抗豌豆白蛋白1b单克隆抗体的制备与特性鉴定

抗豌豆白蛋白1b单克隆抗体的制备与特性鉴定 抗豌豆白蛋白1b单克隆抗体的制备与特性 鉴定 208ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMo】llmu)9垫(2 文章编号:1007—8738(2oo6)o2—0208—03 抗豌豆白蛋白1b单克隆抗体的制备与特性鉴定 王建和,顿新鹏,曲丽娜,杨唐斌,陈正望 (华中科技大学生命科学与技术学院,湖北武汉430079;航天医学工程研究所十三 室,北京looo94) [关键词]豌豆白蛋白;单克隆抗体;纯化;特性鉴定 [中图分类号]11392.11[文献标识码]B 豌豆白蛋白1b(peaalbumin1b,PAlb)最初从豌豆种子 中分离获得…,后来从大豆中也分离到其同源物一豆类胰岛 素j.二者均为含37个氨基酸的单链肽,第3,7,l5,20, 22,32位的氨基酸均为半胱氨酸.其三级结构也已研究清 楚,属于富含半胱氨酸的肽类家族,因其具有潜在的新型抗 生素特性和抗艾兹病毒特性而备受关注J.PAlb在牛胃液 中能够保持完整的结构,水煮后仍能够保持其生物学活 性.是一种可杀灭谷类象鼻虫,对人和环境没有危害的昆 虫毒剂.也能促进细胞的分裂J,对损伤组织的生长具有明 显的促进作用.豆类胰岛素是一种7s的碱性球蛋白(basic7S globulin,7SBg)的天然配体.豆类胰岛素同7sBg的结合与 胰岛素同其受体的结合很相似.豆类胰岛素也具有调节细胞 分裂和分化的功能.为了探明PAlb的生理和病理作用, 我们制备了抗PAlb的单克隆抗体(mAb)并进行了其特性鉴 定. l材料和方法 1.1材料美国矮生白花大荚荷兰豆购自武汉市种子公司. 人血清白蛋白(HSA),牛甲状腺白蛋白(BTG),BCA试剂盒 及DMEM培养基均为美国Sigma公司产品.弗氏佐剂为Gib. CO公司产品.6wk雌性BALB/c小鼠(体质量l8,22g)购自 解放军军事医学科学院实验动物中心.Sp2/O细胞由中国农 业大学传染病与微生物学教研室提供.基质辅助激光解吸离 子化质谱仪(MALDI—MS)为Agilent公司产品.分析型高效液 相色谱仪为Beckman公司产品.酶联免疫检测仪为芬兰Lab. systemsdragon公司产品.SephadexG25凝胶柱及Sephaeel凝 胶柱均为Phamarcia产品.IgG亚类(型)的ELISA检测试剂 盒为Pierce公司产品. 1.2方法 1.2.1PAlb的制备及纯化按文献[8]的报道方法,取1kg 美国矮生白花大荚荷兰豆,室温浸泡12h,平铺于带滤纸的 白瓷盘里于25~C发芽1d.取适量提取液加入萌发的种子中 收稿日期:2005—05—16;修回日期:2005—08—22 基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助项目(No.2002AA214061) 作者简介:王建和(1970一),男,湖南益阳人,博士. Tel:(027)87552179;Email:wangjhooo@163.eom 匀浆,于4?搅拌提取24h,以7000r/rain离心25min,取上 清液用4mol/L的盐酸调pH至2.7.加适量的海藻酸,搅拌 吸附30rain,再用0.2mol/L的盐酸洗脱被吸附的蛋白.将 所获蛋白经SephadexG凝胶柱进行过滤后.收集小分子量 的成分溶于加mL0.05mol/LTris—HC1(pH8.0),再经 Sephacel柱进行层析.Sephacel层析中产生的第1个峰收集 冻干后,经HPLC(ODS—C..柱)进一步的分离纯化,检测波长 214nm,流速1.0mL/min.用MALDI—MS仪测定分子量,并 用Edman降解法进行序列分析,将测定的序列在SwissProt数 据库中进行匹配比较. 1.2.2PAlb—HAS的制备取HAS5mg,溶于0.1mol/L碳 酸缓冲液(CB,pH9.0)中,加入2.5g/L戊二醛水溶液 l0L.于室温暗处反应1h.将混合液过SephadexG.25凝 胶柱,用0.1mol/LpH9.0CB洗脱,除去未反应的戊二醛, 并收集蛋白洗脱峰.在洗脱液中.加入2mg的PAlb(溶于 CB),于室温中暗处反应16h,加入终浓度为1mol/L的甘氨 酸终止反应6h.将反应液对PBS透析24h,用BCA法测定 其浓度,分装后冻干保存备用. 1.2.3PAlb-BTG的制备取BTG5mg溶于0.1mol/L磷酸 盐缓冲液(PBS,pH7.4)中,加入1mg碳二亚胺(EDC)混合, 再加入1mgPAlb(溶于0.5mLPBS)边加边搅拌,于4cc反 应16h以上.将反应液经SephadexG.25凝胶柱过滤后,用 BCA法测定其浓度并分装,冻存备用. 1.2.4杂交瘤细胞的建立及mAb的特性鉴定(1)杂交瘤 细胞的建立:将PAlb-HAS加弗氏完全佐剂乳化后.经背部 皮下多点注射于BALB/c小鼠,100g/只.免疫后第28, 40,52天,用50峭/只的剂量将PAlb-HAS加弗氏不完全佐 剂乳化后,经上述途径各加强免疫1次.于融合前3,4d. 再以50g/只的PAlb-HAS不加佐剂经腹腔注射加强免疫1 次.细胞融合,筛选,克隆化,腹水制备及抗体纯化均按常 规方法进行,其中抗体的纯化用辛酸.硫酸铵沉淀法,]. (2)mAb的特性鉴定:?mAb的Ig亚类(型):采用ELISA检 测试剂盒进行鉴定.?腹水mAb的效价:采用间接ELISA检 测.即将腹水做1:10,1:10.稀释后,加入到BTGPAlb包 被的孔中,用间接ELISA法测定各孔的A值.?亲和力测 定:分别用不同浓度的BTG—PAlb包被酶标板,37cC孵育后, 用l0g/L的明胶封闭;洗涤后,加入系列稀释的已知浓度的 杂交瘤细胞培养上清液,37~C孵育;洗涤后,加入适宜浓度的 HRP标记的免抗鼠IgC抗体;洗涤后,加入底物(OPD)溶液, '77融.J抒.型LI 2结果 2.IPAlb的制备及纯化川IJ'嶂;,浆翻 攫驵谢越限埘}叭k-H.,新脏姑瞳FI1)1.IlI 』l圭终m刘5O…化帕i1%II?f【冬II:i'Lll:.1Ill?I. …一M,格洲所僻JcH471,1…川m.111ji'f钾,^j JE缸J^魄l}们I^,(,I,,I'-:?II;SS,Il;【:…【.1ui YCI{I(r.JfLI—I.iluh~l'f_..?l川:刈Jf比坟 Ih371,Ii戏;.#嗤 lj?Jilrirl 0I从L瑟Jll】纯比,Ih『10III?I1. h?III~//] 割2J蠡舢瀚尤娜?62离J化llI州?ml泌刘I^IIJ {f临定 22杂交瘤细胞株的建立刚^一旃8^.姒El】,,驯 5上uh~'Lfll也-lr神?皑JJIII仃1Hl…rI :II.咛4{Irt:r】?尊强r扎均H1世电降林始j电隧 亿IE氟5?罐…止泌札l1l,ihm^llI'1:J定稍H胞.丹 圳lE5,(:7硬,I【】 2.3mAb的特性鉴定刈5}采帕~li'i州帷,矗非 llf11,l.Il_I{耋I'】IS,剐盒世frr.5曛mAh }l19gi15H??K1.他3咪}J;21?一K:J本f 靖J5iii帕设价:1t9FIJC7I4I(mI:I Ilr.1尊1×IlI.^I(1'/4I:2×IjlllAlI恒求相坡 f『『:115R,I(}对I:HI(I,I19nIlhHI:4xI.117I4 ×I(}5陬…^l】tl9,IE5I17l,IoI'i~li'i;i数.依向 j75×I(3?×Ic125×2Ic1'fI2I4x 1c).『匕:5}…^h进.i:f5』nlI—I,I.…J2UJi ". 'll55?【)睫23(IK)O.n『(.键f?1千谴J均 小一 i?- i0一 ,i?- i??_? -LiiiH,Il,I.^(;11计" ?:.JiiiLlii中州?iii\:,I 2.4竞争抑制ll.ISA的应用l0Il_I,I.1'tl:fiir. .?1"15'$III,h生ff觅川IS,tlI.I:I.L1IJ=川轼f岛 浓J【1.)…ljnIJII'l,.1_,,1,3)l.f』fEi,J,止1,能:l} 5'I=l=lI11hI',ll?Hl音l迂II"lJ『漱f一625Li帕 t,II?lll》1-0,ll.ti{1,II?韵jl.互l.i~OtJj5件 1I.,Ih.,h址1Il0特怍 J外川址H箍lil【is,,?】堰田1削暂攫JIk:1一l— I.川,.H片址小叫,I22"1.t范…对1 ,scKLlIJJ4】 1 ljbnIcg:l f范j捌El_ISA协洲 _li.. ……帕川川一 ?趣_兰=善乜峨五=蟑… 悭一驯川, 墨…丑咙H时 浓帕墨i===卜 一 210ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMol)Q丝( 3讨论 PAlb的约为3742,是一种半抗原,需与大分子的载 体蛋白交联成为完全抗原才能刺激机体产生免疫应答.我们 将PAlb以不同的方法分别联结在HSA和BTG上,用HSA— PAlb作为免疫原制备mAb,用BTG—PAlb作为筛选阳性杂交 瘤细胞的包被抗原,通过竞争抑制ELISA检测,筛选出来的 阳性杂交瘤细胞分泌的5株mAb都是只针对PAlb,而同 HAS,BTG,EDC和戊二醛均不出现结合反应,证明抗PAlb mAb的特异性较好.由于目前对PAlb的类似物研究较少, 又无商品化的产品,未能进行PAlb与其类似物间的交叉反 应. 目前,已知的植物多肽激素种类还不多,而PAlb和豆类 胰岛素又与经典的动物多肽激素胰岛素联系到一起,因而受 到了动植物多肽激素研究者的广泛关注.PAlb的三级结构 研究显示,它含有3个p折叠:p^:Ala一Sers;pB:Cys一 Pro24;pc:Gly~o-His34,p^,顺势的Prol3与Sers—Glull和Ser17一 Cys两处的p转角形成N端的环状结构,Gly26一Va129处的p 使得pB和pc反向平行形成一个p发夹结构并与N端 转角, 的环状结构堆积,三个二硫桥键(C3-C,C.C,CIs-C)的 连接使得这一堆积的三级结构更加稳定…j.有这种特殊结 构预示着它有可能有些很重要的生理功能,已经报道了2种 生理功能:一是调节植物的生长,二是作为昆虫毒素用来杀 虫.并在相关的昆虫体内发现了高亲和的结合位点,但还 没有鉴定该结合位点为何种蛋白.我们的实验结果明 PAlb对葡萄糖的代谢具有调节作用.通过电生理实验,也发 现其对单个的胰腺beta细胞有明显地影响.PAlb到底有多少 重要生理功能还需要不断地去探索和发现.是否在动物体内 有内源性的PAlb存在,虽然已经发现动物和植物体内含有 多种结构和功能都相似的激素,多肽激素也不例外,至今还 没有发现一个完全相同多肽激素同时存在于动物和植物中. 抗PAlbmAb的制备,为进一步研究PAlb在生物体中的分布 及其生理功能和作用机制,并解决上述疑问带来了更大的 便利. 参考文献: [1]HigginsTJ,ChandlerPM,RandallPJ,eta1.Genestructure,protein structure,andregulationofthesynthesisofasulfur-richproteininpea seeds[J].JBiolChem,1986,261:11124—11130. 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