抗凝血因子Ⅰ与凝血因子IX结合反应及纳米Fe3O4对镉毒性的抑制作用研究

抗凝血因子Ⅰ与凝血因子IX结合反应及纳米Fe3O4对镉毒性的抑制作用研究 抗凝血因子?与凝血因子IX结合反应及纳米Fe3O4对 镉毒性的抑制作用研究 中国科学技术大学 硕士学位论又 抗凝血因子与凝血因子 结合反 应及纳米对镉毒性的抑制作用 研究 张 燕 作者姓名: 无机化学 学科专业: 研究方向: 生物无机化学 徐小龙副教授 导币姓名: 完成时间: 二。一二年五月二日 时 , 十’ : : 略 臼 : . 沁 : ,中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文,是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除已特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含任何他人已经发或撰写 过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的。 签字日期:型 亟:筮 作者签名:戤叛 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一,学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权,即:学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅,可以将学位论文编入《中国学 位论文全文数据库》等有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 , 口保密 眦?开 年 导师签名: ;经:,幺 作者签名:兹羲 签字日期: 趔?:星 签字日期:边,占上摘要 摘要 全文分成两个部分,第一部分主要研究了抗凝血因子与凝血因子结合 反应以及钙离子对该结合的影响;第二部分是关于纳米粒子与重金属毒性的毒性 相互作用,由于纳米粒子的广泛运用,纳米粒子的毒性受到关注,另一方面重金 属污染日益严重,对生态环境造成巨大损害。过去的研究主要着眼于其中某一个 对象的研究,而对纳米粒子和重金属的协同作用研究较少。本文就目前应用广泛 的纳米与重金属对小鼠毒性的协同作用进行研究,发现可以抑 制对小鼠肝脏的毒性,具有负协同效应。全文共分为四章。 第一章:介绍了凝血过程、.型凝集素类似蛋白、凝血因子?/结合蛋白 的研究;研究凝血因子/结合蛋白常用的实验手段,包括离子交换层析、荧 光、聚丙烯酰胺凝胶电泳和表面等离子体技术。 ,运用电泳和 第二章:用阴阳离子交换层析方法从蛇毒中分离纯化出 和结合反应以及钙离子对 和?结合反应的影 技术检测 响,钙离子可以诱导 和的结合,而且不同浓度的的钙离子对 和结合影响不同。通过动力学分析发现当钙离子浓度为.时, 二者亲和力最强,在高于.时会抑制 和的结合。说明了钙离子 在 和?结合中起开关的作用。同时也说明了 和?的结合在 的抗凝血活性中起主要作用。 第三章:概述了纳米粒子的基本性质、纳米金属氧化物的毒性及用表面包裹 降低毒性的研究、磁性纳米粒子的毒性研究、引起的氧化应激反应和体内微 量元素失衡、在体外细胞实验中的毒性机理、毒物的联合作用和毒性检测指 标。 第四章:研究了和纳米联合暴露对小鼠短期毒性的协同作用。 发现同时注射?组的脏器系数、血液检测中、、、 、肝脏的酶活力都低于组,而血检中的、~以及肝脏中 的、值高于组。在肝脏和肾脏中注射纳米组的 镉含量显著低于组。组织切片显示,注射趾.对小鼠各器官没有明 显毒性,注射组肝组织坏死严重,但是在组中没有发现坏死。 实验结果显示短期毒性主要表现在对小鼠的肝脏和肾脏损伤,对其它组织器 官影响较小。多种酶活性和生物代谢物分析以及病理切片分析结果显示,纳 米 可以抑制对小鼠肝脏和肾脏的损伤。因此纳米可以作为中 毒患者理想的磁共振成像造影剂。摘要 凝血因子 皖南尖吻蝮蛇毒 抑 关键词:抗凝血蛋白 纳米 制效应 廿 ’砸.嘶丘舶 . ?/ /行 胁 铲 酊【 ../. , ? 仃 扩 虢. ? .池 ,. ,’, .、’, , 融 . , 印. 仃 ,? , /, . , .伊, . 的印: 谢矗 】.曲 矿 】 ? 黟. . ? 曲 锄 仃 . 一十., 一十一印 一?.一 曲. 缸觚 . . ? 】 加,如.? 印:: ,,, 仃仃 ., ,. . . 时铆 : 唱,【工,, . , , , 鲥 , ,讪 ,~ 吼 肌【 . 鲥觚 曲孕’. 百 .孕.锄侬鹏胂 咄, ;., 嘶 .肌 .虢 . ,, 堵.砌 .,.. ,, : , 仃 么胁抛如刀口“觚,?,, ?目录 目录 第章 绪论??. .血液凝固过程.. .蛇毒中的凝血因子?结合蛋白?. .. .型凝集素类似蛋白? ..凝血因子?的研究进展 .. 凝血因子/结合蛋白 .研究中采用的技术方法.. 离子交换色谱层析柱?.. .. 电泳. .. 荧光分光光度法.. ..表面等离子体共振技术一 参考文献??。?. 第章 与凝血因子结合作用研究. . 引言. .实验部分?. ..仪器和材料..纯化抗凝血因子??.. .. .电泳检测钙离子对 与结合的影响 .. 检测 和?结合? ..钙离子对?荧光的影响??一 .结果与讨论. ..的纯化?. .. 电泳验证 的分子量和纯度.. ?电泳检测钙离子对 与结合的影响 .. 分析 与?的结合 .. 钙离子对?荧光的影响.讨论.目录 参考文献.. 第章纳米材料和镉毒性研究??.. .纳米材料综述??. ..纳米材料毒性研究..磁性纳米材料? .生物体内的稳态. ..生物体内的?. .. 元素代谢.重金属镉的毒理研究??. ..镉的体内体外研究情况 .. 对生物体内微量元素平衡的影响? .毒理学研究方法?. .. 联合作用 ..毒性的检测指标 参考文献.. 第章 纳米对毒性的抑制效应研究? . 引言. . 实验部分?. ..仪器材料和动物实验? ..纳米给药前处理及测定.. .. 小鼠体重变化和脏系数 ..血清检测肝脏和肾功能 .. 和含量分析??. ..病理切片观察? ..肝脏和肾脏中酶活性检测.. 数据处理 . 结果与讨论. .. 结果 .. 结果??一 .. 小鼠体重变化和脏系数 ..血清检测肝脏和肾功能目录 .. 和含量分析??. ..病理切片观察? ..肝脏和肾脏中酶活性检测..讨论与小结参考文献一 致谢?.. 硕士阶段发表的文章?..第章绪论 第章 绪论 .血液凝固过程 血管受损会触发血凝系统的启动,最终阻止血液流失。目前许多疾病都直接 或间接的与凝血系统有关,如血栓,血友病,外伤时失血过多等等,因 此研究和理解凝血系统对于研发新的药物以及治疗各种血液疾病有着重大 意义。 在凝血过程中,多种物质参与其中,有,和磷脂,还有一系列蛋白质, 具体包括:、凝血因子,又叫纤维蛋白原,在凝血酶的作用下转 化为纤维蛋白.,由【、、丫三条不同的多肽链组成,。、凝血酶原,可 以裂解为凝血酶。、组织因子,与形成的.复合物激活凝血 由三个结构域按.....组成, 因子?和。、凝血因子, 经.凝血酶裂解后活化,它由连接的一条重链.和轻链.., 能够与结合激活凝血酶原。、凝血因子,一种有多个结构 ,, 域的血浆糖蛋白,包含端.结构域和结构域和端的丝氨酸蛋白 酶结构域】,其中结构域在作用下与形成的复合物参与凝血过 程。、凝血因子,其三个结构域按.....排列,蛋白 水解后脱去结构形成的异质二聚体与抗原岍形成复合物,当血管损伤, 该二聚体进一步水解得到并从释放,与活化的血小板结合,。 、凝血因子?,活化的在磷脂和作用下可以激活。、凝血因 子、、和也参与到凝血过程中.。 凝血过程中,由于凝血因子的来源不同可分为:外源性凝血途径 ,内源性凝血途径 廿和共同凝血途径删 ,。如图.所示。外源性凝血途径:血液外面物质如组织因子 ,参与凝血,这些物质主要参与凝血的起始阶段】,用凝血酶原时间测定 外源性凝血途径。内源性凝血途径中凝血因子来自血液,包括凝血因子,? 和。从图.中可以看到参与了整个凝血途径:.复合物的 形成、凝血因子?、?、的活化、凝血酶形成都需要参与等。由此 可见在凝血系统中的重要性。 .蛇毒中的凝血因子 结合蛋白 .. 一型凝集素类似蛋白第章绪论 我们实验室从蛇毒中分离纯化和研究的蛋白主要是磷酸二酯酶和.型 凝集素类似蛋白】。与其他凝集素不同的是型凝集素是依赖,其 一般有到个氨 糖识别结构域 基酸残基组成,】。在已知的所有.型凝集素中都有一个常见的折叠方式: 一半的氨基酸残基由个和组成,另一半由含有和糖识别的结构 组成.。 碡毒辱耐女州孵 基鑫 囊 砧沁彳 囊糟瞒棚釉抽醴鳟 双 ?懒 毒穆瀚 图.凝血途径, 蛇毒中纯化出的.型凝集素类似蛋白,虽然有和型凝集素类 似的?结构域, 亚基的氨基酸序列与.型凝集素序列相似达 .%,但是没有凝集素活性,】。然而在自然界中分布及其广泛, 从海绵动物到人体都含有这些蛋白,。目前蛇毒中的研究是非哺乳 动物类研究最为广泛的一类。蛇毒中的可以分为三类:、调节止血功能 的蛋白;、磷酸二酯酶抑制剂;、糖结合的蛋白。其中第一类在蛇毒中发现的 最多,约有个蛋白】。他们的基本结构都由两条链组成:和链,分子 量都在?左右,和链通过二硫键连接.】。但是这些蛋白的功能却大 不相同。可以激活凝血酶原,。矛头蝮蛇龇 中?蜘 和皖 可以抑制.凝血酶活性。从黄绿烙铁头蛇 南尖吻蝮蛇中提取出抗凝血活性的凝血因子和结合蛋白.。 和可以增强血小板聚集活性.,而却可以抑制?师与 结合而抑制血小板聚集『 ,。 ..凝血因子 的研究进展 凝血因子??的缺失或变异会导致血友病的发生,目前导致改变 的可能机理和治疗血友病的法案正被不断地深入研究当中。?是维生素依赖 第章绪论 的蛋白,经基因转录和翻译得到的由个氨基酸残基组成的单链分子,含 糖量%,,,其端的.位氨基酸残基组成较为保守的.羧基谷氨 酸结构域 ,第到位为疏水性折叠区,第至位是 个上皮因子生长结构域 ,由第.位的残基组成, 由第.位残基组成, 和通过第.位残基相连和位于 端的丝氨酸蛋白酶结构域组成.。在凝血过程中通过和与结 合使得?被激活,而活化的?通过结构域,可以和与血小板表面 的特异性结合从而激活.。 在它的结构域中有个和亲和性不同的结合位点.。钙离子的 结合会改变结构域的构象【,,见图.,脱去金属离子.?的 结构域端和端有无规则的连结,在结合金属离子如矿,端和 端较为紧密到构象,但是端还是没有规则的,当结合矛后到 构象,端与二硫键的靠近,暴露出疏水性的表面残基.,从而可 以和膜磷脂结合,增强了?的生物活性。 另一方面由于凝血因子?纯品价格非常昂贵,随着?理论的深入研究, 分离和纯化凝血因子?的技术方法也不断更新。早期的多步层析分离?,但 是产率低,凝血因子的活性丧失严重,后来通过单克隆抗体制备?极好的改 善 了多步层析出现的问,而且还有多种方法如用金属螯合色谱纯化?的技术 ,.。我们实验室的沈登科同学运用低成本的/结合蛋白作为亲和配基 从血浆中分离出高纯度的。 习。曰 弼毽添 图. ?结构域的构象转变【】 ..凝血因子 /结合蛋白 凝血因子?,结合蛋白/.不具有酶活性,具有抗凝血活性。自 上世纪年代以来,及?和结合蛋白和被陆续从 第章绪论 蛇毒中分离纯化出来,如表.所示。 晶体结构研究表明大多数的?都是由同源性很高约达%的 ?左右。它们能 个亚基组成,亚基之间通过个二硫键连接,分子量都在 够在存在时识别?或的结构域,并与之结合。当然这种结合也并 不绝对都是依赖的,等人的研究指出在矿、和存在下 删 ?.可以与?的结合,但是和不能让二者结合。 表.蛇毒中的凝血因子/? .研究中采用的技术方法 .. 离子交换色谱层析柱 我们实验室在分离时主要用的是葡聚糖凝胶的阴离子和阳离子交换剂。阴离 子交换剂带正电荷可以结合带负电的蛋白质,而阳离子交换剂侧链带负电荷可以 结合带正电的蛋白质。而蛋白的等电点不同,在同一缓冲液中,有的蛋白带 正电,有的带负电,并且所带的电荷量不同,因此和离子交换剂的结合力也不同, 通过加入不同浓度的氯化钠溶液进行梯度洗脱,可以将蛋白各组分分离出来,这 种离子色谱层析方法简单,操作简单成本低,在本文中我们使用此方法从皖南尖 吻蝮蛇毒中分离纯化出抗凝血蛋白,得到的产品纯度高。 .. 电泳 第章绪论 变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳.是在制备分离胶和浓缩胶过程中 都加入变性剂,当然也可以加入其它变性剂如巯基乙醇,等。可 以和蛋白形成复合物,该复合物带大量的负电荷,这样就消除了蛋白质由于等电 点不同带来的影响,所以电泳时蛋白质的迁移速率由分子量大小决定,忽略电荷 因素。非变性的凝胶电泳撕.是在制胶和电泳过程中都不加入变性剂, 保持蛋白质的天然结构和活性,与电荷多少与迁移率密切相关,无论是酸性蛋白 还是碱性蛋白大多数都可以调节凝胶的运用非变性电泳分离。我们采用的是 .的电泳分离蛋白。 ..荧光分光光度法 蛋白中的色氨酸哪,络氨酸研和苯丙氨酸残基都可以发射出荧光。 但是一般检测蛋白的荧光主要是来自研残基,而残基在多数实验条件下很 难被激发,”干扰较大。若研残基所处的微环境改变蛋白质分子极性变化, 与猝灭剂氨基或羧基远近等,荧光的强度、波长相应改变,可以检测蛋白与 、有机小分子、金属离子等的相互作用和蛋白质的构象】。在实际检测中 可以通过吸收光谱变化和荧光寿命来确定荧光淬灭类型,因为静态淬灭涉及基态 分子与淬灭剂作用,所以吸收光谱会发生变化,而动态淬灭涉及的是激发态分子, 其分子吸收峰不变,但是荧光寿命会缩短。 ..表面等离子体共振技术 将表面等离子共振原理运用于生物检测中,是将电介质换为待测样品,如果 样品的生化性质发生变化,会导致电介质折射率的变化,产生出不同的信号。如 图.所示。传感器响应周期分为结合、解离 和再生。当时缓冲液通过微量通道到达流通池与受体分子 接触。阶段:当,分析物与受体分子结合,芯片表面基质折 射率增加,值上升。对这阶段曲线进行拟合分析后可以得到表观结合速率 。,结合配体分子浓度可以得到结合速率常数。撕阶段: 时配体分子被缓冲液带走,配体受体复合物解离,基质折射率降低,值下降。 同样的在拟合分析后可以得到?和硒。阶段:,注入再 生液一般是高盐,酸或碱性溶液,进一步破坏配体.受体复合物,彻底洗去配 体,从而使芯片再生。 第章绪论 协 ? 图. 传感器原理和检测图解 传感器系列中的敏感元件是指金属薄膜及其表面修饰的敏感物 质,用于将待测样品的生化变化转化为折射率变化,是传感器的关键。如 果不对金属薄膜表面修饰,那么只能检测一些浓度随折射率变化的体系如乙 醇、 蔗糖溶液。根据结合作用力的不同,修饰的敏感元件即芯片可分为共价耦合、 高 亲和力、疏水等芯片。研究生物分子相互作用时芯片的金膜上都连有烷基硫 醇或 巯基硫醇。如芯片其链短适合细胞和病毒颗粒研究,芯片适用于耦联 羧基、氨基、巯基分子,但是羧酸化程度只有芯片的%左右。芯 片提供亲水环境,可以低浓度耦联,适用于蛋白质、脂类、碳水化合物、小分 子 药物、全细胞的研究。的仪器设备虽然昂贵,但芯片可以自己制备,并 . 可以长期保存使用,我们分析中使用芯片。 第章绪论 参考文献 :盯 ’ ’?. 【】 ,. ? ..::.. 队. 】 .;:.. . 髓 【】 由 ,衔,舢 , 拙 懿 巧? . ;:. 曲 . ,灿,柚 ,孤,赋锄 百 、? ??‘蠲.咖?;:. ’ .缸怕 锄, , , ? 西伍 嬲. ?;:. 】 , 加..;:?. ,舀 . .: 饥 】 , ’蹦 豳饥 胁血. .::. 孤,弛 , ,黜 , . 血.锄咄;:. .证】 , , ? 撕 锄硒 也.甜 加【锄?略盯醪 :: . , , 碱 , , , , . .?.. 即曲 锄 ::. . 妇‰ 】 , ,? , ’ 抽 ’ 觚 妇如舶 啪锄 . 锄缸.;:?. ,:即 , 部 血 孤 如 .?曲 肌 舒.;:. . 咖鹏 , ,?,血, 【】肌, , 觚 ..;:?.? , ,?第章绪论 。 佻 ..::?. 巧?,” ,. 仆 仃酉 ?. ?. .;: . % : 、,.锄. : :?. ., ,黜 , ,踟 , , 咖 . 舯 加舐. ? : : ?. . : 【 】 ,锄砌, , ,’, . 酉 柏.. . : . . ,“ .;:.. 锄 , , :锄 . .;:. . 衄 【撕 田 ? 渤?. 西 ?. .;: , , . 丽 【 ,觚, , . :曲 ?. .. ;: 】饥,. ,办 , ,? .印. 胡’ 觚 球仃 ;:..帅 , , 疆’ . . ? 啪锄仃. ;:. . 锄 .一印 乜 ;:. . 缸】 , , ,, 丘? 印 . 缈;:. 第章绪论 . . 锄. 【】 ;:. .仇 【】‰觚 , , , ,岫饥?, ,?矗. ?呻 灿 ,伊 弘;:?.【】?娼,血王 .嗽距 煳嘶 :. 蚰 . 西 锄奶 ; “ ., 【】 ,】 ,锄 ?.黜 .? 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沁. 卜. 哪印 西 ? ::一. ., , 】 , , ,晡、, ?.珂 : ?. 仃. ; . 】? ,嘣 ,嘣 , 血 ?.. 以印 :仃 ::一. . , , 】 ?, ?呵 己 凡屺.缸 ;:. . 砌 ,喇玎 】 ,昭 ?..呵 琳 .?了吸玎. ’,【?气 , , 门订 ? ..? . ;: 舀 缸. . ,.【. . 锄 够? 访 . 锄. : :. .第章绪论 . 缸 ?, 撕 饥 咖舶 船溉锄略 ::?. .鲥】 , ? , ,锄 , . 仆,【, 锄 丘. 臼 ..;:. . 腩, 【】 , 啪 . ..;:. .抽 撕锄 , ,舶 锄廿 .锄咄;:?., , , , ?.玳 ?、丁 .?. . 锄.;:. 仃 , , ,?‰甜..;:. 】 , , .,锄 ?, .朗肌 ? 矗? . 伊, 百 【仃 .;. , ,呔 , .鲥, 【】孤 , ,、张, 臼 孤 奴 ..:: . ., ’ , 印 嵋. ?. 啪锄时 黟;: .’锄唱, ? , ? . 】【.::一.第章 与凝血因子?结合作用研究 与凝血因子 第章 结合作用研究 . 引言 凝血因子和?结合的.型凝集素蛋白/分别从江浙蝮 都具有很 蛇,皖南尖吻蝮蛇,黄绿烙铁头蛇等蛇毒中提取出来,?/ 高的同源性和抗凝血活性,这些蛋白在钙离子调节下与?或者的结 构域结合,进而阻断凝血过程.】。 路阳等人首次从皖南尖吻蝮蛇毒中分离出抗凝血因子,简称,是一 种潜在的抗凝药物,也是研究凝血级联机理的有利“工具”。徐小龙等人在此 基 础上改进并分离纯化出新的抗凝血蛋白,简称 ,研究表明 是凝 和 的分子量非常接近,约为?,都 血因子/,结合蛋白。 是有两条非常相似的肽链组成,此外二者的含糖量也接近约.%。已经知道 是不是也是凝血因子/结 是凝血因子/结合的蛋白,那么 合蛋白呢 在体外具有明显的抗凝血活性】,是凝血因子结合蛋白,有资料 显示同源性的湫有相同的结构,就有这种典型的结构 。随后我们实验室的沈登科通过检测的体内抗凝血活性实验,发现 对部分凝血活酶时间,凝血酶原时间有显著的延长作用,并且是 剂量依赖的,而对凝血酶时间没有显著作用。我们知道是内、外凝血途 径中重要的凝血因子,?是内凝血途径的因子,的延长显示内凝血途径 及共同凝血途径受到抑制,的延长说明外源性凝血途径受抑制。因此从结果 显示 不仅是凝血因子结合蛋白也是凝血因子?结合蛋白。 不同金属离子对,,与/结合研究越来越深入,如对不同的碱土 金属离子对和、结合的影响,钙离子和锌离子对,『. 与?结合有何影响呢 的研究】。但是不同的金属离子对 , 通过.电泳、等离子体 在本章我们主要介绍分离纯化 和?结合以及荧光分析钙离子对 表面共振研究钙离子诱导的 的影响。这些工作有助于我们对凝血系统有更深的理解和认识。 .实验部分 ..仪器和材料 第章 与凝血因子?结合作用研究 实验仪器 真空冷冻干燥机 .;【 .冷冻离心机上海安 科公司;阴阳离子层析柱上海锦华厂; .型自动部分收集器上海沪西 电子厂;梯度混合器上海西巴斯生物技术开发公司;超声波清 洗器昆山仪器公司.型电泳仪上海康达电子仪器厂。 瑞 士生产,日本岛津心.荧光分光光度计。 实验材料 .和 皖南尖吻蝮蛇毒粗毒干粉来自江西彩虹养蛇厂;.印 . .购自撇公司;十二烷基硫酸钠、丙烯酰胺和 甲叉双丙烯酰胺购自皿公司;.巯基乙醇和考马斯亮蓝购自公司;三羟 甲基氨基甲烷%购自阿拉丁试剂公司北京;标准蛋白破购自合肥生工医 药公司;所有试剂均为分析纯。 ..纯化抗凝血因子 .阴离子交换层析 第一步.印 .离子交换色谱柱的处理:取实验室制备好的 ?印 .印.胶,倒出上层乙醇溶液,水洗三次。加入 ,煮 .缓冲液水浴加 ,水洗直至胶面膨胀至原来的体积。再倒入. .,反复.次。最后将平衡好的胶装入玻璃 热,使胶平衡到 层析柱中。用。 . .缓冲液平衡小时,流速为/. .的. .的缓冲液中,搅拌, 称取粗蛇毒干粉,溶于 .层析柱上,用. .缓冲液加 待溶解后,加于.印 梯度洗脱。第一步,用 的. 含.. .缓冲液梯度 洗脱;第二步,用 含... 的. .缓冲液洗脱;第三步, 用含. 的. .缓冲液洗脱。流速控制在/。用 紫外检测,收集具有抗凝血活性的蛋白组分峰。 .阳离子交换层析 第二步.印 .阳离子交换树脂胶的处理方法与.胶处理方法类 .印 。的.的.。用 含.. 的. 似,但是用的是 .缓冲液洗脱后,在用的. 的. .缓冲液洗脱。流速控制为/。通过电泳验证后, 将纯的 样品冻干后.?保存。 抗凝血活性测定??血浆凝血酶原时间 .生理盐水、.兔血浆、.蛋白组分和.兔脑凝血活酶 溶液/混合后,?温水浴,再加入. .,测定凝固 第章 与凝血因子?结合作用研究 时间。 电泳检测分子量和纯度 聚丙烯酰胺浓度:分离胶中%,浓缩胶%;电极缓冲液配制:?缓 一。 ,】/ 冲液/ ,.,考马斯亮蓝也染色,电压 其中做.电泳时不要加。 .. ?电泳检测钙离子对 与结合的影响 将纯化的 在. .含 的缓冲液中放置 。 ,离心脱去得. . . .的 .的%分离胶,含有.的氯化钙, . %浓缩胶,含有.的氯化钙。 .电极缓冲液中含有. 氯化钙。加样缓冲液中含有.的钙离子,%的甘油,.%溴酚蓝,州 . .。 .. 检测 和 结合 用 仪器,室温操作。芯片表面的预处理按照公司给的 标准进行的【,将.?溶于固定液州溶于醋酸钠溶液中, .然后进入流通池固定到芯片上,“/的耦联流速。待耦联结 束后,芯片上肯能有未耦联的活性基团,如果不除去会影响实验结果,因此用 “/含?廿锄/“ 的缓冲液封闭。耦联结束后,将不同浓度的印. .?,. . .缓冲液依次进样/,进样体积,延迟清洗, 用的和 为再生液“/,共。所得数据用 “ .软件处理得到动力学常数:和【行用肌“模式拟合, 进而得到结合和解离常数和。 ..钙离子对 荧光的影响 激发波长,记录到的发射谱图,激发和发射的狭缝宽度 都为.,所得数据为次均值。 .结果与讨论 第章 与凝血因子?结合作用研究 .. 的纯化 粗毒经一柱层析后,得到个蛋白峰,如图.所示。经检测,空 白组加入钙离子凝固,而、号峰加钙离子中内都不凝固,具有抗 凝活性。通过电泳对、、、峰分子量分析,样品 主要在号峰中。 ????口.?《 图. 印 .分离皖南尖吻蝮蛇毒的层析图谱 将具有抗凝血活性的号峰收集,浓缩脱盐后用.层析柱进一步分离。 其分离图谱见图.。分离后得到个峰,通过.电泳检测,号峰 就是我们所要的样品 ,号峰是 。 一?一。仍?《 图. ?印 .分离层析谱图 .. 电泳验证 的分子量和纯度 第章 与凝血因子结合作用研究 等人指出在加入可以断开链间二硫键的.巯基乙醇后,其 电泳显 示仍为一条单链,分子量在约为?】。本次实验中,通过聚丙烯酰胺 凝胶电泳,如图.显示,分离的 纯度很高,分子量为.。虽然 和 分子量非常接近,都在?,但是二者的等电点不同, 的等电点为., 的等电点是.,电泳中分离胶.,在此条件下 , 和 所带的负电荷量不同,迁移速率也不同, 速率大于 所以直接通过.电泳就可以分辨二者。图. 为 的 . 图. 的?和电泳 注: 图中道为标准蛋白,到是 .. 与结合的影响 ?电泳检测钙离子对一羲簿“臻臻黧荔鬻爹灞?缵黪 孥擘 瓣纛 图. .分析对印.与结合的影响 .电泳检测 和在.的存在时,如图. 所示. 和印按:摩尔比例混合,在电泳上只显示一个条带第 道,对应的 条带消失,表示印。一 和?在.钙离 按:比例混合,在.钙 子作用下形成复合物。当印.和印 第章 与凝血因子结合作用研究 离子作用下,出现印。一 和复合物条带条带。这些结果表示印。一 和?在.?钙离子下形成:的复合物。如图.所示,在没有钙 和.?按:摩尔比例混合,在电泳上显示条带 离子条件下,印。一 和 第道,分别对应印。一 和印,没有形成复合物,因此 的结合是钙离子依赖的。 .. 分析 与 的结合 用检测钙离子诱导的 和结合,将印.通过共价键耦联 到芯片。图. 在有.钙离子和没有钙离子 为肛的印. 条件下的结合和解离曲线。如图示,二者在钙离子存在时可以结合,但是没有 钙 离子时没有明显的结合信号。图. 在.钙离子存在时,不同浓度的 . .“与结合,经过: 模式拟合后得到动力学常 数。、小和幻,依次为.士.× .一,.士.×刁~,.士.× 。 .士.ב。。低的值揭示 和在.钙离子存在时 高亲和性。 为了进一步研究钙离子浓度对二者结合的影响,我们又做了不同浓度钙离子 下的动力学实验。如图.所示为. 和印.的结合解离曲线, . 浓度为“,钙离子浓度从至变化。在低浓度的钙离子条件 下.值随着离子浓度的增大而增大,在大于.钙离子时, 值随着离子浓度的升高而降低。因此在大于.钙离子时会抑制二者的 结合,在.显示最大的结合信号,如图. 所示。 ..钙离子对 荧光的影响 如图.显示.的最大发射波长在,加入.的钙离子 后,荧光强度降低%,但是最大发射波长没有位移。说明钙离子结合影响了色 氨酸残基唧的微环境,虽然没有影响色氨酸残基耶周围的疏水环境,但是一 些猝灭剂如氨基和羧基可能相对靠近残基。图.钙离子诱导的. 荧光猝灭是时间依赖的,可能原因是钙离子会诱导.发生缓慢的构象转 变。猝灭速率常数为.士.,这正好对应于钙离子诱导的构象转变。 第章 与凝血因子?结合作用研究 一叱一???叱 一叱一价??叱 图. 动力学分析钙离子诱导的. 和?结合 一叱一????叱