【doc】两种末端标记的寡聚核苷酸探针的比较研究

【doc】两种末端标记的寡聚核苷酸探针的比较研究 两种末端标记的寡聚核苷酸探针的比较研 究 两种末端标记的寡聚核苷酸探针的比较研究 甘立霞陈鸿 (第三军医大学基西实验室,重庆63003S) 提要 奉文利用【.nP卜dATP和【7一P卜ATP分男吗时蓉聚核苷酸的3束蒜及5' 末端进行标记,研究这两种标记方法的技术途径,井结合斑点杂交,比较这两种末端 标记的探针的灵敏度及特异性.结果表明:【a一P卜dATP虽可在寡聚核苷酸的 3'-OH末端标上多个[P卜dAMP分子,但所得标记探针的杂交更敏度及杂交体 的稳定性均不及【JP卜ATP标记5"-末端制备的寡聚核苷酸探针.因此,当实 验需要极高灵敏度的寡泉棱普酸探针时,以选择【7一"P卜ATP标记其5'一束端为 宜. 关键调寡泉棱苷酸探针,3"-末端标记,5'-末端标记,斑点印迹杂交. 核酸探针一般是以克隆的cDNA,经"缺口 平移法标记而成.自从DNA合成仪问吐后, 以合成的寡聚核苷酸作为分子探针逐渐应用起 来.寡聚核苷酸探针因具有克隆的cDNA探 针所不可替代的独特用途",并且制备方便, 在分子生物学的基础研究及临床诊断中将会得 到日益广泛的运用.台成的寡聚核苷酸由于是 单链的短片段,不宜用缺口平移法进行标记,通 常采用的方法是3'-端或5'-端标记.虽然这两 种方法已广泛直用,但二者的优劣如何,尚缺乏 详细报道.本文选择高放射比强的[P卜 ATP及[~_s2p卜dATP,对寡聚核苷酸的5._ OH端及3"-OH端进行标记,研究这两种标记 方法获得高比活性探针的技术途径,并对这两 种末端标记的探针的杂交灵敏度及特异性等进 行比较.探讨制备高灵敏度寡聚核苷酸探针的 适宜方法. 和方法 一 ,试{lII和材鹌 [u-uP]一dATP,[r-uP]一ATP均为北京福 瑞诊断用品联营公司产品;脱氧核糖核苷酸末 端转移酶系Bochringer产品;T4多聚核苷酸 激酶,Bochringer产品;硝酸纤维素滤膜, Bio—Rad产品;尿素(超纯)Sigma产品;聚乙 烯吡咯烷酮系Serva产品. 其余试剂均为纯级,所用溶液均用消 毒双蒸水配制. 斑点杂交所用的待测DNA样品取材于 正常人外周静脉血;作为DNA对照的PBR322 DNA取材于大肠杆菌HB10l(PBR322). 二,探针的制备爰标记 (一)探针的台成及纯化 采用固相异丙基亚礴酰胺法,以美国应用 生物系统公司生产的381A型DNA台成仪及 其全套台成试剂,根据COUSSeB$,L.等人报 道的人蛋白激酶C(hpKC)基因序列,合成了 25聚体(25-met)的hpKC基因的寡聚核苷 酸探针,其序列为: 5CCCAGCCAACATTTCATACAGCAGGr (简称hpKC25-mer). 合成的寡聚核苷酸按常规方法进行脱保护 及粗制,并辅之以20%聚丙烯酰胺变性凝胶 (台8mol/L尿素)电泳纯化之. (二)寡聚核苷酸探针的3'-末端标记 L[一P卜dATP标记3'-末端 基本参照Collins的反应缓冲体系:反 应总体积10l,取[n一P卜dATP(2244Ci/ mmo1)90pmol,加入hpKC25一mer9~mol,脱 氧核糖核苷酸末端转移酶50U,于140mmol/L 二甲基肿酸钠(pH75),lmmol/LCoa:,0.1 retool/LDTT,牛血清白蛋白100~*glml的反 应缓冲系统中,37~C保温lh.反应完毕,加入 25/..1去离子甲酰胺,lmmol/LEDTA溶液, 铡定探针的比放射性.将标记探针置一2O? 贮存. 参照原反应体系,改变寡核苷酸与[O~--!t2P卜 dATP的克分子比例,即加入[P卜dATP 比hpKC25一reel"探针克分子数过量5倍,复 标记一次. 2.[7一P卜ATP标记5末端 基本参照Maxam的方法:反应总体积 10pl,取[-f一P]-ATP53pmol(3740Ci/ mmo1),加入hpKC25-mer,53pmol,T4多 聚核苷酸激酶30U,于70mmol/LTris?HCI (pH7.6),10retool/LMgCl2,0.1mmol/LK~, 5mmol/LDTT,Immol/L亚精胺的反应缓 冲液中,37'~2保温lh,反应完毕,加入21 去离子甲酰胺,lmmol/LEDTA溶液,测定探 针的比放射性,将标记探针置一2O?贮存. 参照上述反应体系,维持[7一P]-ATP与 hpKC25一reel"的克分子数为1:1,适当增加T4 多聚核菅酸激酶量,并延长保温时间至2h,复 标记一次. 探针放射比活性的测定方法参照王吉伟的 工作,不同之处是用NC膜代替原法的醋酸 纤维膜. 三,待测DNA样品的制备 (一)人白细胞DNA的提取与纯化 正常人外周静脉血用EDTA—Na2l一2 ?380? mg/ml抗凝,于37~C直立静置3h,吸取血浆 及交界层,2000g离心10rain.用生理盐水洗细 胞沉淀一次,复用生理盐水悬浮细胞,加入 SDS-EDTA溶液0.0lmol/LTris,O.5mol/L EDTA(pH9.5),2%SDS,于55?保温20 rain,加入蛋白酶K(终浓度50g,m1),混 匀,于55'~2保温4h,加入0.1×SSC(1×SSC 为:15retool/LNac1,1.5mmol/L柠檬酸钠, pH7.O),用等体积的饱和酚,酚一氯仿(1:l, v/v)及氯仿一异戊醇(24:l,v/V)各抽提1 次,吸取上层水相,乙醇沉淀DNA,所得人自 细胞DNA置一20~C贮存备用. (二)PBR322DNA的制备与纯化 大肠杆菌HBlol(PBR3225经培养和质 粒PBR322扩增后,按本室的常规方法进行 PBR322DNA的提取与纯化. 四,斑点杂交硬检测 (一)NC膜上的斑点杂交 DNA样品用碱性甲醛溶液变性,即 DNA样品溶液与等体积10×SSC,2mol/L i%'aOH,15务甲醛变性液混匀,经7O?水浴保 温l0min后,取出用于点样. 杂交反应体系参照Albretsen,Ctm,预杂 交液与杂交液相同,含5×SSC,25mmol/L NaHzPO.,pH6.5,5×Denhardt's(50×De— nhardt's为:1%Ficoll,l%聚乙烯吡咯烷 酮,l务牛血清白蛋白),0.1为SDS,tRNA (O.1mg/m1),于42~C预杂交2h后,弃去m杂 交液,加入含标记探针的杂交液,于42'~2杂交 24h. (二)杂交斑点的检测 杂交后的NC膜在2×SSC,0.1蓐SDS溶 液中室温漂洗2次,每次15rain;提高漂洗强 度,于O.5×SSC,0.1面sDs中,不同温度下 (见结果)复漂洗2次,每次15rain,膜片晾干后 夹于增感屏中,于一7O?自显影7d. 结果与讨论 一 ,标记条件与探针的放射比活性 由表l,可见,在5一末端标记时适当增力? 寰l标记条件与靠竹的放射比活性 标记 克丹于比探针的放射 方法标记物酶比活性(标记物, 寡核苷酸 探针)(cpm/g) 一 束端["P]一 ATPT4Kl:11.7×10 标记1:12.25x100 ,一束端[~-J2p]一dATPTDTl0:16.5)0 标记5:13.3xJ0 注:T4K:T4多聚核苷鼗擞酶;TDT:脱氧拉桔核苷 酸末端转移酶;''参见方法中昕述第二次标记条件 激酶量并延长反应时间使同位素掺人率提高, 探针的放射比活性随之提高.在3'-末端标记 时,增加[O5--~12P卜dATP的量能有效地提高探 针的比活性,而且二者似乎有数量关系. 二,两种末端标记撂针的观察 重l两种束靖标记的寡鼍榷苷酸撂竹,经pAGE后 的放射宜丑群囝 样孔l和2是;up-标记的探针;样孔3和4是 3l_|P一标记的探针 5末端标记因是在激酶催化下,将【7一 P】一磷酸残基转移至寡聚核苷酸(hpKC25一 met)的5,_OH上的反应,因此,在放射自显影 图片上,一末端标记的探针代表25个核苷酸 的电泳迁移距离.从圈l可见,用[一P卜 dATP进行3'-末端标记,可以在寡核苷酸的 3-OH端接上多个【P卜dAMP分子. 三,两种标记探针的灵敏度及杂交体的馥 定性 从图2的结果可以比较出两种探针的灵敏 AA-AA 塞磐 瓣黪 圈2两种末蛹标记的寡鼍檀苷馥挥竹杂交后,经 不周温度幂最后的披射自五群田 0)l碡瞎A,A.代表在5--p-标记的探针中杂交(杂交寝 中探针旅度=7.6xl0cpm/ml,探针的放射比话性j z一25x10'cpmg).靖膜B.一B.代表在3一"P一标记 的探针中杂交(杂交赦中探针蔽度;1.3x10cpm,m1, 择针的放射比活性=3—3x10.cpmg). (b)滤膜的斑点印迹如下:第@排(&一a,)为PBR3Z2 DNAlO,5,2.5pg;第@排及第@排(b-一bI及c1一c,, 为^白细胞DNA中含32,l6,B…421pg的]LpKC基 因 (')嬉膜下标注的温度为杂交后的不同漂洗温度. 度及其杂交体的稳定性(见表2) 衰2两种探竹的更敏度噩其杂交体的稳定性比较 ,\最低检出量蔼洗温度 撵 \\30?45?55?65? 5P一探针<1Pg<1Pg<lPg?lpg 一 "p-撵针<1PglPg2pg8pg* 表中拴出量的定量丹析结果基于图2的杂交显彭结果 由此可见,5_P一探针,当其放射比活性及 在杂交液中的浓度均低于3'-up一探针时,杂交 灵敏度却高于后者;且其与待测靶DNA序列 形成的杂交体亦较3,_P一探针的更为稳定.从 图2可看到,3'-=P一探针与待测DNA形成的 杂交体随漂洗温度的升高迅速从膜片上脱落, 杂交信号急剧减弱,在65~C漂洗后,仅能检出 8pg的样点,而5_P一探针此时仍可清晰检出 lpg的样点.这是由于不同方法标记的探针具 有不同的序列特性所致.5'-末端标记的探针 因只能在5oH端接上一分子[P]-磷酸残 ?jIl? 生塑学与生物物理进展1991年第18卷第,期 高灵敏,高特异性心钠素放射免疫测定方法及应用 汪家瑞徐宝钢何士大温绍君于仲元陈建军王宏燕 (首都医学院宣武医院高血压实验室,北京100053) 提要 本法应用戊:醛连站一人钠素(一hANF)和牛血清白蛋白,产生的复合耪 免疫家免,获得抗口一hANF血清,其最终效价为1:35万,亲和常数K.一494× l0-1otoo]/L.—hANF应用氟胺一T氧化法进行I标记,再经DEAE-Sephadex A25拄层析纯化,得到单碘I一一hANF,比放射性为30Oci/g左右.最小捡 出量为18pg/管.与8种肽交叉反应为:一rANF98,-房肽III40%.其它6种 元交叉反应.样品变异系数,批内:44%,批闱:16.3%. 关键词钠素,抗血清,放射免疫分析 一 人心钠素(一humanatrialnatriuretlc f~tor,一hANE)是由28个氨基酸(99—126) 所组成立的一种肽类激素,主要储存在心房心 丽可i管对证液电解质平衡,血压调节有着 密切的关系.建立测定心钠素(ANF)的放 射免疫分析方法(radioimmunoassay,RIA), 首先需制备较理想的抗血清.国内虽已有报 道,但由于其抗血清的效价及灵敏度均不 高,影响了铡定的准确性.另外,血浆ANF的 测定,目前国外一般都采用样品前处理法,步骤 现于北京人民医院内科 基,故所得的标记探针的序列井未改变,仍与靶 DNA序列完全互补,而【口_rip]-dATP标记 3一末端则是在脱氧核糖核苷酸末端转移酶催化 下,在3'-OH端随机连接一串核苷酸的反应, 所以探针的放射比活性往往因在每分子探针上 接上了多个【P]-dAMP分子而增高.但是接 上的标记核苷酸数目多,虽然增加了探针的放 射比活性,却因这段poly(dA)的序列与样品 中靶基因的相应序列没有互补关系,在较高漂 抗温度下,杂交体稳定性降低,导致检出灵敏度 韵降低.而漂洗温度的提高在许多情况下是必 要的甚至是必须的,它既能有效地降低探针的 非特异吸附.还能除去探针非特异杂交本底,从 而提高信噪比,增强探针的特异性.从本实验 结果看到,在55?下漂洗,基本上能消除非特 异杂交本底,此时,5'-~p一探针的检出灵敏度 显着地高于3,_"P一探针. 此外,标记5_端用的It-"P]-ATP与被 标记的探针以等克分子比例进行反应,比标记 3一端用的[a-P]-dATP的量少得多,因而成 本较后者便宜.所以,当实验需要高灵敏度的 寡聚核苷酸探针时,建议采用5末端标记的方 法. 参考文献 1WallaceRBa1."AcidsRes,198n9?879 2GoughNMaL1984;309:763' 3C?rBJProcAcadSdUSA,l9a'l/ 80:278 4LandegrenUdScience,1988:241:1077 5Co~en*L.Sdence,1986;283:859 6CollinsML4LBioc,r,~m.1985;lSl:211 7Maxam^MMethad,~ymdotg.1980;韶: 499 B王吉伟.生有的化学,19B8;8(6):31 9WalterE".P幽"l967;7(3):557 10AlbretsenC.Bfccl~cm,1988:"0:l" ,11月14目擎日】 【丰文于199O年7月25目教割