荧光光谱法研究拉贝洛尔与牛血清白蛋白相互作用特征

荧光光谱法研究拉贝洛尔与牛血清白蛋白相互作用特征 荧 光光谱法研究 拉贝洛尔 与 牛血清白蛋白相 互 作 用特 征 1 2 2 2 * 2,,,,杨轲胡志军王梦禅于 涛陈建秋 ( 1, ,21009; 2, ,210009)中国药科大学基础化学实验中心南京 中国药科大学分析化学教研室南京 : -摘 要应用荧光 光 谱 和 紫 外可 见 吸 收 光 谱 研 究 了 拉 贝 洛 尔 与 牛 血 清 白 蛋 白 ( Bovine Serum Albumin,BSA) 。,结合 反 应 的 光 谱 学 特 征实 验 结 果表明在 弱 酸 BSA ,性条件下拉贝洛尔对 的猝灭机理为静态猝灭而在中性和弱碱性时则为动 ; Frster 310K pH7. 41 态猝灭根据 非辐射能量转移理论计算出 和 时拉贝洛尔与 BSA 2. 74 nm; ,BSA 作用的结合距离为 通过计算热力学参数可知药物与 的相互 ,; 作用是自发过程且二者之间的主要作用力类型为疏水作用力此外用同步荧光 BSA 。光谱探讨了拉贝洛尔对 构象的影响研究还表明常见共存离子对结合反 。应有较显著的影响 : ; ; ; ; -关键词拉贝洛尔牛血清白蛋白相互作用荧光光谱紫外可见光310000720( 2011) 0403906: O657. : A: ---中图分类号 文献标识码 文章编号 谱 ( Labetalol) ,,物分子在生物体中的作用机理以及为安全用药提拉贝洛 尔 又 名 柳 胺 苄 心 定为 肾 ,,。 上腺素受体阻断剂兼有 α 和 β 受体阻断作用能 供了实验依据 ,,1 阻断肾上腺素受体放缓窦性心律减少外周血管 实验部分 ,, 阻力用于各种类型的高血压急症及高血压危象1. 1 仪器与试剂,1,。此外还对治疗妊娠高血压综合征有着疗效血 ,530 1PC ,UV ,1800 RF 型 荧 光 分 光 光 度 计 ,清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白担负药 , ,25 ( ) ; PHS 紫外 可见分光光度计日本岛津公司 ,物的贮存和运输等重要作用药物分子进入血液后 ,2 ; BP211D ; HH 型酸度 计型 数 显 恒 温 水 浴 锅电 ,不同程度地与血清白蛋白结合可以控制药物释放 。 子天平 ,和代谢因此药物与蛋白相互作用是目前广泛关注 ( 99. 0 % ) ; ( Bovine 拉贝洛 尔 牛 血 清 白 蛋 白 ,2 ,6, 。,的焦点本实验在模拟体外生理条件下应用 Serum Albumin,BSA) ; ( Tris) 将三羟甲基氨基甲烷 -荧光光谱和紫外可见吸收光谱研究了拉贝洛尔与 mol / L,pH7. 41,9 g / L NaCl ( 0. 1 缓冲溶液内含 维 ,5 ( Bovine Serum Albumin,BSA ) 牛血清 白 蛋 白 结 合 ) 4. 0 ×10 mol / L 持离子强度配制成 的储备溶液 ,BSA 反应的光谱 学 特 征着 重 研 究 了 拉 贝 洛 尔 对 ( ，5 ? ) ; 并保存于冰箱中温度 拉贝洛尔贮备液浓 ,3 ,BSA 的荧光猝灭机 理得 出 了 拉 贝 洛 尔 与 表 观 结 5. 0547 ×10 mol / L,; 度为 使 用 前 液 由 此 稀 释实 、,合常数结合位点数及结合距离根据热力学参数 9 g / L NaCl , 验所用溶液均 以 水 溶 液 配 制以 维 持 ,判断了结合作用力类型并用同步荧光光谱研究了 2 + 2 + ; Ca,Mn,生理条 件 下 的 离 子 强 度将 阳 离 子 BSA ,拉贝洛尔对 构 象 的 影 响同 时 还 研 究 了 常 见 + 2 + 2 + 2 + 2 + , K ,Zn,Mg,Cu,Co,Br 和非金 属 阴 离 子 BSA 。共存离子对拉贝洛尔和 结合反应的影响本 , , , 2 , BrO ,NO ,H PO ,SO相应盐分别配制成浓度 3 3 2 4 4 、研究为阐明药物在体内的输送和代谢过程了解药 ,3 ×10 mo / L 。Tris BSA 5. 0 l为 的 储 备 液除 和 为 20100701 : 20100910: --;--收稿日期修订日期 : ( 200809016) ( KF2009008 ) 基金项目国家环保公益性行业科研专项项目与江苏省环境工程重点实验室开放基金项目 资助 : ( 1984 ,) ,,; E-mail: cpucjqer@ yeah, net 作者简介杨 轲男助理实验师 1 pH 表 不同温度和 条件下荧光猝灭反应的线性方程和相关参数 Tab, 1 Linea equations and relative parameters for fluorescence quenching at different temperatures and pH 相关系数 猝灭常数 猝灭速率常数 2 T / K线性方程 pH 值 温度 R / ( L / mol) / ( L / ( mols) )? 3 311F/ F ,1 = 2. 575 ×1 0 ,c,, 0. 0066 2. 575 ×1 0 2. 575 ×1 0 298 9966 0. 0 Q02 6. 3 3 11 3100. 9967F/ F ,1 = 2. 276 ×1 0 ,c,, 0. 0140×1 0 2. 276 ×1 0 2. 276 0 Q 11 311F/ F ,1 = 3. 329 ×1 0 ,c,, 0. 0064 3. 329 ×1 03. 329 ×1 0298 9969 0. 0 Q41 7. 3 3 11 3100. 9959F/ F ,1 = 4. 088 ×1 0 ,c,, 0. 0316×1 0 4. 088 ×1 0 4. 088 0 Q 3 311F/ F ,1 = 3. 475 ×1 0 ,c,+ 0. 0099 3. 475 ×1 0 3. 475 ×1 0 298 9986 0. 0 Q49 8. 3 3 11 3100. 9993F/ F ,1 = 5. 088 ×1 0 ,c,, 0. 0058×1 0 5. 088 ×1 0 5. 088 0 Q 2. 2. 3 BSA ,紫外吸收光谱的变化 试验分别测定了弱 的加入使 的 紫 外 吸 收 发 生 了 变 化即 猝 灭 机 ,6 、,4. 0 ×10 mol / L BSA ; ( pH7. 41 ) 酸性中性和弱碱性条件下理为静 态 猝 灭而 在 中 性 和 在 弱 碱 性 BSA ( pH8. 49) ,的紫外吸收光谱图及拉贝洛尔与 等摩尔混合 条件下 两 图 谱 完 全 重 合表 明 药 物 的 加 。,BSA ,物与拉 贝 洛 尔 的 差 谱试 验 研 究 发 现在 弱 酸 性 入并未使 的 紫 外 吸 收 发 生 变 化即 猝 灭 机 理 ( pH6. 02) ,。条件下 两 图 谱 没 有 完 全 重 合表 明 药 物 为动态猝灭 c) ,T = 310 2 ( ( a) 、BSA ( b) ( K图 紫外吸收差谱图拉贝洛尔的紫外吸收谱的紫外光谱和两者的差谱 Fig. 2 UV spectrum of labetalol and differential spectrum between labetalol and BSA ( molar ratio 1 ?1 ) with labetalol ( UV spectrum of labetalol ( a ) 、UV spectrum of BSA ( b ) and differential spectrum between labetalol and BSA( c) ,T = 310 K 2. 2. 432. Kn 猝灭机理的判断 通过以上两种方法的检表观结合常数 和结合位点数 A ,( pH6. 02) ,( pH6. 02) 验可以判断在弱酸性条件下猝灭机理 因为在弱酸性条件下静态荧光猝灭 ; ( pH7. 41 ) ( pH8. 49 ) 为静态猝灭在中性和弱碱性BSA 作用是导 致 拉 贝 洛 尔 对 荧 光 猝 灭 的 主 要 原 ,7,,。,,: 条件下猝灭机理为动态猝灭一般认为各类猝 因所以用静态猝灭公式 灭剂都会使生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率 ,F F 0 ( 3)lg = lgK + nlg ， ,c ,， A Q 10 ， ， F 2 ×1 0L / ( mol ? s) ,1 , 常数为 而 从 表 可 以 看 出 ( pH7. 41 ) ( pH8. 49 ) F , F 在中性和 弱 碱 性 条 件 下 猝 灭 0 ,l g ， ,c,， 的lg分 别 作 不 同 温 度 下 Q11 ， ， F 10,,速率常数在 以 上由 此 考 虑猝 灭 机 理 似 乎 不 ,K ,, 双 对 数 图 根 据 截 距 和 斜 率 求 得 不 同 温 度 的 应为动态猝灭但是考虑到实验体系为离子溶液 A,7,n。,( pH6. 02 ) ,和 由 结 果 可 看 出 在 弱 酸 性 条 件离子强度是 影 响 猝 灭 常 数 的 重 要 因 素因 此 我 BSA , 下 拉 贝 洛 尔 与 的 结 合 常 数 较 大 可 形 成 约 们认为猝灭速率常数的增大很有可能是离子强度 。 影响的结果1 ,,个 结 合 位 点 且 温 度 对 结 合 常 数 的 影 响 较 小 ( pH6. 02 ) ,0. 15; F ， ， 量子产率通常取 λ 为荧光供能体在波长 说 明 在 弱 酸 性 条 件 下 拉 贝 洛 尔 与 ,， BSA ,， λ 处的荧光强度ε λ 为受能体在波长 λ 处的摩尔之 间 有 较 强 的 结 合 作 用 可 以 被 蛋 白 质 运 3 ; J( cmL / mol) 。?吸光系数是供能体的荧光发射光 输 和 储 存 。2. 4 谱和受能体的吸收光谱之间的光谱重叠积分 作用力类型的判断 有机小分子和蛋白质等生物大分子之间的结合 3 pH7. 41,310 K BSA 图 为 时 的荧光光谱与拉 、、力主要有疏水作用力氢键范德华力和静电作用力 。( 6) 贝洛尔的紫外吸收光谱的重叠光谱依据式求 -16 3 。。等不同分子与蛋白质结合力的类型是不同的当 J = 5. 35 ×1 0cmL / mol,?得光谱的重叠积分 再 ,H 温度变化不大时反应的焓变 Δ可以看成一个常 ( 5) R= 1. 57 nm ( 4) 由式求得 由式求得能量转移 0 ,,数根据热力学参数之间的关系式可求得生成自由 E = 0. 0339 效率 和拉贝洛尔在蛋白质中的结合位置、,2 。 GS H212 r = 2. 74 nm。 能变 Δ熵 变 Δ和 焓 变 Δ结 果 如 表 所 示距 位色氨酸残基的距离 ,8,Ross 62. 等出了判断生物大分子与小分子结合 共存离子对结合反应的影响 : H ，0 ,S ，0 ; 有关金属离子存在对药物和蛋白质结 合 反 应力性质的热力学规律ΔΔ疏水作用力 ,10,11,,的影响已见报道本文较全面地研究了阳离子 ， 0,S ， 0 ; 0,S ，0 H HΔΔ氢键或范德华力Δ?Δ静电 2 + 2 + + 2 + 2 + 2 + 2 + Ca、Mn、K 、Zn、Mg、Cu、Co 和 阴 离 子。BSA ，0 ,G 作用力拉贝洛尔与 作用的 Δ说明拉贝 , ,, , 2 , ,5 mol / LBr 、BrO 、NO、HPO、SO×1 0 4. 0 在 BSA ; 洛尔与 的 结 合 是 一 个 自 发 过 程拉 贝 洛 尔 与 3 3 2 4 4 BSA 条件下拉贝洛尔与 体系的结合常数的变化情 BSA H ， 0,S ，0 ,结合的 ΔΔ由此推断出拉贝洛尔与 ,3 。 况实验结果见表 所示BSA 。之间的作用力主要表现为疏水作用力 ,, 从表中可以看出对于金属离子在试 验 范 围2 BSA 表 拉贝洛尔与 的结合反应热力学参数 ,, 内随着金属离子的加入二者反应的结合常数均 Tab, 2 Thermodynamic parameters of BSA with labetalol2 + 2 + 2 + 2 + ,Mg、Cu、Zn、Mn,增大和 对其影响较小而 2 + + 2 + H G ?S ??温度 Ca、K CoBSA 和 对 与拉贝洛尔的结合反应影 pH 2 + T / K / ( kJ / mol) / ( J / ( molK) ) / ( kJ / mol) ?,Co。响较大其中 以 对 其 影 响 最 大所 引 起 两 者 298 04 ,21 . 10 116. 结合常数增大的原因有可能是金属离子能够与拉 02 13. 48 6. 310116. 03,22 . 49-贝洛尔药物分子发生结合形成药物金属离子配合 298 260. 34 ,23 . 77 ,BSA 物所形成的 配 合 物 再 与 的 氨 基 酸 残 基 发 生 7. 41 53. 81 310260. 32,26 . 89,。,结合从而增强其结合过程对于阴离子在试验 298 163. 76 ,18 . 64 , , ,Br BrO BSA 范围内和 的加入并没有影响到 和 3 8. 49 30. 16 310163. 77,20 . 61, , NO 、H PO ,拉贝 洛 尔 的 结 合 过 程但 是 随 着 和 3 2 4 2 , SO,,的加入两者反应的结合常数均增大其可能 4 2. 5结合距离的计算 ,9,Frster- 运用 偶极偶极非辐射能量转移原理 E -r 及能量转移效率 与供能体受能体间的距离 及 R:临界能量转移距离 的关系式 0 6 R F 0 ( 4)E = 1 , = 6 6 FR+ r 0 0 6,2 5 2 ,4 R 5)( = 8. 8 ×10 K nJ Φ 0 D 4 F ， ， ， ， ε λ Δ?λλλ J = ( 6) F ， ， Δ?λλ 2 3 ( a) BSA 图 拉贝洛尔的紫外吸收光谱和 的荧 = 50% ; K ,RE 式中为 时的临界距离为偶极空间 0 ( b) 光光谱,- 取向因子可取供能体受能体各向随机分布的平Fig, 3 UV adsorption spectrum of BSA ( a) and 2 /3; n , 均值的 为介质的折射指数一般取水和有机 Fluorescence spectrum of labetalol ( b), 6 1. 336; 物折射指数 的 平 均 值 Φ为 功 能 体 的 荧 光 D = 4. 0 × 10 mol / L) ( pH7. 41,T = 310 K,c = c BSA labetalol BSA ,。的原因是这些离子作为一种诱导剂影响 表面 像进而增强其结合过程因此上述共存离子的加 ,BSA BSA , 氨基酸的排列 顺 序同 时 使 分 子 构 像 发 生 一入使药物与 的 结 合 作 用 增 大相 应 地 延 长 了 , 。 定程度的改变从而形成蛋白质活性中心所需的构药效发挥的时间 3 BSA 表 不同共存离子对拉贝洛尔与 结合常数的影响 Tab, 3 Effect of different ions on the binding constant of labetalol with BSA 相关系数 结合常数 体系 线性方程 2/ ( L / mol) R 3 F/ F ,1 = 4. 088 ×1 0 ,c,, 0. 0316 0 Q3BSA + labetalol 4. 088 × 100. 9959 3 2 + F/ F ,1 = 5. 140 ×1 0 ,c,, 0. 02083 0 QBSA + labetalol + Ca 5. 140 ×1 00. 99393 2 + 3F/ F ,1 = 4. 595 ×1 0 ,c,+ 0. 0088 0 QBSA + labetalol + Mg 4. 595 ×1 00. 9983 3 2 + 3F/ F ,1 = 4. 330 ×1 0 ,c,+ 0. 0111BSA + labetalol + Cu 0. 9959 4. 330 ×1 00 Q阳离子 2 + 330. 9996 BSA + labetalol + Co F / F ,1 = 5. 555 ×1 0,c ,+ 0. 0031 5. 555 ×1 00 Q 2 + 330. 9984 BSA + labetalol + Zn 4. 334 ×1 0F / F ,1 = 4. 334 ×1 0,c ,, 0. 0009 0 Q 2 + 30. 9987 3BSA + labetalol + Mn 4. 236 ×1 0F / F ,1 = 4. 236 ×1 0,c ,+ 0. 0082 0 Q +30. 9980 BSA + labetalol + K 3 4. 651 ×1 0F/ F ,1 = 4. 651 ×1 0 ,c,+ 0. 0088 0 Q,33BSA + labetalol + Br F / F ,1 = 4. 107 ×1 0,c ,, 0. 0029 4. 107 ×1 0 0 Q 0. 9981 ,33+ labetalol + BrO BSA F / F ,1 = 4. 053 ×1 0,c ,+ 0. 0058 4. 053 ×1 03 0 Q 0. 9984 ,33 BSA + labetalol + NO 4. 562 ×1 0F / F ,1 = 4. 562 ×1 0,c ,+ 0. 0206 0. 9930 阴离子 3 0 Q , 3 3 0. 9989 BSA + labetalol + HPO4. 823 ×1 0 F/ F ,1 = 4. 823 ×1 0 ,c,, 0. 00192 4 0 Q32 ,0. 9965 34. 695 ×1 0 BSA + labetalol + SO F / F ,1 = 4. 695 ×1 0,c ,+ 0. 0127 4 0 Q 2. 7BSA ,, 拉贝洛尔对 构象的影响 白结构变疏松反之亦然因此可以根据发射波长 ,7,= 15 nm 60 nm 。 Δλ 和 所得同步荧光光谱分别的改变来判断蛋白质构象的变化 4 ( a) ( b) = 15 nm 图 中 和 分别为 Δλ 和 Δλ,表示蛋白质酪氨酸残基和色氨酸残基的光谱特征 = 60 nm ,BSA 的同步荧光光谱 图在 浓 度 固 定 为由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的最大发射波 ,6 4. 0 ×10 mol / L ,, ,时随着拉贝洛尔浓度的增加最长与其所处 微 环 境 的 极 性 有 关最 大 发 射 波 长 红 。 ,,,大发射波长的强度逐渐降低移表明此残基所处环境极性增加疏水性降低蛋 4 图 同步荧光光谱 Fig. 4 Synchronous fluorescence spectra a , = 15 nm; b , = 60 nmΔλ Δλ ,6 ,6 c= 4. 0 ×1 0 mol / L; a ,j : c( ×1 0 mol / L ) = 0,20. 22,40. 44,60. 66,80. 88,101. 0,121. 3,曲 线 BSA labetalol 141. 5,161. 8,182. 0( pH7. 41,T = 310 K) , ,,,,,, 3费 燕陆 国 才范 国 荣等光 谱 学 与 光 谱 分 析 酪氨酸残基的特征荧光光谱峰位发生了明显 2008,28( 11) : 2609,,变化且最大吸收波长明显蓝移说明拉贝洛尔与 ,,, ,2008,4, ,李 丹姜新民严拯宇光谱 学 与 光 谱 分 析BSA , 的作用 使 蛋 白 质 的 构 象 发 生 了 一 定 的 变 化 28( 6) : 1312,酪氨酸残基所处微环境的极性减弱拉贝洛尔分子 ,5, Brotati C,Samita B, J Luminescence,2009,129: 34BSA ,插入 分子 内 部 的 疏 水 空 腔使 其 疏 水 结 构 变 ,6,Abdol-Khalegh B,Taheri-Kafrani A, Colloids Surf B:,,紧密肽链的伸展程度有所降低蛋白质的亲水性 ,,,Biointerfaces,2007,55: 84 陈国珍黄 贤 智郑 朱 梓,11,。BSA ,减弱此时 构象改变对应的氨基酸原有 , , : , 1990,122等荧 光 分 析 法北 京科 学出版社 ,7, ,12,。的生理功能有可能会丧失或改变色氨酸残基 Ross D P,Subramanian S, Biochem,1981,20: 3096 ,的特征荧光光谱峰位未发生明显变化说明色氨酸 ,8, ,, , : 杨 频高 飞生 物 无 机 化 学 原 理北 京科 学 出 ,,9,残基所处的微环境疏水性及亲水性无明显变化酪 , 2002,322版社 氨酸残基所处的微环境疏水性及亲水性发生了明 ,11,, ,2010,,,,10, 李晓甜曾 分 析 试 验 室 超冯 素 玲。显的变化 29( 5) : 44 , ,2010,,,,,11, 田建袅谢 余 寰赵 彦 春等化 学 试 剂 参考文献 32 ( 4) : 311, ,2008,25( 3) : 276 ,1, ,国大亮朱晓薇化学工业与工程 Yan C N,Zhang H X,Liu Y, Acta Chim Sinica,2005,12, , ,,, , ,2,吴秋华宋 双 居王 春 等光 谱 学 与 光 谱 分 析 63 ( 18) : 1727 2009,29( 11) : 3088 Study on the interaction of labetalol and bovine serum albumin by fluorescence spectrometry 1 2 2 2 * 2 YANGK e,HU Zhjun,WANG M engchan,YU Taoand CHEN Janqu( 1, Experiment Center of Basic i--i-i Chemistry,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009; 2, Department of Analytical Chemistry,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009) ,Fenxi Shiyanshi,2011,30( 4) : 39 ,44 Abstract: The interaction characteristic of labetalol and bovine serum albumin ( BSA ) was investigated by fluorescence spectrometry and ultraviolet absorption spectrometry, The results show that the quenching - mechanism of the intrinsic fluorescence of BSA by labetalol is a static quenching procedure in the weak acid medium,while that is kinetic quenching procedure in the weak basic or neutral medium, The binding site is a distance 2. 74 nm away from BSA based on Frster snonradiation energy transfer mechanism, The thermodynamic - parameters show that the binding foroce between labetalol and BSA is mainly the hydrophobic interaction,Synchronous spectrum was used to investigate the conformational change of BSA, In addition,the common ions also influence the binding of labetalol to BSA, Keywods: Labetalol; Bovine serum albumin; Interaction; Fluorescence spectrum; Ultraviolet spectrumr-