气相色谱法测定水产品中敌百虫、敌敌畏残留量

气相色谱法测定水产品中敌百虫、敌敌畏残留量 气相色谱法测定水产品中敌百虫、敌敌畏残 留量 第19卷第4期 2010年7月 上海海洋大学 JOURNALOFSHANGHAIOCEANUNIVERSITY Vo1.19,No.4 July,2010 文章编号:1674—5566(2OLO)O4—0489—06 气相色谱法测定水产品中敌百虫, 敌敌畏残留量 叶玫,余颖,贺学荣,姜琳琳,吴成业 (福建省水产研究所,福建厦门361012) 摘要:通过对色谱条件和样品前处理方法的研究比较,建立了水产品中敌百虫,敌敌畏残留量测定的气相 色谱法.样品用丙酮一水溶液(2+1,v/v)提取,乙酸锌去脂,活性碳脱色,二氯甲烷萃取,浓缩后用气相色谱 一 火焰光度检测器(GC—FPD)测定.敌百虫在0.1,20S/mL,敌敌畏在0.025,5g/mL内线性关系良好 (r2?0.9995);0.01—4ms/kg添加浓度水平的回收率在74.8%,106.8%之间,相对偏差(RSD)为1. 12%,13.7%;敌百虫的定量限为0.04ms/kg,敌敌畏的定量限为0.O1ms/kg.该方法操作简捷,准确可靠, 能满足水产品中敌百虫,敌敌畏残留的检测要求. 关键词:水产品;敌百虫;敌敌畏;残留;气相色谱法 中图分类号:S948文献标识码:A Determinationoftrichlorfonanddichlorvosresiduesin fisheryproductsbygaschromatography YEMei,YUYing,HEXue—rong,JIANGLin—lin,WUCheng—ye (FisheriesResearchlmtit~eofFujian,Xiamen361012,China) Abstract:Gaschromatographymethodwasdevelopedfordeterminationoftriehlorfonanddichlorvosresidues infisheryproductsbycomparingchromatographyconditionsandthesamplepretreatment.Thesampleswere extractedwithacetone—water(2十 1,v/v)anddiscoloredbyactivatedcarbon,lipidswereremovedbyZnAC, thentheresidueswerere— extractedbydichloromethaneanddeterminedbygaschromatographywithflame photometricdetector(GC—FPD).Thelini~arrangeoftrichlorfonanddichlorvoswere0.1— 20g/mLand 0.025, 5g/mL(r1>0.9995).Whenspikedwith0.04,0.4,4mg/kgoftriehlorfonand0.0l,0.1,1 mg/kgofdiehlorvos.theaveragerecoveriesrangedfrom74.8%to106.8%andtheirrelativestandard deviations(RSD)werebetween1.12%and13.7%.Thedetectionlimitsoftrichlorfonanddiehlorvoswere 0.04mg/kgand0.01mg/kgseparately.Thismethodissimple,reliableandcanbeappliedtodetectionof trichlorfonanddichlorvosresiduesinfisheryproducts. Keywords:fisheryproduct;triehlorfon;dichlorvos;residue;gaschromatography 敌百虫(Trichlorfon)为广谱性磷酸酯类杀虫 剂,目前广泛应用于水产养殖中的虫害防治.敌 百虫在弱碱性条件下,或进入环境,或在生物体 内代谢能分解成毒性更大的敌敌畏 收稿日期:2009.1211 基金项目:2005年福建省地方标准制修订项目(闽质监标函[2005]83号) 作者简介:叶玫(1962一),女,副研究员,主要从事水产品质量安全检测方面的研 究.E-mail:yemei808@sohu.com 490上海海洋大学l9卷 (Dichlorvos),因此,水产养殖中敌百虫的使 用,不仅要顾及对养殖鱼本身的毒性效应_1j,其 残毒对养殖鱼的食用安全也不可忽视一.更有 不法经营者,在咸鱼,鱼干加工和贮藏过程中违 ,浙江,广西等 禁使用有机磷杀虫剂,2003年以来 地对市售的水产品中有机磷农药残留的调 查明,敌百虫,敌敌畏检出率最高.问 样本除同时使用敌百虫,敌敌畏外,也不排除单 独使用敌百虫,敌百虫转为毒性更大的敌敌畏残 留的可能,因此在实际监控中,有必要同时检测 样品中敌百虫,敌敌畏的残留. 我国农业部235号公告中对畜产品中敌百 虫的限量为0.05mg/kg,敌敌畏的限量为0.02, 0.10mg/kg;食品法典委员会,美国,韩国等对动 物性食品敌百虫限量为0.1mg/kg,敌敌畏限量 为0.02,2mg/kg?.目前国内针对动物源食品 中有机磷残留的检测方法,敌百虫,敌敌畏的检 测方法各自不同H,能一并检测的研究报道 不多?,而适应于水产鲜品及加工制品,能同 时检测敌百虫,敌敌畏的方法研究尚未见报道. 本研究通过对色谱检预0条件,样品中目标物的提 取净化方法的优化,以及加标回收率,精密度,检 测限等验证实验,建立水产品(含水产加工制品) 中敌百虫,敌敌畏残留量测定的气相色谱法. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1仪器 仪器包括6890N气相色谱仪(美国Agilent 公司),配有火焰光度检测器,AB204一E电子天 平(梅特勒一托利多仪器上海有限公司),FA25 高速组织捣碎机(上海弗克机电有限设备公司), SHZ一82气浴恒温振荡器(常州国华电器有限公 司),80—2B低速离心机(上海安亭科学仪器厂) 和R205旋转蒸发器(上海申生科学有限公司). 1.1.2试剂 试剂有敌百虫,敌敌畏标准溶液(100g/ mL,农业部环境保护科研监测所);敌百虫,敌敌 畏混合标准工作液:根据需要准确移取适量的敌 百虫,敌敌畏标准液,用丙酮稀释成适宜浓度的 混合标准工作液,即用即配;丙酮,二氯甲烷(色 谱纯,美国Tedia公司);乙酸锌(分析纯);无水 硫酸钠(分析纯):650oC灼烧4h,置于干燥器内 备用;活性碳(粉末,层析用):用3moL/L盐酸溶 液浸泡过夜,去离子水洗至中性,120oC烘干备 用;丙酮-水溶液(2+1,v/v):将1份水加入到2 份丙酮中. 1.1.3试样制备 实验中所采用罗非鱼,对虾为鲜活样品,咸 丁香鱼,鱿鱼干分别为半干和干制品,均购于厦 门市农贸市场.罗非鱼去鳞,取带皮肌肉;对虾去头,去壳,取肌肉部分;用高速组织捣碎机匀 浆.咸丁香鱼,鱿鱼干取可食部分,剪成不大于 0.25em×0.25cm×0.25cm的小块后混匀.将 试样于一18cc以下冷冻保存备用. 1.2方法 1.2.1样品前处理 提取:称取试样5g(精确到0.O1g)于50mL 离心管中,加入0.5g乙酸锌,0.1g活性碳,再加 入20mL丙酮一水溶液,涡旋混合,在振荡器上振 荡提取20min,以2000r/min离心5min,将上清 液转移至250mL分液漏斗中.残渣用20mL丙 酮.水溶液重复提取2次,合并提取液于同一分液 漏斗中. 净化:在盛有提取液的分液漏斗中加入2O g/L的硫酸钠溶液100mL,振摇混匀(如混合液 出现絮凝而影响两相分层时,需经两层滤纸抽 滤),加入30mL二氯甲烷,剧烈振摇3min,静置 分层,下层二氯甲烷经无水硫酸钠柱(8.0em× 1.5cm玻璃柱,内装5em高无水硫酸钠)滤人 250mL梨形瓶中,上层液体加入30mL二氯甲 烷,按上述方法重复提取2次,合并萃取液,在40 ?以下减压蒸至近干,残渣以丙酮溶解定容至 2.0mL,供气相色谱测定. 1.2.2色谱测定 色谱柱:DB一1701毛细管柱,30rn×0.32 mm×0.25m;柱温:60?保持1rain;以10?/ rain升至150?,保持2rain;再以30~C/min升至 230?,保持2rain;进样口温度:280oC(选用不 带玻璃毛的不分流衬管);检测器温度:250?;载 气:高纯氮,纯度?99.999%,流速2.0mL/min; 氢气:纯度>t99.99%;进样方式:不分流进样,进 样量:1L. 选定与样液浓度相近的标准工作溶液,采用 外标法进行定量分析;标准工作溶液和样液等体 积参插进样测定;标准工作溶液和样液中敌百 4期叶玫,等:气相色谱法测定水产品中敌百虫,敌敌畏残留量491 虫,敌敌畏响应值均应在仪器检测线性范围内. 2结果 2.1标准色谱图和线性范围 在上述色谱条件下,敌百虫以其分解产物亚 磷酸二甲酯定量,参考保留时间为3.3rain;敌敌 虫(10g/ 畏的参考保留时间为9.2rain,敌百 mL),敌敌畏(2.5g/mL)标准溶液色谱图见图 1. 《 占 \ 翅 售 o()0 O00 000 ooo ol3o ooo 0()0 0 2 ? 1? ? ? _ ? 234567891o 时间/mln 图1敌百虫,敌敌畏标准溶液色谱图 Fig.1Chromatogramofstandardsolutionof trichlorfonanddichlorvos 1.敌百虫分解产物亚磷酸二甲酯;2.敌敌畏 分别以0.1,0.2,1,10,20g/mL的敌百虫 及0.025,0.05,0.25,2.5,5txg/mL的敌敌畏混 合标准溶液进样,以峰高为纵坐标,以质量浓度 为横坐标,绘制标准曲线,并计算相关系数.线 性方程与相关系数见表1,敌百虫在0.1,20 mL,敌敌畏在0.025—5L范围内线性相关良 好. 表1敌百虫,敌敌畏线性方程及相关系数 Tab.1Linearequationandcorrelationcoefficient fortrichlorfonanddichlorvos 2.2准确度和精密度 以阴性罗非鱼,对虾,咸丁香鱼,鱿鱼干样品 作为基质,进行加标回收和精密度实验,以考察 方法的准确度和精密度,添加量为敌百虫0.04 mg/kg,0.4mg/kg,4mg/kg,敌敌畏0.O1mg/kg, 0.1mg/kg,1mg/kg,每个浓度水平重复6次,回 收率在74.8%,106.8%之间,相对标准偏差为 1.12%,13.7%,日内回收率和精密度实验结果 见表2. 表213内平均回收率和精密度(n---6) Tab.2lntra-dayaveragerecoveryandprecision(n=6) 492上海海洋大学19卷 为了验证方法的再现性,以空白对虾,鱿鱼 干样品作为基质,作敌百虫0.04mg/kg,0.4mg/ kg;敌敌畏0.01mg/kg,0.1mg/kg的日间(n=3) 加标回收实验,回收率在82.4%,103.1%之间, 相对标准偏差为3.82%,9.15%,日间回收率和 精密度实验结果见表3.实验结果表明13内和日 问加标回收率和精密度均符合动物性产品药物 残留分析技术要求.罗非鱼空白样品的色谱图 见图2,罗非鱼空白样品的敌百虫(1mg/kg),敌 敌畏(4mg/kg)加标色谱图见图3. 表3日间平均回收率和精密度(n=3) Tab.3Inter-dayaveragerecoveryandprecision(n=3) 孚: 逞4 j四3 倒2 罾1 时间/min 图2罗非鱼空白样品色谱图 Fig.2chromatogramoftheblanksampleoftilapia 告 昌 图3罗非鱼空白样品添加敌百虫,敌敌畏色谱图 Fig.3chromatogramoftilapiasampleaddedwith trichlorfonanddichlorvos 1.敌百虫分解产物亚磷酸二甲酯;2.敌敌畏. 2.2方法定量限 方法最低定量限的确定依据是样品的实际 加标回收率70%,120%之问,信噪比?10,精密 度?15%.本方法在加标量敌百虫为0.04mg/ kg,敌敌畏为0.01mg/kg时信噪比大于l0,回收 率在78.3%,105.7%之间,精密度为4.1%, 12.4%,因此将0.04mg/kg,0.01mg/kg分别定 为敌百虫和敌敌畏的定量检测限,敌百虫,敌敌 畏定量限水平加标回收率和精密度见表4. 表4定量限水平的回收率和精密度(n=6) Tab.4Averagerecoveryandprecisioninthe limitofquantitativelevel(n=6) 3讨论 3.1色谱分析条件的确定 气相色谱一质谱联用技术(GC/MS)对敌百虫 在气相色谱分析过程产生的分解产物进行定性 研究表明16,20],敌百虫在进样口受热情况下,分 子中的C—P键断裂,经重排生成三氯乙醛和亚磷 酸二甲酯.敌百虫的定量检测,采用测定敌百虫 母体的方式存在弊端,检测结果不稳定或测不 到,但只要分解产物稳定,分解量同敌百虫的量 成正比,通过分解产物对敌百虫定量是可行的, 以分解产物三氯乙醛或亚磷酸二甲酯为依据定 4期叶玫,等:气相色谱法测定水产品中敌百虫,敌敌畏残留量493 量检测敌百虫,已有报道和例证?.ECD检 测器对三氯乙醛的响应值高,灵敏度好,但其分 子量小,出峰早,容易受到杂质峰的干扰;FPD检 测器适合于亚磷酸二甲酯,亚磷酸二甲酯在自然 条件中存在的可能性极小,在中低极性的色谱柱 中有较为合适的保留时间l16].考虑到和敌敌畏 一 并检测,FPD对有机磷的选择性,稳定性,灵敏 度为最佳,因此本方法选择FPD检测器,以亚磷 酸二甲酯为敌百虫的定量目标物. 敌百虫,敌敌畏为弱极性化合物,选用中低 极性键合交联柱作为色谱分离柱,试验结果证 明,用DB一1701毛细管柱(30ITIx0.25/xm× 0.32mm),敌百虫分解产物亚磷酸二甲酯,敌敌 畏与样品基质的分离效果好.色谱条件的选择 和优化,关键点在于对敌百虫分解产物灵敏度和 稳定性的把握,有机磷气相色谱分析进样口的温 度在200,280oC之问,敌敌畏的响应值在此温 度范围内变化不大,而敌百虫分解产物亚磷酸二 甲酯,响应值随温度的升高而增大,超过280oC, 分解产物的含量趋于平缓,根据实验所得数据, 进样口选择有利于提高敌百虫检测灵敏度和稳 定性的温度,即280oC,而柱温则采用尽量温和 的升温程序,敌百虫分解产物量在色谱柱分离过 程中保持稳定.带玻璃毛的衬管对敌百虫的分 解有影响,样品中油脂,蛋白等杂质可能促进敌 百虫在玻璃毛的衬管内的分解,造成敌百虫的回 收率偏高,但不带玻璃毛的衬管此现象不明显, 因此选用不带玻璃毛的不分流衬管.本方法参 考保留时间为3.3min的色谱峰,经质谱验证为 亚磷酸二甲酯,作为敌百虫的定量峰,敌敌畏的 参考保留时间为9.2min. 3.2提取溶剂的选择 水产品和水产加工制品蛋白,脂肪含量较 高,因此应选择对敌百虫,敌敌畏溶解性好,脂溶 性较差且对动物蛋白有良好沉淀作用的提取剂. 敌百虫,敌敌畏为弱极性化合物,易溶于乙酸乙 酯,二氯甲烷,乙腈,丙酮等有机溶剂,在水中也 有一定的溶解度,敌百虫在水中的溶解较好,为 154g/L,敌敌畏差些,为lOg/L.用纯粹的有机 溶剂提取,脂肪杂质较高,不易净化;因此考虑用 有机溶剂水溶液为提取剂.提取液中水的配比 高了,敌敌畏的溶解度较差,后续净化会出现乳 化现象,通过不同比例的丙酮和乙腈水溶液提取 效果的优化实验,确定以2+1丙酮溶液为提取 剂.乙腈溶液提取效果和丙酮溶液差别不大,从 试剂的毒性和价格方面考虑,选择丙酮溶液为提 取剂. 3.3净化方法 有机磷检测样品净化通常采用液.液萃取,固 一 液萃取方式.因敌百虫,敌敌畏两者在有机相或 水相中的溶解度差异较大,采用液.液萃取除脂净 化的方式,两者难于同时达到理想的回收率;中 性氧化铝对蛋白,油脂,色素的吸附性较好,常用 于有机磷检测的样品净化,但若中性氧化铝去 活化处理控制不好,对目标检测物也有吸附作 用,本实验中发现,中性氧化铝对低浓度的敌百 虫和敌敌畏有一定的吸附性,低浓度的加标回收 率不足60%;以凝胶作为固相萃取材料虽有较好 的净化效果】,但成本较高,试剂用量大,整个实 验过程也费力费时. 经大量的实验比对,本研究的样品前处理方 法在文献[14]的基础上改进完善.在提取液中 加入乙酸锌,利用乙酸锌水解后,易与脂肪形成 脂肪酸锌沉淀,除去提取溶解带来的脂类化合 物.水产品及加工制品(甲壳类,头足类等)带有 色素,容易被提取需经净化,在提取液中加入少 量活性碳,兼有除色素和除脂功能,活性碳对敌 百虫有一定的吸附作用,经实验验证,5g样品中 以加入0.1g活性碳为宜.样品经提取和净化, 提取物中的杂质已大大降低,为了进一步除去水 溶性杂质,并将目标物转移至有机相,采取有机 溶剂反萃的方法.乙酸乙酯,二氯甲烷,三氯甲 烷是通常用于萃取有机磷的溶剂,从易于蒸发浓 缩和毒性方面考虑,选用提取液在二氯甲烷一硫 酸钠水溶液中液一液分配的方式进行相转移并 起到进一步净化的作用;水产腌制品,盐,淡干制 品基质复杂,在相转移过程中,与硫酸钠水溶液 混合时会出现絮凝而影响两相分层,混合液需经 两层滤纸抽滤,再加入二氯甲烷萃取. 3.4方法的适应性 目前国内动物性食品中敌敌畏残留的测定 采用《GB/T5009.20食品中有机磷残留的测 定》和《GB/T5009.161动物食品中有机磷农 药多组分残留的测定》?,这两个标准均未规定 敌百虫残留的检测方法;而敌百虫残留的检测标 准《SN0125—92出品肉及肉制品中敌百虫残留 494上海海洋大学19卷 的检验方法》14],《农业部783号公告一3—2006 水产品中敌百虫残留量的测定气相色谱法》, 也未规定敌敌畏残留的检测方法.本方法能同 时检测水产品中敌百虫,敌敌畏残留,敌百虫定 量限为0.04mg/kg,和《农业部783号公告一3—2006水产品中敌百虫残留量的测定气相色谱 法》?相当,敌敌畏的定量限为0.O1mg/kg,略 优于《GB/T5009.20食品中有机磷残留的测 定》,能满足目前国内外的相关限量标准要求, 适合于水产品养殖,加工,流通环节中对产品敌 百虫,敌敌畏残留的日常监控,也可作为参考方 法用于其它动物源产品的检测. 参考文献: [1]金天明,孙晓辉.敌百虫对鲤鱼的毒性与pH值的关系初 探[J].内蒙古民族大学:自然科学版,2002,17(5): 420—422. 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