.5mL空白血浆,不加内标,按"2.3"方法 操作,得色谱图1一B;将一定浓度的对照品溶液加 入空白血浆中,制成含10g?mL,GCV,10g? mLAcV和3wg?mLPCV的对照品血浆,依同 法操作,得色谱图1一c,由图可见,内标,GCV, ACV和PCV的保留时间分别约为:4.4,5.7,6.9, 8.6min;内标和三组分峰形良好,分离完全,内标 与GCV,GCV与ACV,ACV与PCV的分离度分别 为5.1,4.0,4.8;空白血浆经小柱提取后的洗脱液 只在约5.3min处有一杂峰,并且该峰与GCV色 谱峰能完全分离(分离度>1.5),明血样经固相 小柱萃取后能去掉血浆内源性杂质对测定的干 扰. 药物分析杂志ChinJPharmAnal2006,26(9) 048 A 048 Dt/mi" 图1色谱图 Fig1HPLCchromatograms A.未过固相萃取小柱空白血浆(blankplasmanotbeingpurifiedby solid—phaseextractioncartridge)B.空白血浆(blankplasma)C.对 照品血浆,含10g?mL,GCV,10I.Lg?mL,ACV,3I.Lg?mLPCV and内标(referenceplasmaincluded10峙?ITlL,GCV,10p.g?ITlL ACV.3lag?mLPCVandinternalstandard)D.阿昔洛韦~(The plasmasampleobtainedbeforethefrithintravenousinfusionfromapatient administeredintravenousinfusionofO.5g?d一ofaciclovirforfourdays) 1.内标(internalstandard)2.更昔洛韦(GCV)3.阿昔洛韦(ACV)4. 喷昔洛韦(Pcv) 3.2检测限测定对照品血浆按"2.3"项下处理 后进样20L,得GCV和ACV的检测限(S/N=3) 均为0.05g?mL,,PCV为0.01g?mL一. 3.3工作标准曲线的制作取洁净,干燥的4mL 聚丙烯离心管6支,于各管中先加入0.5mL空白血 浆,再分别加入"2.1"项下的混合标准溶液0.1mL, 即配成含GCV,ACV均分别为50,25,12,6,0.6, 0.1g?mL,,含PCV分别为2O,lO,4,2,0.2, 0.04g?mL的系列对照品血浆.然后于各管中 分别加入内标溶液0.1mL(含鸟嘌呤2.4),按 "2.3"项下方法处理后进行分析,以各组分与内标 的色谱峰面积比y为纵坐标,浓度c为横坐标,进 行线性回归,结果见表1.3种组分在表1所示各浓 度范围内线性关系良好. 表1回归方程与线性范围试验结果 Tab1Regressionequationandlinearrange ofthecomponents 3.4回收率试验配制低,中,高3种浓度的对照 品血浆,即含GCV,ACV均分别为0.6,12,25g? mL,,含PCV为0.2,4,10g?mL,.按"2.3"项 下方法处理后进行分析,每个浓度平行做3份.将 各组分峰面积与内标峰面积的比值代人各自的回归 方程,求得浓度,计算方法回收率;而各组分峰面积 与相应浓度的混合标准溶液直接进样20L,对应 的色谱峰面积之比,即为提取回收率,同法计算内标 回收率.结果见表2. 表2提取回收率和方法回收率试验结果(Jl--3) Tab2Resultsofextractionrecoveryandmethodrecovery --—— 1202--——药物分析杂志ChinJPharmAnal2006,26(9) 表2表明:内标回收率和各药物的提取回收率 均大于70%,各药物低,中,高三浓度的方法回收率 平均值均在90%,110%之间,RSD小于7%,说明 测定方法准确度良好. 3.5精密度试验配制低,中,高3种浓度的对照 品血浆,1日内按"2.3"项下方法处理后进行分析,平 行操作3次,测定日内精密度;连续3d,每日3次按 "2.3"项下方法操作,测定日间精密度.结果见表3. 表3日内,日间精密度试验结果 Tab3Precisionofwithin-?dayandbetween-?daydetermination 表3表明:各组分日内,日间浓度测定值的RSD 均小于6%,说明测定方法精密度良好. 3.6稳定性试验配制含GCV,ACV,PCV分别为 6,6,2g?mL的对照品血浆,按"2.3"项下方法 操作,将洗脱液室温放置,于O,8,12,24h分别进行 色谱分析,测定各组分与内标的色谱峰面积比.结 果3种组分在24h内测定值的RSD均小于5%,表 明样品洗脱液在室温放置24h内稳定.同时将该 份对照品血浆于一4O?保存,然后分别于第3d,7 d,14d测定血浆中GCV,ACV和PCV的浓度,考察 其稳定性,结果表明血浆样品在一4O?冷冻保存14 d,稳定性良好(RSD均小于6%). 4方法学临床应用 4.1兔子静脉注射给药选择成年,健康,体重约 为2500g的新西兰白兔3只,按5mg?kg给药 量,经静脉注射给药,给药前12h禁食,自给药后O, O.17,O.5,1,2,3,4,6,8,1O,12h,取耳缘静脉血1 mL置于肝素化试管中,离心,分离血浆,一40?保 存至测定.血浆样品中GCV,ACV和PCV的药时 曲线见图2.说明本法能对体内GCV,ACN,PCV的 血浆药物浓度进行同时测定. 4.2临床实例应用患者每日静脉滴注O.5g阿 昔洛韦,连续给药4d后,于第5d给药前,抽取静脉 血2mL,同上法分离血浆,测定ACV血药浓度.所 得色谱图见图1一D,将ACV峰面积与内标峰面积 之比带人ACV回归方程,得ACV血浆浓度测定值 12 8 4 0 图2兔子静脉注射更昔洛韦,阿昔洛韦,喷昔洛韦后的药时曲线 Fig2Concentration—timecurvesofGCV,ACVandPCVinrabits 为0.9594Ixg?mL,,并且病人同时应用的其他药 物如维生素C,ATP,辅酶A等均对实验测定无干 扰. 5讨论 5.1流动相组成的选择本文分别试验了用甲醇 一 水,甲醇一磷酸二氢钠缓冲液作流动相,结果表 明甲醇一水(5:95)时,三组分全部洗脱时间为23 min,而磷酸盐缓冲液(pH3.14)一甲醇(90:10) 时,不仅可以使样品分析周期在10min以内完成, 而且各组分峰形和灵敏度也均优于甲醇一水体 系,因此选定甲醇一磷酸二氢钠缓冲液作为实验 的流动相. 5.2缓冲液酸度的选择文献刊表明,GCV, ACV和PCV在酸性条件下有较强的荧光,所以试验 了pH分别为3.0o,3.12,3.56,4.O6,4.65的磷酸盐 缓冲液对样品测定的影响,测定结果见图3,表明 pH愈低..三组分荧光强度愈大,与文献报道]一 药物分析杂志ChinJPharmAnal2006,26(9)--——1203--—— 致,但考虑到酸度太低的流动相容易损坏色谱柱,故 实验选定缓冲液酸度为pH3.14. 隈 采 捉 参考文献 1BoulieuR,GallantC,SilbersteinN.Determinationofaciclovirin 一3?OO3?l23?564?o64.65pH3 图3缓冲溶液酸度对相对荧光强度的影响 Fig3EffectofpHforbuffersolutionontherelativefluorescencevalue 5.3洗脱液种类的选择分别试验了用甲醇,乙 腈一0.19mol?L稀磷酸溶液(3:97),乙腈 一 0.38mol?L稀磷酸溶液(3:97).,对固相萃 取小柱进行洗脱,结果表明用甲醇洗脱时,由于令 蛋白质变性而使洗脱液浑浊,不宜进样.而稀磷 酸和乙腈的混合溶液萃取效果最好,并且2种浓 度的稀磷酸洗脱液对萃取回收率的影响不太大, 故选定乙腈一0.19mol?L稀磷酸溶液(3:97) 作为洗脱剂,通过测定该溶液的色谱图,发现虽然0 与流动相的组成有差别,但对测定无影响. 6结论 本文建立了HPLC法同时分析GCV,ACN和 PCV血药浓度的方法,该法简便,快速,灵敏,准 确,可用于核苷类抗病毒药的体内分析及临床药 学研究. humanplasmabyhigh—performanceliquidchromatography.J ChromatogrB,1997,693:233 DrugEvaluationCenterofSFDA&SichuanMeikangMedicalandph~r- maceuticalSoftwareResearchandDevelopmentCo.,lad.(国家食品药 品监督管理局药品审批中心,四川美康医药软件研究开发有限公司 主编).CKmc~DrugReference(药物临床信息参考).Chengdu(成 都):NchuanPub~sMngGroup&SichuanScienceandTechnologyPub- lishers(四川出版集团,四川科学技术出版社),2004.232 LIDong(李东),LIUXue—li(刘学理).GradientelutionHPLCde— terminationofaciclovirinhumanplasma(梯度洗脱HPLC法测定人 血浆中阿昔洛韦的浓度).ChinJPharmAnal(药物分析杂志), 2002,22(4):313 uKe—xin(李可欣),ZHANGJing—jing(张京晶),HUXin(胡 欣),eta1.Determinationofpencielovirconcentrationinplasmaby HPLC(HPLC法测定血浆中喷昔洛韦浓度).ChinJPharmAnal (药物分析杂志),2000,20(4):245 SHIXiao—jin(施孝金),ZHANGLi—li(张莉莉),LIDong(李 东),eta1.Determinationandpharmacokineticsofvalaciclovirhydro— chlorideinhumanplasmabyHPLCwithfluorescencedetection(盐酸 万乃洛韦人血浆浓度的HPLC一荧光法测定及其药物动力学). ChinJPharm(中国医药工业杂志),2002,33(3):128 PehKK,YuenKH.Simplehigh—performanceliquidchromato— graphicmethodforthedeterminmionofaciclovirinhumanplasmaU— singfluorescencedetection.JChromatogrB,1997,693:241 SvenssonJO,BarkholtL,SaweJ.Determinationofaciclovirandits metabolite9一carboxymethylguanineinserumandurineusing solid——ohmextractionandhish——performanceliquidchmmatogra-? pay.JChromatogrB,1997,690:363 (本文于2006年4月8日修改回)
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