PCR-ELISA DIG检测系统生产辣根过氧化物酶共轭的抗地高 辛抗体.doc

PCR-ELISA DIG系统生产辣根过氧化物酶共轭的抗地高 辛抗体.doc PCR-ELISA DIG检测系统生产辣根过氧化物酶共轭的抗地高 辛抗体 Pooria Gill, Mehdi Forouzandeh, Fatemeh Rahbarizadeh,Reihaneh Ramezani, and Mohammad Javad Rasaee 伊朗德黑兰Tarbiat Modarres医药生物科技大学 摘 要 有几种用来观察最终产品的聚合酶链式反应。ELISA-based检测系统(PCRELISA)是其中的一种方法。它是非常敏感的,可以由一个比色法来测量定量PCR产物。根据这种方法, 从基因组复制的DNA片段和用注册的digoxigenin -11-dUTP进行PCR扩增。用碱使微量滴定板中的样品变性并用生物素标记的核酸探针转到链霉亲和素涂层板上。使用所产生的结合辣根过氧化物酶抗地高辛抗体和底物和 2,20-azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonate(ABTS)探测到突变的DNA。这种系统中的一个核心做法是抗体是结合辣根过氧化物酶的抗地高辛抗体。这里描述的是准备,纯化,标记用在PCR-ELISA检测系统中的结合辣根过氧化物酶的抗地高辛抗体。几个生化协议和修改用于增加产品结合的敏感性和特异性及完善性。 关键词:牛血清蛋白地高辛结合物,结合辣根过氧化物酶的抗地高辛抗体 引言 聚合酶链式反应(PCR)是一种最常用的分子生物技术 ，它是用来扩增核酸的。Tarbiat Modarres,伊朗德黑兰大学Mehdi Forouzandeh生物医药科技部的通信地址:E-mail:foroz@modares.ac.irsequences.[1] 针对不同不敏感性的PCR产品检测程序有所不同。使用一个比色板ELISA-based检测系统开发的提供高敏感性及定量检测PCR产物PCR-ELISA在一个microtiter allele-specific杂交格式增的进行PCR扩组合。[2,3] 通过这种方法检测个别微生物和基因突变的等位基因是有可能的。[4–6] 但是有几个报告显示这种方法很昂贵[4,5] 为克服这一难, 我们打算在我们实验室生产主要组成部分，以使测试成本降到一个日常使用的合理数目.在本研究中, 我们准备的精确的表征PCR-ELISADIG检测组件最关键的部分，即与辣根过氧化物酶结合的抗地高辛抗体。 实验 挑选Digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-1-aminocaproic 结合N-Hydroxysuccinamide 酯酸的牛血清白蛋白为载体蛋白质,为免疫原和digoxigenin-BSA结合做准备。[7]上海的摩尔反应混合物,digoxigenin-3-O-methylcarbonyl -1-aminocaproic酸酯是 N-hydroxysuccinamide 1:70。4.62毫克上海粉(σ)溶解在15毫升的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),pH值为8.5,冷却,在一个冰浴在30分钟内平和搅拌。3.27 mg digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-1-aminocaproic acid N-hydroxysuccinamide酯 (Roche) 溶解在 8.18 mL 二甲亚砜(DMSO, Sigma) 在暗室搅拌孵育30分钟 ，在牛血清蛋白中逐滴加入反应混合物搅拌冰浴 4 h。为消除未反应的digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-1-aminocaproic acid N-hydroxysuccinamide ester 和溶剂， dialyzed against用 PBS (pH 7.0–7.2)缓冲溶液在48C搅拌透析digoxigenin-BSA 共轭溶液 24 h 。200 mL 这种共轭液 混入800 mL of 冰硫酸，据记录其吸光波谱波长范围为340 nm 到 450 nm.[8] 可测最终Tdigoxigenin-BSA 共轭的浓度。[9] 用非特异性酶联免疫吸附定性检测试验准备好的牛血清蛋白共轭的地高辛。 用5毫克/ 100毫升,10毫克/ 100毫升牛血清蛋白共轭的地高辛覆盖微量滴定板(其中PBS的pH值为7.0 ~ -7.2,37?过夜) 生产辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体 用5% 脱脂奶封闭(在PBS缓冲液中, pH 7.0–7.2, 37? 1 h ).[10]用5毫克/ 100毫升,10毫克/100毫升牛血清蛋白包微量滴定版同时阻遏非特异性结合。在通用共轭缓冲液(罗氏)中准备两种抗地高辛抗体稀释液(1:1,500和1:3,000)，取100毫升添加稀释。用pH 7–7.2磷酸盐缓冲液冲洗5次。 在00 mL/well ABTS 基质液(Roche) 37?热 30 min 用对频道ELISA 检测器(Tecan)在405 nm处检测。[4,5,10] 免疫原剂量及注射后测定时间 150毫克/毫升的免疫原(地高辛BSA物)结合完全弗氏佐剂等体积和注入intradermaly成1公斤重的的男性德意志兔。助推器预防接种首次给药90天之间，每隔2个星期，不完整的弗氏佐剂，然后，每隔20天90天期间，肌注,1 / 2初始剂量的免疫原。抗血清初次次免疫后5天开始，每抗原注射后继续5-6天。 [11] 44?离心分离血样，收集血清在-70?贮存[11] 兔子全部血清中抗地高辛抗体的滴定 用ELISA进行滴定化验。为此，准备16个微量滴定盘，用0.5 mg/100 mL 牛血清蛋白地高辛结合物包盘(PBS中, pH 7.0–7.2, 378C过夜)， 并用 5% 脱脂奶在 PBS, pH 7.0–7.2, 37?封闭1 h。另外16个微量滴定盘也用0.5 mg/100 mL牛血清蛋白包盘作为非特异对照。在缓冲器(Roche)上准备连续稀释兔子血清，每支加入等量的100mL，每支用磷酸盐缓冲液 (pH 7.0–7.2)洗去 5 次， 加入抗兔结合HRP抗体(Roche)的鼠抗(1:2000)各100mL，37?孵育30 min。 培育最后洗去，每支加入100mL底物(ABTS)37?孵育30 min。405 nm处检测光色.[4,5,10] 提纯抗地高辛抗体 采取免疫动物的血液，收集在洁净干燥的玻璃瓶中，4?过夜至血液完全凝固。用玻璃棒缠绕凝块分开，利用离心机可以直接分离血清。准备好全部血清，在样品中加入等体积的饱和硫酸铵溶液(pH 8)，在电磁搅拌器上逐滴缓慢搅拌[12]。加入硫酸铵后，将混合物置于 4?1h以上，让免疫球蛋白完全沉淀。离心机10000g离心30 min。 PBS中溶解沉淀物至大约是原来抗血清一般的体积，4?在 PBS 中透析2 天。通过生物素亲和素牛血清蛋白结合物的柱进行更深度的提纯，防止生物素亲和素牛血清蛋白的非特异结合。将收集的血清用A蛋白进行亲和层析进一步提纯。[13]洗涤A蛋白中的血清，在PBS透析4?过夜。 兔源抗地高辛抗体辣根过氧化物酶结合物制备 精制的抗地高辛抗体结合在辣根过氧化物酶上。[14] 7.5 mL 抗地高辛抗体溶液 (0.5 mg/mL, Bradford 化验测量)在1 L0.1 Mcarbonate 缓冲液, pH 9.2, 4?缓慢搅透析过夜。 6.6 mg 辣根过氧化物酶(Sigma)溶于500 mL 0.1 Mcarbonate 缓冲液, pH 9.2。逐滴加入加入 500 mL 新鲜饱和的高碘酸钠缓冲液 (1.71 mg/mL)，缓慢搅拌，紧密包裹，室温黑暗环境孵育2 h。将透析的抗体溶液在4h逐滴加入准备好的酶溶液中,在黑暗环境中轻柔 2 搅拌。用玻璃管将8 mL 抗体酶混合液加入20 cm × 3?容量的容器中，用保鲜膜封上。然后, 加入2 g G-25葡聚糖凝胶，室温 ，黑暗环境中孵育3 h。 0.1 M 碳酸盐缓冲液清洗柱直至干净。 按照1:20 量在洗提液中加入新配制的 NaBH4 (5 mg/mL in 0.1 mM NaOH)， 30 min 后加入另一份(1:10) NaBH4 溶液4?孵育 1 h 。加入等体积的饱和硫酸铵溶液 (pH 8) 4?轻柔振动30 min。[12] 离心混合物 15 min (10000g ，4?) ，弃掉上清液。 2.5 mL of TEN 缓冲液 (Tris/EDTA/NaCl buffer, pH 7.2)提取 ，3 L TEN 缓冲液 4?透析 24 h 。24 h后, TEN solution 306 P. Gill et al. 变换后继续透析 4 h。然后加入20 mg/mLBSA和20%甘油4?保存。[14] 抗地高辛辣根过氧化物结合物鉴定 准备 ELISA,用于辅助化验。[10]简单说，不同牛血清蛋白地高辛结合物包盘于微量滴定盘上，用5% 脱脂奶封闭。大量牛血清蛋白和脱脂奶用于包被和封闭，防止非特异性结合。连续稀释的 anti-digoxigenin-HRP (准备好的结合物and Roche Co. 结合物)各加入100 mL缓冲液， 用磷酸盐缓冲液冲5次。 100 mL/well ABTS 底物37?溶解30 min ，405 nm处测量。 测量抗地高辛辣根过氧化物酶的平均亲和力 竞争性的ELISA 用于测量两种抗地高辛辣根过氧化物酶结合物。[15,16] 不同类型的地高辛自由基(0, 0.1, 1, 10, 100, 1,000 ng/well) 需要加入不同的抗地高辛抗体和不同的地高辛牛血清蛋白用以包被。 37?1 h 后,后续步骤按之前拟定好的进行。 细菌菌株 结核分枝杆菌 H37Rv (RIVM) 在Lo?wenstein-ensen 介质37?培养21天。 DNA提取 煮沸方法提取结核杆菌 DNA [17]一个菌落细菌加入 150 mL Tris-EDTA 稀释液 (10 mM Tris-base, 1 mM EDTA, pH 8) 尽力混匀, 95 ?水浴15 min; 10000g 离心菌落产物10 min。 上层悬浮物即分离的 DNA, 用作PCR。 寡核苷酸 下面合成的低聚物 (M. W. G. Biotech GmbH,Germany)用于扩增，标记和TUF200 bp比色:[18] TUF15 (50CCTGGTGGTCGATGGGCGA 30) TUF18 (50CCTCTGTCGAGGAACTGATGA 30) 50biotin-modified TUF26 (50ACGAGGAAGTTGAGATCG 30) 地高辛标记PCR 每个反应加入 3 mL 菌落产物 DNA.。反应液有 25 mM TUF15 和TUF18 引物, 1.25 U Taq DNA 聚合酶(Roche), 1X 反应液 (Roche), 1.5 mM MgCl2, 2 mM dATP, dCTP, dGTP, 1.9 mM dTTP 和0.1 mM DIG-dUTP (Roche)。循环如下:1 5 min 95?,94?30 s 30个循环周期，30 s 66?, 72?,1 min一个循环周期10 min 72?的Eppendorf主梯度PCR仪。[19] ELISA检测地高辛 PCR-ELISA 根据Roche 应用科学进行检测试验 。运用制备好的anti-digoxigenin-HRP并和的Roche anti-digoxigenin-HRP (作为标准对照)相比较。 加入2.5 mL DIG标记的 PCR 产物于 10 mL 变性溶液(Roche)，混合物在室温孵育 10 min.。112.5 mL 杂化液 (Roche), 包含 5mM生物素修正液 TUF26 探针, 混合了变性的 DIG标记的PCR产物，100 mL 混合液直接转至微量滴定盘( Roche)。为加强探针和DNA的结合 ，53 ?i hybridyzer oven (Techne)孵育75 min, 轻轻振动。非特异的结合物可以用蒸馏水代替包含探针在内的变性的PCR产物检测出来。每支用冲洗液洗涤5次。把100mL不同的anti-digoxigenin HRP(1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,000 and1 : 2,000) 个加入其中，37 ?30 min. 每支试管用洗涤液冲洗5次，然后，加入 100 mL ABTS底物 (Roche) ，保证精准一致。[19,20] 结果与讨论 地高辛-3-O-methylcarbonyl-1-aminocap酸 N-Hydroxysuccinamide 酯牛血清蛋白结合物380 nm处检测吸光度用于计算牛血清蛋白和地高辛的结合度。假定380 nm 处地高辛的吸光系数3.2。 这个免疫原: 蛋白质的摩尔比率是 8.5 (图 1) 溶液浓度为100 mg/mL。 非竞争性ELISA定量分析已准备的结合物 从ELISA 检测获得的结果显示: 地高辛牛血清蛋白结合物的管比牛血清蛋白的管OD值高 (表 1)。 免疫法和抗地高辛抗体滴定法 初次免疫应答8周后，可获得适当滴度的抗血清。兔子体内血清中抗地高辛抗体在初次免疫应答50, 65,80, 95, 105, 125, 145, 165天后的滴度分别为9600，64000, 128000, 128000, 192000, 192000, 192000, 192000。(图 2) 图 1. 地高辛-BSA 结合物。 摩尔比率:载体蛋白=结合物OD /载体蛋白OD ×3.2 380380 表1. 非竞争性 ELISA 定量检测地高辛-BSA结合物 结果解释的是光密度，所有试验都进行双份对照。 抗地高辛辣根过氧化物酶结合物的鉴定 Anti-Digoxigenin-HRP 结合物棋盘图样 已准备的 anti-digoxigeninantibody HRP 结合物 1 : 6400 稀释液 50%结合在 13.8 ng/well 地高辛牛血清蛋白上的结果(图3)。 Roche HRPconjugatedanti-digoxigenin showed 1 : 200 稀释液 50% 结合在13.8 ng/well xigenin-conjugated BSA 结果(图4)。 图2. 免疫过的兔子抗血清滴度 抗地高辛抗体辣根过氧化物酶共轭 图3. 本研究中已准备的anti-digoxigenin HRP结合物棋盘图样 图 4.anti-digoxigenin HRP conjugate(Roche)棋盘图样 竞争曲线标准和平均亲和力测量 ELISA检测，标准曲线(图5)和抗地高辛抗体辣根过氧化物酶结合物罗吉特日志改造图(图6和7)绘制。被发现的抗地高辛HRP共轭平均亲和力获得由罗氏公司和我们的共轭分别是 10 110 11.8×10M和1.5×10M。 PCR - ELISA法棋盘检测DIG 属于连续稀释的抗地高辛抗体HRP的共轭光密度如表2所示。这些值表明，我们准备的抗体HRP的共轭的最高稀释掏检测PCR - ELISA法系统中的最佳外径;然而，1:200稀释的 罗氏共轭是最终的最佳测试OD，根据罗氏公司制作的。 图5 辣根过氧化物酶的抗地高辛结合物的竞争标准曲线 图6 罗吉特日志改造我们准备抗地高辛HRP共轭 和地高辛BSA。 Y:B,，X:B(NM)。 图7 罗吉特日志改造，罗氏公司的抗地高辛HRP共轭物和 地高辛BSA。 Y:B,，X:B(NM))。 图8 罗氏公司的抗地高辛HRP共轭和地高辛BSA Skatchard情节 B/U= (B–NSB)/T–(B–NSB). B (nM) =B/U 地高辛体积摩尔浓度(nM). Ka = Y-截距/X-截距。 图9 Skatchard准备抗地高辛HRP共轭物和地高辛BSA的情节 B/U =(B-NSB)/T-(B-NSB). B (nM) =B/U 地高辛体积摩尔浓度 (nM). Ka =Y-截距/X-截距 结果以光密度表示 所有结果为重复实验结果 结论 酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测是一种普遍的实验室测试可用于定性、定量检测的具体地区的DNA,称为目标。[2]PCR-ELISA可能有多种应用分子诊断病原微生物的突变检测基因紊乱,包括单点核苷酸多型性,提供使用的材料为测试成为符合成本效益的。在许多出版物报道说,这是一个昂贵的方法PCR-ELISA[2、4、5],因为所有的在PCR-ELISA试剂的商业。必须得到有简化协议可以被使用,一些修改,准备最多试剂参与这次的考试。本研究中这个系统关键部件之一抗体是已准备好从一只兔子源的anti-digoxigenin HRP共轭程序及准备其他组件，(如变性解、杂交缓冲、洗涤缓冲区,和共轭缓冲)[6,21]。 据所取得的成果，对地高辛BSA免疫家兔共轭提出了高滴度的抗血清。所以，准备免疫原和注射的时间剂量已有效执行.两个酶结合物的酶联免疫吸附棋盘结果显示两个稀释(1:6,400准备抗- DIG - HRP和1:200罗氏材料)抗- DIG -辣根过氧化物酶结合物了相同的结果适合平均亲和力comparisions。随后的标准曲线和亲和力测量结果显示，平均产生抗体的亲和力，适合准备使用PCR - ELISA检测的一种有效的酶共轭。 PCR - ELISA法棋盘结果表明，所制备的抗地高辛HRP共轭可以给相同的结果，在更高的稀释，可与商业可用共轭相比。 在这项研究中，从5毫升抗血清，我们可以产生抗地高辛HRP共轭量，这足以执行4000 PCR - ELISA法测试，用低得多的预算比可用于市售试剂盒的数目相等。因此，可以匹配的PCR - ELISA检测的要求的规格生产的高品质抗地高辛抗体HRP的共轭可以在任何实验室的准备基础设施建设。 缩略语 DIG,地高辛;OD,光密度OD; PCR,聚合酶链反应;ELISA,酶联免疫吸附法;DNA,脱氧核糖核酸;DMSO,二甲基亚砜，;BSA, 牛血清蛋白; HRP,辣根过氧化物酶;ABTS, 2,20-azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonate; PBS,磷酸缓冲液; TEN, Tris/EDTA/NaCl; EDTA, ethylen二胺。 生产的抗地高辛抗体辣根过氧化物酶的共轭 四乙酸; RIVM，国家公众健康研究所环境，荷兰，脱氧腺苷三磷酸的dATP，dGTP ,脱 氧鸟苷三磷酸; dCTP，三磷酸胞苷; dTTP,deoxytymidine;dUTP;三,三磷酸核,简称NSB，非 特异性结合指标。 参考文献 1. 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