大鼠提睾肌血管肽类免疫反应阳性神经纤维的分布

大鼠提睾肌血管肽类免疫反应阳性神经纤维的分布 大鼠提睾肌血管肽类免疫反应阳性神经纤维 的分布 关键字:睾肌血管 自20世纪80年代初至今，包括降钙素基因相关肽(calcitoningene-relatedpeptide’CGRP)、神经肽Y(neuropeptideY’NPY)、5羟色胺(5-hydroxytryptamine’5-HT)、P物质(substanceP’SP)和甲硫氨酸脑啡肽(methionineenkephalin’M-ENK)等一批对血管生理功能有重要影响的神经活性物质被发现,1，2,，为微循环的神经调节增加了新的内容.大白鼠提睾肌微循环研究动物模型是上述研究的重要材料和手段,3,，但其血管上的神经活性物质分布情况还未见报道.血管内皮细胞的生物学特性、功能及损伤均与微循环障碍有关,4，5,，上述各种活性物质是否对其产生影响还无形态学依据.我们拟采用大白鼠提睾肌模型，对神经活性物质在各级血管上的分布进行研究，为血管损伤后微循环障碍病理生理改变机制研究和完善利用大白鼠提睾肌血管微循环研究模型打下一定的基础. 1 材料和方法 1.1 材料 兔抗CGRP及NPY抗体(使用效价1?5000)由英国Polak教授惠赠，Sp’5-HT及M-ENK(使用效价1?3000)由第四军医大学组织胚胎教研室生产.生物素标记猪抗兔IgG抗体(使用效价1?800)及卵白素生物素复合物(ABC)，使用效价1?200)为丹麦Dako公司产品.3.3-四盐酸二胺基联苯胺(DAB)为美国Sigma公司产品. 1.2 方法 成年雄性SD大鼠30只，平均分为CGRP’NPY’ 1 SP’5-HT及M-ENK共5组.所有动物均以10g・L-1’ip戊巴比妥钠溶液麻醉，开胸后经主动脉插管，依次灌入9g・L-1生理盐水100mL及30g・L-1多聚甲醛磷酸缓冲液300mL.切开一侧腹股沟区皮肤，显露提睾肌，从其腹侧剪开向两侧展开，将睾丸推入腹股沟深处.在肉眼和解剖镜下仔细剥离提睾肌上的小动脉(精素外动脉)，在肉眼下，从动脉起始部，至末端分支共分3级.另一侧提睾肌展开后，以动脉为中心将肌片取下，剥除血管面肌组织以显露动脉便于免疫组化反应.所有组织置固定液后固定48h.免疫组织化学染色按ABC法操作.血管及组织片先入甲醇双氧水以去除内源性过氧化物酶活性，再入3g・L-1牛血清Triton液封闭1h.各组材料分别依次进兔抗CGRP’NPY’SP’5-HT及M-ENK抗血清、生物素标记猪抗兔IgG血清及卵白素-生物素复合物，最后以DAB呈色反应20min.在染色过程中，每次进入抗血清前均以PBS缓冲液震荡漂洗3遍，每遍5min.进入抗血清后，先于恒温箱37?孵育30min，后置4?冰箱过夜.用PBS和正常牛血清分别代替第一抗体，用PBS代替第二抗体或ABC免疫复合物进行代替试验以做对照. 统计学处理:用交点计数法进行半定量计数:在×10Olympus目镜下，计数与纤维长轴垂直的任一0.1mm目镜网格线上纤维相交数量，每个血管分支任选3个视野同法计数，其平均值为本段血管神经纤维的密度.平均数差以X?s表示，方差t检验进行统计学处理. 2 结果 提睾肌动脉及带血管组织片经ABC法染色后，各抗体免疫阳 2 性纤维呈金黄色或淡黄色，各抗体着色一致，背景染色浅淡.对照试验均为阴性. 2.1 CGRP阳性纤维和终末的分布特点 CGRP阳性纤维和终末广泛分布于提睾肌动脉各级分支中，但随着动脉的分支阳性纤维和终末明显减少’各级分支间阳性纤维和终末数量差别明显(P,0.01’Tab1).在第1级分支，阳性纤维和终末呈浓密颗粒状，局部呈浓度斑块状.所有阳性纤维围绕动脉形成网状分布，其中有线状和串珠状结构(Fig1).在稍细的第2级分支中，阳性纤维有所减少，其形态与第1级分支相同(Fig2).至第3级分支以下，阳性纤维和终末明显减少，但颗粒状、线状、串珠状和网状纤维的很明显，其中呈网状和与血管长轴垂直之横行排列纤维也常见到(Fig3).在10μm以下毛细血管壁上仍能见到分散呈颗粒状阳性终末，局部可见色较淡之网状纤维分布.在毛细血管分叉处环绕该处之阳性纤维更为显著(Fig4). 2.2 NPY阳性纤维和终末的分布特点 NPY阳性纤维和终末密集分布于提睾肌动脉各级分支上，在第1级分支上阳性纤维和终末仍以颗粒状和串珠状分布并呈网状围绕血管壁.在第2级动脉和第3级动脉，阳性纤维和终末逐渐减少，但以网状、横行、纵行或涡旋状分布更为显著，在毛细血管壁上仍能见到阳性纤维和终末(Fig5). 2.3 SP’5-HT及M-ENK阳性纤维和终末的分布特点 3种阳性纤维和终末在提睾肌动脉各级分支上的分布特点与CGRP和NPY基本相似，但阳性产物数量有所减少，其形态以线状、横行和纵行更为明显.其中M-ENK样阳性纤维和终末最为稀疏’在毛细血管分叉处其阳性 3 纤维较其他几种性质的更多. 3 讨论 血管生理活动的调节包括神经调节，体液调节和自身调节.其中周围神经的调节通过交感神经、副交感神经、脊髓背根舒血管神经纤维、血管活性肠肽及血管内在神经释放乙酰胆硷、肾上腺素、去甲肾上腺素、胺类及肽类等活性物质对血管的舒缩功能产生影响,2，6,.本实验结果表明.大白鼠提睾肌血管各级分支均有CGRP’NPY’SP’5-HT及M-ENk免疫阳性纤维和终末分布.根据NPY与去甲肾上腺素(norepinephrine’NE)免疫阳性纤维分布区相同，认为NPY是交感性的，但目前对这些活性物质来自交感神经还是副交感性的还不清楚，不过可以推测，血管的生理活动是在多种神经活性物质、体液活性物质及自身调节等因素共同作用下的结果，本实验中的几种神经活性物质在提睾肌动脉生理活动的调节中可能起重要作用.血管的多因素调节方式和机制是相当复杂庞大的问题’需要深入研究.大白鼠提睾肌属横纹肌，按教科书所述，人体多数血管只受交感神经纤维释放NE与α和β1受体结合控制血管平滑肌保持自身紧张性活力而维特血管收缩状态.存在于骨骼肌、脑、唾液腺，胃肠道和外生殖器等处的舒血管神经一般认为是乙酰胆硷性的.在有轴突反射功能的脊髓背根舒血管神经纤维所释放的神经递质有人认为是组胺或ATP甚至是P物质，近来发现该处有cGRP的存在或CGRP与SP的共存,2,.因此，作用于血管的神经纤维性质、种类和功能已超出传统理论的范围，且有更多的活性物质被发现的趋势.cGRP是20世纪80年代才发现的目前所知对血 4 管产生较强的舒张作用的神经活性物质，而NPY则具有较强的血管收缩功能，这些物质在血管的大量分布提示其对血管功能调节中的重要作用.sP’M-ENK及5-HT均是广泛存在于中枢和周围神经的重要活性物质.sP和M-ENK与神经传入活性有关，一般认为，这两种物质除对某些大血管有收缩作用外，是有力的血管扩张剂.而5-HT是一种具有收缩和舒张双重生理功能的活性物质，但是否与提睾肌血管的特殊性和感觉冲动传入有关还有待进一步研究. 本结果显示，各种神经递质在大白鼠提睾肌血管的分布密度随其分支而递减(Tab1)，该特点与脑血管的NPY分布相似，而肠系膜上动脉的CGRP分布并不如此,7,.一般认为，缩血管神经随血管分支而逐渐增多，在肌肉静止时使血管床灌流减少，活动时才通过舒血管神经兴奋，加强血管床灌流.大白鼠提睾肌的不同特点可能与其特殊功能有关.我们发现在毛细血管分叉处有明显的NPY及CGRP粗大阳性纤维环绕存在，该特点提示这些活性物质可能对毛细血管床血液灌流起闸门作用. 血管损伤吻合后游离组织的移植及断肢再植微循环障碍的主要原因之一目前认为是血管内皮损伤后，引起胶原暴露，血小板及白细胞凝集形成血栓而造成的.我们实验中发现毛细血管上有上述神经活性物质的分布，说明神经纤维和终末直接作用于血管内皮细胞，CGRP是许多缩血管物质如内皮素等的拮抗剂，并能抑制钙内流，对心肌细胞等有保护作用.cGRP对血管内皮是否有保护作用是下一步研究的内容.本研究为丰富和完善大白鼠提睾肌微循环动物模型形态学资料’利 5 用该实验动物模型和对微循环研究提供一定的基础. 6