[DOC] 海参糖胺聚糖抑制血小板——内皮细胞粘附及调节血小板粘附分子表达

[DOC] 海参糖胺聚糖抑制血小板——内皮细胞粘附及调节血小板粘附分子达 海参糖胺聚糖抑制血小板——内皮细胞粘 附及调节血小板粘附分子表达 中国临床匿学2006年6月第13卷第3期ClinicalMedicalJournalofChina,2006.Vo1.13,No.343l 论着 海参糖胺聚糖抑制血小板 内皮细胞粘附及调节血小板粘附分子表达 王曼玲徐建民 摘要目的:探讨玉足海参糖胺聚糖(GAG)对血小板与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)粘附,及血小板粘附分子表达的调 节作用.:应用流动小室模型检测GAG对活化血小板与HUVECs粘附反应的干预作用,通过激光共聚焦显微镜获 取图像.采用流式细胞仪测定药物干预后活化血小板表面粘附分子GPIIb/Ill,GPL的表达.结果:在高,低切变率作用 下,不同浓度组GAG均可以抑制活化血小板与HUVECs的粘附反应,GAG5mg/L组抑制作用最为明显,粘附率分别约 为凝血酶组的35和40(P<0.001,P%0.001).GAG可以显着抑帮】急性血栓形戍小鼠血小板GP?b/?的表达,虽 .的表达呈上升趋势,但同对照组相比表 然随着时间的延长GPIIb/? 达量仍低,有显着差异(P%0.001).同时GAG可 以上调活化血小板GPL的表达,表达量约为对照组的3倍(P%0.001). 结论:GAG通过调节血小板粘附分子表达, 抑制活化血小板与内皮细胞的粘附反应,因而可能是一种有效的抗 血小板粘附剂. 关键词玉足海参糖胺聚糖;内皮细胞;血小板;粘附分子; 中图分类号R645.2文献标识码:A Eft0fGAGo111Platelet-EndothelialCellAdhesionandExpressionofAdhesionMolecules厂ANGManling XUJianming.DepartmentofHematology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032 AbstractObjective:Theaimofthisstudywastoassesstheinfluenceofholothurianglycosaminoglycan(GAG)ontheadher— enceofthrombin-inducedplateletstohumanumbilicalveinendothelialcells(HUVECs)andtheexpressionofadhesionmole— culesonactivatedplatelets.1Vletl~ds:WashedplateletsandHUVECswerepre-inducedbythrombinwithorwithoutdifferent concentrationsofGAG.TheadhesionofactivatedplateletstoHInCsunderdifferentfluidshearstressconditionswasmeas— uredintheflowchambersystemandthephotographswereobtainedthroughlaserscanconfocalmicroscope(LSCM).Theex— pressionofGP?b/ ?,GPIbonthrombin-inducedplateletswastestedbyflowcytometry.Results: GAG(1~10rng/L)could inhibittheadhesionofactivatedplateletstoHUVECsunderbothhighandlowfluidshearstress(1100s’and300s-.respec— tively).WhenGAGwasattheconcentrationof5rng/L.theinhibitiveactivitywasmostsignificantandtheadhesionrates wereabout35and40ofthoseinthrombingrouprespectively[(5.24?0.26)%vs.(14.85?0.82)%and(6.70?0. 29)%vs.(16.83?0.58),respectively].GAGcoulddown-regulatetheexpressionofplateletGP?b/?onacutethrombo— embolisminmice.TheinhibitoryactivityofGAGexhibitedaweakeningtendencyfortyminutesaftertheinjectionofthrombin, buttheexpressionofGP?b/? wasstillsignificantlylowerinGAGgroupthanincontrolgroup(P<0.001).Aboutthree— f0ldincreaseintheexpressionofGPLonthrombin-inducedplateletswasseenifco-culturedwithGAG[(43.11?1.04)vs. (14.29?1.6o)].C0IlcIllsi 加:GAGmightbeaneffectiveantiadhesiveagentthroughmodulatingtheexpressionofadhesion moleculesonplateletsandinhibitingtheadhesionofplateletstoendothelialcells. KeyWordsHolothurianglycosaminoglycan;Endothelialcells;Platelet;Adh esionmolecules 玉足海参糖胺聚糖(holothurianglycosaminogly— can,GAG)在临床上主要用于血栓性疾病的预防和治 疗.基础和临床研究证实,GAG通过多种机制发 挥抗凝血和抗血栓作用.有关GAG对血小板功能作 用的研究主要集中于GAG对血小板聚集功能的影响, 但研究结果目前尚存在争议.Li等[2认为GAG可以 引起血小板聚集;但阮长耿等D认为,GAG对血小板的 作用表现为凝集而非聚集,这种凝集作用使血小板不 能发挥应有的生理活性和功能. 所有体内引起血小板活化的因素都是由于改变了 血小板表面GP?b/?,使其对纤维蛋白原的结合力由 低到高,从而引起血小板聚集.而血小板通过其表面 作者单位:复旦大学附属中山医院血液科,上海200032 受体(如GPL)在内皮细胞表面粘附和伸展是引起其他 活化或未活化血小板在局部形成聚集体的前提.本实 验主要就GAG对活化血小板与内皮细胞的粘附及血 小板表面粘附分子表达的作用进行了研究,以进一步 明确GAG对血小板功能的影响. 1资料与方法 1.1人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定按Jaffe 等_4的方法制备人脐静脉内皮细胞(HUVECs),即 0.2胶原酶I(Sigma公司)消化并收集HUVECs,完全 培养液成分为M199-20胎牛血清(Hyclone)一2mm/L- 谷氨酰胺.根据细胞形态,vWF合成和分泌,因子? 免疫荧名反应进行原代细胞鉴定.采用第一代HU— VECs进行与血小板的粘附实验. 1.2人血小板的分离与标记健康志愿者,2周内未 吸烟,未服用抗血小板药物,采集静脉血,3.8枸橼酸 432ClinicalMedicalJoumalofChina2006.Vo1.13,No.3中国临床压亏2006年6月第13卷第3期 钠(1:9)抗凝.上下颠倒轻摇充分混匀后,22?下1000r ?min-离心15min,收集富血小板血浆(PRP). PRP22?下3000r?min-离心15min.沉淀血小板用 台氏TyrodeS缓冲液(mmol/L:KC12.6,MgC12?6H2O 4.0,NaC1135,NaHCO312.0,NaH2PQ0.42,葡萄糖 5.0,0.25小牛血清,pH7.4)洗涤3次,并复悬于台氏 缓冲液,调整血小板计数为4×10”/i.按照实验设计 加入不同剂量GAG(华利康海洋生物工程有限公司), 肝素(5mg/L)及凝血酶(DaleBehringManburg公 司,1U/n~),阳性对照组只加入凝血酶,阴性对照组仅 加入等量PBS液,37~C共同作用1h.台氏缓冲液洗涤 3次后,用终浓度为30~g/ml的丫啶红染色血小板,避 光静置15min.台氏缓冲液洗涤3次后,PBS液调整 血小板的浓度为2×10/L. 1.3流动小室检测血小板与HIS粘附HU— VECs培养于1明胶覆盖的35nlrn培养皿(Corning) 中生长至融合.按照实验设计加入各制剂,同血小板 的预处理.收集培养上清液,10000r?min-离心10 min去除细胞碎片后加入到相应的血小板悬液中.建 立平板流动小室体系,通过荧光显微电视系统(Olym— pusBX50)实时观察并记录粘附过程.流动结束后,取 下培养皿,置于激光共聚焦显微镜(LSM510型)下,用 514nrn波长激光激发,580nrn以上波长检测血小板荧 光图像,以透射光通道扫描内皮轮廓,叠加获取内皮细 胞层上粘附血小板图像.分别检测切变率为300s一, 1lOOs时血小板与内皮细胞的粘附情况.血小板粘附 率一荧光面积/图像视野面积×100. 1.4流式细胞仪测定血小板粘附分子表达 1.4.1血小板GP?h/?检测雄性ICR小鼠(约5周 大,体重25~35g)购自复旦大学附属中山医院动物房, 1戊巴比妥钠45mg/kg腹腔内注射麻醉小鼠.经阴 茎背静脉注入GAG(1mg/kg),肝素(1mg/kg)或等量 生理盐水(每组各10只).15min后经阴茎背静脉注 入凝血酶(8OOU/kg)I5].10min及40min后分别经双 侧颈外静脉取血0.1ml,3.8Z枸橼酸钠(1:9)抗凝.取 101抗凝全血,同时加入FITCanti-CD41(GP?b)401 (Serotec),PEanti—CD61(GPIIIa)20u1(Biolegend).室 温下避光反应20min后,加入1ml含1多聚甲醛的 PBS液室温下避光静置30min,待测. 1.4.2血小板GP工b检测健康志愿者,2周内未吸 烟,未服用抗血小板药物,采集静脉血,3.8Z枸橼酸钠 (1:9)抗凝.取抗凝全血101,分别加入GAG (5mg/L),肝素(5mg/L)及凝血酶(1U/rn1),对照组仅 加入凝血酶,37~C共同作用1h.然后加入FITCanti- CD42b(GP工b)4/,1(Biolegend),余处理同上. 1.4.3流式细胞仪(BD公司,FACSCalibur型)检测血 小板粘附分子表达选择488nlKn的氩离子激发波长, 调整前向角散射与侧向角散射均采用对数放大,圈定 血小板门.每个样品收集2万个血小板,GP?/?用 阳性细胞百分比表示,GPk用平均荧光强度(MFI)表 示. 1.5统计方法应用统计学软件SPSS12.0进行统计 学分析,实验数据用均数?标准差表示,采用单因素方 差分析和t检验. 2结果 2.1血小板与HUVECs的粘附低切变率下的血小 板粘附程度大于高切变率下的粘附程度.血小板经凝 血酶处理后明显增加其与活化HUVECs的粘附反应, 切变率为300S,1100S时的粘附率分别为对照组的 3.6倍和4.8倍.而用不同浓度GAG(1,10mg/L)干 预后,均可以不同程度的抑制高,低切变率下血小板与 HUVECs的粘附反应,其中GAG5mg/L组抑制作用 最为明显,分别为凝血酶组粘附率的35和40(P< 0.001,P<0.01).肝素对高,低切变率下的血小板粘 附也呈抑制作用,但弱于相同剂量的GAG(图1,图2). AGAG5mg/L~.B凝血酶组 图l切变率为300s.时血小板与内皮细胞粘附图像 碍 莲 捶 牮 ? CTHG1G5G10 注:C:对照组;T:凝血酶组;H:肝素组; GI:GAG1mg/I;G5:GAG5mg/I; G10:GAG10mg/L;与凝血酶组相比, 8-P<0.05,P<0.()1,P<0.00l;n=3 图2GAG抑制血小板与内皮细胞的粘附 2.2GAG对血小板粘附分子表达的影响GAG对血 小板GP?/?表达的影响:对照组注入凝血酶10min 后即有1只小鼠死亡,40min后又有5只小鼠死亡,在 检测时间内GAG组及肝素组小鼠均存活.给药组凝 血酶注射10min后血小板GP?b/IIIa的表达量约为 对照组的50(P<0.001),且GAG组降低得最为明 显,但与肝素组相比并无统计学差异(P一0.06).40 min后对照组血小板GP?/?的表达进一步上升,而 给药组则基本稳定于10min时的水平(表1).GAG 对血小板GPIb表达的影响:GAG或肝素与凝血酶共 中国临床压亏2006年6月第13卷第3期ClinicalMedicalJournalofChina,2006.Vo1.13,No.3433 同作用于血小板,血小板GPL表达量分别为对照组的 3倍及4倍,肝素上调GPL表达量的作用更为明显,两 者与对照组相比均有显着差异(P<0.001,P<0.001, 表1. 表1GAG调节活化血小板GP[I/?和GPIh表达?s) 汪:与对照组相比,P<().001 3讨论 抑制血小板活化的研究主要集中于抑制血小板聚 集,虽然抑制血小板粘附可能有治疗价值,而在有效抑 制血小板粘附方面却几乎无相关研究.Tyrell等_6的 研究显示肝素具有抗粘附作用,而GAG在多种药理学 作用上与肝素相仿.所以本实验就GAG对活化血小 板与HUCs粘附及血小板粘附分子表达的影响进 行了研究,并同肝素进行了比较. 在本实验中我们利用内皮细胞体外培养技术,形 成模拟体内血管壁的内皮细胞单层,并以明胶(变性胶 原,具有与血小板更强的粘附性)作为内皮下基质.采 用流动小室模型模拟体内血液流动环境,该装置通过 注射泵推动荧光标记血小板悬液在覆盖内皮细胞单层 的管腔内流动,并对其施加一定的剪切力,以检测不同 切变率下血小板与HUcS的粘附.此模型一独特 之处为不仅可以实时观察血小板与内皮细胞的粘附过 程,而且可以把图像信息扩展至摄像系统将此粘附过 程做永久记录.结果显示低切变率下血小板与HU— VECs有更强的粘附作用,这是因为虽然高切变率增加 了血小板到达内皮细胞表面的频率,但是粘附血小板 被冲刷离开内皮细胞表面的过程也增强,总的结果是 导致粘附血小板减少l7].血小板和HU?Cs经凝血 酶活化后,高,低切变率(1100S,,300S.)下的粘附 反应均明显增强.而用不同浓度GAG干预后,高,低 切变率下活化血小板与H1眦S的粘附反应均受到 不同程度的抑制,当GAG为5nag/L时抑制作用最为 明显.因此虽然体外实验中GAG不是一种有效的抗 血小板聚集剂,但是我们的实验显示它可能是一种有 效的抗血小板粘附剂. 血小板与内皮细胞的粘附是通过粘附底物与血小 板表面相应受体结合实现的,因而我们选择血小板表 面粘附受体作为实验靶点,以探讨GAG抗血小板粘附 的可能机理.GPIb和GP]I/?是血小板膜表面的主 要粘附分子,GPL正常情况下均匀分布在整个血小板 膜表面,当血小板激活时,OPIb迅速从膜表面转移到 中央管中,导致膜表面量减少.因而与其他激活依赖 性抗体相反,与活化血小板GPL结合的单克隆抗体量 较未活化血小板明显减少].在高切变率状态下,GP L与vWF的结合是引起血小板粘附与聚集的首要因 素.GP?/?是血小板聚集,血栓形成的最终通道,可 直接反映血小板的活化状态.血小板活化时,GP?/ ?因构象改变而暴露出与纤维蛋白原结合的受体结 合部位,1个纤维蛋白原可以同时和至少2个GPII/? 复合物结合,血小板通过各自的GP]I/III复合物互相 结合而聚集起来,最终形成血栓的雏形.在低切变率 状态下,血小板粘附和聚集主要通过GP?/I]I与纤维 蛋白原相互作用来实现,GPk与vWF也有一定的参 与..”].在本实验中,提前注射GAG可以显着降低急 性血栓形成小鼠的死亡率,凝血酶注射40min后,对照 组共有6只小鼠死亡,而GAG组及肝素组无一只死 亡,但2h后分别有2只及1只小鼠死亡,与Nagase 等l_1]的研究结果相似.GAG对血小板粘附分子表达 的调节作用表现为可以降低活化血小板GPII/Ill的 表达量,而提高血小板GPIb的表达量,从而达到抑制 血小板活化的作用. 在本实验中我们证实GAG可能通过调节血小板 粘附分子OPlI/11I和GPk表达,抑制活化血小板与 HUVECs的粘附反应,因而可能是一种有效的抗血小 板粘附剂. 参考文献 1LiZG,WangHI…LiJZ,eta1.Basicandclinicalstudyonthean tithromboticmechanismofglycosaminoglycanextractedfromseacu cumber[J].Chine~MedicalJournal,2000,113:706—711. 2Lijz,IAanEC.Mechanismofrabbitplateletagglutinationinducedby acidicmucopolysaccharideextractedfromstichopusjaponicusselenka [J].ThrombHaemost.1988,59:432—434. 3阮长耿,陈宏.张威,等.海参酸性粘多糖Siamp对兔血小板的作用 EJ].苏州医学院院报,1986,6:8-10. 4JaffeEA,NachmanRI,BeckerCG,eta1.Cultureofhumanendothelial cellsderived[romumbilicalveins[J].JClinInvest,1973,52:2745— 2756. 5KumadaT,DittmanWA.MajerusPW.Arole[orthrombomodulinin thepathogenesisofthrombin-inducedthromboembolisminmiceEJ]. 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