核苷酸碱基堆积导致的分子间NOE交叉峰

核苷酸碱基堆积导致的分子间NOE交叉峰 Vol . 16 ,No . 5 第 16 卷 第 5 期物 理 化 学 学 报 2000 年 5 月AC TA P H YS ICO2CH IM ICA S IN ICA May ,2000 [ 通讯 ] Ξ 核苷酸碱基堆积导致的分子间 NO E 交叉峰 姜 凌毛希安 () 中国科学院武汉物理与数学研究所 波谱与原子分子物理国家重点实验室 ,武汉 430071 ( ) 关键词 : 核苷酸 , 碱基堆积 , 二维 NO E 谱 NO ES Y 学科代码 :B030103 , B030105 ) ( ATP 三磷酸腺苷是生命活动中不可缺少的能量物质 ,它的各种结合状态都是与生物功能1 - 3 密切相关的. 在生物体内 ,它常常以很高的浓度存在. 由于碱基芳环部分的电子云形成环流 , 两两堆积可以降低能量. 因此在 ATP 浓溶液中 ,它们可能倾向于以碱基堆积方式形成自聚体 ,使 能量得到降低. 已有不少报导指出核苷酸在溶液中有碱基堆积现象. 人们通过改变样品的浓度、p H 值、实验温度等条件 ,发现 ATP 溶液的 1 H2NMR 谱中各质子的化学位移有很大变化 ,据此提 4 - 7 8 ,9 出了多种可能的堆积模型,并通过实验数据计算了它们的变化规律,认为在酸度较高的 10 情况下 ,即 p H 值小于 5. 3 时 ,碱基堆积现象最明显. 最近又有报导对碱基堆积作用做了量子 11 ,12 化学计算. Sigel 等人还认为在某些金属离子存在的情况下 ,碱基在稀溶液中即会形成堆积 , 堆积时以金属离子成桥 ,稳定堆积构象并中和电荷 ,整个分子以二聚体的形式存在 ,便于互相催 13 215 化生化反应. 可见 ,碱基堆积现象对于深入研究 ATP 参与的反应历程 ,如核酸与金属离子、 蛋白质之间的相互作用等都具有重要的意义. 尽管已经有不少关于核苷酸在溶液中形成碱基堆积的讨论 ,但碱基堆积至今仍缺乏直接的谱学证明. 特别是没有关于溶液中核苷酸分子间 NO E 效应的报导 ,而分子间 NO E 效应正是反映分子核间距大小最有力的证据. 为此 ,我们将两种不同 () 的核苷酸ATP 与 GTP混合配制了浓溶液 ,通过 2D NO ES Y 实验观察两种核苷酸之间的质子间 相互作用 ,直接证明了碱基堆积现象的存在 ,并讨论了可能的堆积方式. 1 实验部分 1 . 1 样品制备 ( ) ( ) GTP 二钠盐 CHNOPNa和 A TP 二钠盐 CHNOPNa?3 HO 为德国10 14 5 14 3 2 10 14 5 13 3 2 2 Boehringer Mannheim Gmb H 公司市售品 ,溶于 DO . 实验研究了三种样品 : 纯 A TP 、纯 GTP 、 2 - 1 A TP 和 GTP 的混合溶液. A TP 和 GTP 溶液浓度各为 50 mmol?L ,1 ?1 混合溶液浓度各为- 1 400 mmol?L . 溶液的 p H 值在 3 左右. 1 . 2 实验方法 N M R 实验均在 Bruker A RX2500 型高分辨 N M R 谱仪上完成. 实验温度控制在 298 . 0 K , () π 由 V T2200 温控器 Bruker控制 ,控温精度为 ?0 . 1 K. NO ES Y 实验采用标准脉冲序列 ,即/ 2 πτπτ- t - / 2 - - / 2 - t ,用预饱和技术抑制溶剂水峰 , TP P I 方式采样. 混合时间m 为 1 . 2s , 1 m 2 π脉冲间隔为 2s ,累加 24 次 ,采样数据矩阵 2048 ×480 . F ID 充零后成 2 K ×2 K 矩阵 ,用/ 42sin 钟函数处理后再作 F T 变换. 2 结果与讨论1121 对三种样品分别测定了 H2N M R 和 HH NO ES Y 谱 ,实验参数相同. 由于溶液中的分子运动 ,距离相近的自旋核之间会发生交叉弛豫 ,产生 NO E 效应 ,其强弱与核间距 、分子运动状 态等因素有关. 为方便讨论 ,A TP 与 GTP 的结构示于图 1 中. 图 1 ( A) ATP 的结构图 , ( B) GTP 的结构图4 - Fig. 1 ( A) The structural scheme of a denosine 5′2triphosphate ( ATP) , ( B) The structural 4 - scheme of guanosine 5′2triphosphate ( GTP) 纯 A TP 溶液的 NO ES Y 谱中 ,A H8 与糖环质子之间有较强的交叉峰 ,而 A H2 与糖环质子 几乎没有交叉峰 ,说明 H8 在糖环的附近 ,而 H2 远离糖环 ,碱基与糖环之间的构象以反式为 主. 糖环质子中 H2′与 H8 之间的 NO E 峰最强 ,说明 H2′最靠近 H8 ,因此糖环应以 C2′2endo 构 象为主. 纯 GTP 溶液的 NO ES Y 谱与 A TP 的相似 ,碱基与糖环呈反式构象 ,糖环也以 C2′2en2 do 构象为主. 在混合溶液的 NO ES Y 谱中 ,由于溶液浓度大 ,粘度较纯溶液高 ,分子运动速率下降 ,交 () 叉峰由纯溶液中的负峰变成正峰 对角峰为正. 在纯溶液中观察到的各核苷酸中碱基质子和 自身糖环质子间的 NO E 交叉峰在混合液中均出现. 因为交叉峰 A H82A H1′、GH82GH1′都很 强 ,说明碱基与糖环仍以反式构象为主. 值得注意的是 ,在 A TP 的碱基质子与 GTP 的糖环质子之间和 GTP 的碱基质子与 A TP的糖环质子之间 ,出现了确定的 NO E 交叉峰. 图 2 是 A TP2GTP 混合溶液的 NO ES Y 局部谱 , () () A图为碱基部分与糖环 1′位质子的 NO E 峰 , B图为碱基部分与糖环其它质子的 NO E 峰 , 分子间的 NO E 交叉峰用实线方框标出. 这些分子间交叉峰清楚地说明了两种核苷酸的碱基 16 部分与对方的糖环部分相距较近 ,与 DNA 中 A2G 结构或 G2A 结构颇为相似. 由此可以肯 定地认为在 GTP 与 A TP 的混合溶液中产生了碱基堆积现象. ( ) 对碱基堆积的可能方式 ,前人曾提出过多种构象. 有的提出“头尾相接”head2to2tail模 6 (( ) 型 ,即嘌呤的五元环 、六元环交错堆积, 如图 3 A所示. 也有的提出“面背相靠”f ace2to2 5 ) () back方式 ,即五 、六元环不交错 ,碱基以平行或反平行方式堆积,如图 3 B所示. 有的还认 ( ) A ct a Physico2Chi m ica S i nica W ul i Hu ax ue X uebao2000 399 图 2 ATP2GTP 混合溶液的 NOESY 局部谱 Fig. 2 Expanded portio ns of t he NO ES Y spect ra of t he mixed solutio n () () In t he range of Abasic p roto ns and sugar H1′, Bbasic p roto ns and ot her sugar p roto ns , i . e. H2′, H5′. The inter2 nucleotide NO E cross peaks are highlighted by solid squares 4 为六元环中的 N3 与 2′2O H 形成了氢键, + 7 以及 H 参与了碱基堆积等. 本实验中所 观察到的 A H2 与 A H8 同时与 GH1′、GH2′ 和 GH3′有 NO E 交叉峰的这一事实 ,说明在 溶液中头尾相接的模型和面背相靠的模型 均可能存在. 因为 ,当 A TP 和 GTP 均为反式 构象时 , 只有头尾相接时才会出现 A H2 与 GTP 糖环质子的 NO E 交叉峰 ; 只有面背相 图 3 ATP 在溶液中两种可能的碱基堆积方式靠时 才 会 出 现 A H8 与 GTP 糖 环 质 子 的 Fig. 3 Two suggested conf ormations of base NO E 交叉峰 , 及 GH8 与 A TP 糖环质子的 stacking of ATP in solutions NO E 交叉峰. 在一定的混合时间范围内 , ()( ) A “head2to2tail ”stacking , B “face2to2 NO E 交叉峰的强度与质子间距的 6 次方成 back”stacking 反比. 由于实验测得混合溶液中 A TP 、GTP 各质子的纵向弛豫时间平均在 1 . 3s 左右 ,NO ES Y 实验的混合时间 1 . 2s 应不会产生太强的自旋扩散效应 ,NO E 交叉峰的强弱可以大致地反映质子间距的大小. 积分计算后得到碱基堆积 时碱基之间的距离大约在 0 . 4 nm 左右 ,这与文献报导的 X 射线衍射测得的碱基堆积距离 0 . 17 35 nm 十分接近. 实际上 ,溶液中不仅可能有 A2G 交错堆积 ,也可能有 A2A 、G2G 堆积方式 ,但是 A2A 、G2G 堆积方式不能通过 N M R 方法观察到. 本文通过对 A TP2GTP 混合溶液的 NO ES Y 谱的测定 , 参 考 文 献 1 Winkler H. N eu roscience ,1976 ,1 :65 ( ) 2 Frausto da Silva J J R , Williams R J P. 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S oc. ,1978 ,100 :7106 17 Ξ Ba se2Sta cking2Induc e d Int e rmole cular NO E Cro ss Pe a ks fo r Nucleotid se J iang Ling Mao Xi′an ( L aboratory of N M R an d A tom ic & M olecul a r Physics , W u han I nst i t ute of Physics & M at hem at ics , Chi nese )A cadem y of S ciences , W u han 430071 The co ncep t of base stacking of nucleotides in solutio ns has been well accep ted. Howev2 Abstract er ,direct evidence has not been fo und. Here we repo rt fo r t he first time t he inter molecular NO E ( ) ( ) cro ss peaks bet ween A TP adeno sine 5′2t rip ho sp hate and GTP guano sine 5′2t rip ho sp hate , - 1w hich unambiguo usly indicates t he base stacking of nucleotides in solutio ns. In 400 mmol ?L A TP2GTP solutio ns , t he base p roto ns of A TP , A H2 and A H8 , show NO E cro ss peaks wit h t he sugar p roto ns of GTP , GH1′, GH2′ and GH3′. Also t here are NO E cro ss peaks bet ween t he base ( ) p roto n of GTP GH8and t he sugar p roto ns of A TP. Po ssible co nfo r matio ns of base stacking in solutio ns have been discussed ,and t he distance bet ween t he stacked bases is estimated. Key words : N ucleotide , Base stacking , NO ES Y 3 Received 2000201203 , revised 2000203208 . Co rrespo ndent : Mao Xi′an . Ξ The Project Suppo rted by t he Natio nal Out2 ( )standing Yo ung Scientist s Fo undatio n 29725307 401