实验三(2)温度对酶活力的影响

实验三(2)温度对酶活力的影响 实验三(2)温度对酶活力的影响 ,,热稳定性的测定 一、实验目的 掌握测量酶的热稳定性的原理与方法 。 二、实验原理 酶受热后易变性失活，因此各种酶对热都有一个稳定范围。一般的实验方法是，在一定条件下，先将酶在不同的温度下处理一段时间，迅速降温，然后再在一定温度条件下测定酶活力。以处理温度为横坐标，酶反应速度为纵坐标作图，可得到酶的热稳定曲线，并可求出酶的热稳定范围。 三、实验 1 溶液及试剂: ?酸性磷酸酯酶原酶液 原酶液用0.05mol/L PH=5.0 的柠檬酸钠缓冲液稀释25倍左右，A405=0.6 至0.7 间 ?1.2mmol/L NPP ?0.3 mol/L NaOH 2.仪器及玻璃器皿 ?恒温水浴槽 ?可见光分光光度计 ?试管、刻度吸管 四、方法步骤 1 取16支试管，编号，0为空白对照，各管加酶液2ml 。将1-15号分为5组，每组依次放入 30? 、40? 、50? 、60? 、70 ? 的恒温水浴锅加热处理，3个管分别处理15、30、60分钟，取出后立即用流动水冷却。 2 热处理全部结束后，置于35? 的恒温水浴，预热2分钟，主管加入1.2 mmol/L 的NPP 1ml 精确反应15 分钟，后加入0.3mol/L NaOH 2ml 终止反应。0号管先加入 1.2mmol/L的NPP1ml 热处理温度30 ，热处理时间15分钟。 3 热处理后加入0.3 mol/LNaOH2.0ml，后加入2ml酶液。冷却后以0号为对照， 测A405 。 五、试验结果及分析: 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 处理温 30 40 50 60 70 度/? 处理时 15 30 60 15 30 60 15 30 60 15 30 60 15 30 60 间/min 吸光度-0.22-0.35-0.380.10-0.37-0.38-0.38-0.43-0.42-0.67 -0.394 -0.388 0.164 0.176 0.091 值 5 9 5 7 5 2 5 8 3 9 酶的耐热性曲线图 0.4 0.2 0 020406080 -0.2 吸光度值30?-0.4 40? -0.650? 60?-0.8 70?处理温度/? 结果分析: 由于酸性磷酸酯酶能水解NPP产生对硝基苯酚和磷酸，在碱性溶液中，对硝基苯酚盐离子在405 nm处光吸收强烈，而底物NPP无此特性，因此用反应液吸光度征酸性磷酸酯酶活性。 以吸光度值为纵坐标，处理时间为横坐标，绘制不同温度处理的曲线，本试验数据存在较大误差，理论上，酶受热易变性失活，各种酶对热都有一个稳定范围。本组试验吸光值不在最精确范围内，可能是由于分光不准所致。 六(注意事项: ?试验应严格控制反应时间和反应温度以免造成较大误差。 ?本试验需要多组合作，由于参与人数较多，试验结果产生误差的可能性大。可能由于操作者不注意试验细节，造成吸光度值测量不准。因此对于诸如此类参与人数较多，测量数据繁杂和等待时间较长的试验，操作人应注意试验细节问题和整体统筹规划。