不同蛋白酶水解酪蛋白类大分子底物的规律研究_cropped

不同蛋白酶水解酪蛋白类大分子底物的规律研究_cropped ] 周义发, 张翼伸，梁忠岩.酵母甘露聚糖的结构确定与[14] 何照范，张迪清. 保健食品化学及其检测技术[M核磁共振谱的解析[J].生物化学杂志，1991, (7): 74-78. 京:中国轻工业出版社，1998. ] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[M]. 上海: 上海科学技 [15] 邹国林，桂兴芬，钟晓凌，等. 生物化学与生物物术出版社,1987. 展，1986(，4):71-73. ] 陆冰真,翟永信. 薄层层析法在食品分析中的应用[M].北[16] MunroS.WhatcanyeasttellusaboutN-linkedglycosyl 京:北京大学出版社,1991.6-80.intheGolgiapparatus?[J].FEBSLett,2001,498:223- Babincova M, Bacova Z, Machova E, et al.Antiox ] BradfordMH.Rapidandsensitivemethodforquantitationof[17] microgramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofpro-propertiesofcarboxymethylglucan:comparativeanalysi tein-dyebinding[J].AnalBiochem,1976,72:248-254. J Med Food, 2002, 5(2): 79-83. 不同蛋白酶水解酪蛋白类大分子底物的规律研 庞广昌，潘 葳，陈庆森 (天津商学院生物工程系，天津 300134) 摘要:近年来，已有大量具有重要生物活性的短肽通过适当的蛋白酶水解营养或贮藏蛋白释放和辨认出来。这 些蛋白资源十分丰富和廉价，通过水解这些蛋白质所获得的生物活性肽不仅价格便宜、安全性好、工艺简单，而且容易进行工业化生产。为了能够获得更高的生物活性肽得率，为生产和研究提供理论依据，本文开展了酶促蛋白水 解制备生物活性肽的水解条件、底物浓度和水解度之间的关系研究。结果明:当底物达到一定的浓度时，不仅其 酶促反应速度会迅速下降，酶切位点和酶解产物也有明显不同。这些结果不符合米氏方程，显然酶解蛋白类大分子 底物时酶和底物之间的作用比其他底物要复杂得多。 关键 词:酪蛋白;水解度;大分子蛋白类底物;生物活性肽;蛋白酶 udyonHydrolysisConditionsofMacromolecularProteinsasSubstrateReactedwithDiferentProtein PANG Guang-cang, PAN Wei, CHEN Qin-seng (Department of Biological Engineering,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China) Abstract :Recently,scientistshavefoundthatmilkandsomeotherproteinswerepossibleprecursorsofmanydifferentbiologicalactive peptides. These peptides are inactive within the sequence of the precursor proteins and can be released from the precursorwhentreatedwithproteinaseunderproperconditionssuchaspH,temperatureandionicconcentration.Uptonow, severalkindsofbiologicalpeptideshavebeenfoundfromtheproteolysissolutionofnutritiousorseedproteins.Becauseof theseproteinswereverycheap,richinresourcesandsafeforhealth,thebioactivepeptidestherebyhavehadcommercial potential,alsobeensuitabletoscaleup.Thereforethedegreeofhydrolysis,digestconditionsandtherelationshipbetweenthe macromoleculeproteinssubstratesandtheproteinaseswereinvestigatedinseveralexperimentsinthispaper.Theresults showedthatwhentheconcentrationofthesubstrateincreasedoversomepoint,theratesofreactionswilldecreaseonthe contrary.ItwasobviouslydeferenttotheMichaelis-MentonEquation.Itshowedthattheinteractionsbetweenenzymesand substratesofmacromolecularproteinsmightbemorecomplex. Key words: casein;degreeofhydrolysis(DH);substratesofmacromolecularproteins;bioactivepeptides;proteinase 中图分类号:Q814.9文献标识码:A文章编号:1002-6630(2004)03-0036-08 日期:2003-08-20 酶和底物的关系研究和酶促反应的动力学方程研究由来1.2 方法 已久，米氏方程式酶反应动力学最著名也是最简单的方程。 实验目的:通过测定不同的底物浓度下，水解度随酶 [1]早在1913年，Michaelis和Menten就在前人工作的基础上， 时间的不同，绘制出不同底物浓度下酪蛋白的酶解曲线，然后提出了酶促反应动力学模型，即著名的米氏方程: 通过对所绘出的曲线的分析，来寻找酪蛋白酶解底物浓度与v = Vmax[S]/(Km+[S]) 该方程的前提是 解度的关系，从而得出水解底物浓度与水解度的关系曲线。酶与底物反应的“中间产物说”和“快 试剂:速平衡说”。该方程多年来已经得到科学家的普遍承认和应 (1)酪蛋白 称取酪蛋白若干克，研磨至粉末，放入用，成为酶学研究和酶工程的基本理论依据。米氏方程所揭 准备好的三角 示的底物与反应速度之间的关系是每一个从事酶学研究的人 中，贴好标签，备用。 都熟知的。但是在以前的研究中，人们主要利用的是小分子 (2)NaOH溶液 称取NaOH晶体50.00g，在烧杯中溶物质作为底物，即使用到象淀粉、纤维素或脂类物质等大分 解，然后分几次 子，其酶解特性也相对比较简单，所以其中无需考虑到当底 物浓度增加时，底物粘度、大分子物质的空间结构变化以及 入250ml的容量瓶中,并用蒸馏水洗涤烧杯3,4次，并入容量酶对底物切点位置的变化等对实验结果的影响。在我们用蛋 瓶，然后用蒸馏水定容至250ml。 (3)胰蛋白酶(木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶) 白酶水解制备生物活性肽时发现，当底物达到一定的浓度时， 不仅酶促反应速度不会提高，还会迅速下降，而且严重影响 用电子天平准确称量1.00g纯酶，先溶解，然后定容至酶切位点和酶解产物，从而难以获得预期的水解效果，更不 100ml。 用说高活性肽得率。显然，米氏方程所揭示的是酶的活度和 实验步骤: 结构与底物活度和结构之间的复杂关系。在酶解蛋白质类大 (1)取200ml的烧杯一只，用一干净的量筒在其中加入分子底物时，其活度是有限的，浓度越高粘度越大，其空间 90ml蒸馏水。 结构的复杂性使得蛋白酶无法找到其酶切位点，所以影响了 (2)分别取已经研磨好的1g、2g、4g 酪蛋白粉末酶促反应速度和小片段生物活性短肽的获得和得率。 放入已装满蒸馏水的烧杯中，放入磁力搅拌器中提前搅拌近年来，已经有大量具有重要生物活性的短肽通过适当 经过2,5h的搅拌，使得酪蛋白液成均匀混合的状态。[3,6]的蛋白酶水解营养或贮藏蛋白释放和辨认出来。由于这 (3)将此烧杯放入恒温水浴箱中，并保持温度为40,5 些蛋白资源十分丰富和廉价，通过水解这些蛋白质所获得的 ?，将搅拌器固定好，开始搅拌，并调节溶液的pH值至最生物活性肽不仅价格便宜、安全性好、工艺简单，而且容易 pH值。其中胰蛋白酶(pH=8.0)、木瓜蛋白酶(pH=6.5)、碱 进行工业化生产，所以这类研究越来越受科学家和各国政府 蛋白酶(pH=9,10)。 的关注。目前研究最集中的还是动物乳中的蛋白,仅从牛乳酪 蛋白酶解物中就获得了数十种具有重要应用价值的生物活性 (4)然后用移液管在烧杯中加入酶液10ml，开始酶解[7,13]短肽，其中CPPs、降压肽、酪啡肽等已经投放市场。为 酶解过程中不断搅拌，由于酪蛋白在酶解过程中，溶液的p了能够获得更高的生物活性肽得率，为生产和研究提供理论 值降低，所以酶解过程中用2.5mol/L NaOH溶液来中和，依据，有必要开展酶促蛋白水解制备生物活性肽的水解条件、 pH值恒定在最适值。底物浓度和生物活性肽得率之间的关系研究。然而，在这方 (5)每隔2min一次所加的NaOH溶液的量，到酶 面的研究国内外却很少有报道，虽然有个别发达国家报道过 水解度和生物活性肽得率的关系研究，但尚未见从酶促反应 的后期可适当延长记录数据的时间间隔，直至酶解溶液的p动力学的角度进行系统研究的报道。本实验室自1996年以来 值不再改变，然后停止酶解(一般为1,2h)。开展了大量有关水解牛乳酪蛋白制备生物活性肽的研究，结 (6)根据不同时间段内消耗的NaOH溶液的体积，绘制 果表明开展酶和蛋白类大分子底物的酶解动力学研究不仅具 同底物浓度下水解度与时间的关系曲线。 有重要的应用价值，也具有重要的理论意义。 (7)综合实验曲线，进行分析，从而得出酶解反应曲线 [2] 水解度(DH)的计算为: M(V , V )× 1000/(C × V),0.45 1 0wo 1与方法DH(,),× 100% 8.2 1.1 材料 式中:M,NaOH溶液的浓度(mol/l)，为0.472mol/l ;酪蛋白(底物) 购自甘肃某乳品厂。 V ，V ,样品滴定，空白滴定时所耗NaOH溶液的体 1 0 酶胰蛋白酶购自Sepna Fein Biochemica Gmbh&Co. 积(ml); KG D-69115 Heidelberg. Carl-Benz-str.7.Telefon06221/C ，V,所用酪蛋白溶液的浓度(mg/ml)和体积(ml); wo 5020;木瓜蛋白酶购自北京化学试剂公司，德国进口 0.45,试验测得每克酪蛋白中所含游离氨基的量(mmol/g 购自北京化学试剂分装;Q\H82-F002-2000 碱性蛋白酶8.2,每克酪蛋白所含的肽键数(mmol/g)。 公司。其它化学试剂均为优质纯。 的片段就较小，因而水解得最彻底，水解度就越大。当 底物浓度的增大，底物酪蛋白溶液的粘度增加，蛋白质 度下降，水解的程度就下降，自然水解度也下降。(2 物浓度较低时，其反应曲线的趋势成线性，因而它符合 方程(。3)如果我们控制相同的底物浓度，根据所得出 线，可以取得不同的水解度的数据(。4)当底物水解达 定的时间后，水解反应速度会降低,水解度不再增加。这 们在实验前所推测的实验结果将会受到因为底物浓度的 而导致的粘度的增加、蛋白质的活度下降以及空间位阻 化等因素的影响是一致的(。5)在反应中我们利用了Na 液的滴加量作为表示水解度大小的标志，这是因为酪蛋 解时产生一定量的氨基酸残基，从而使水解液的pH值产生氨基酸残基的量与水解度有直接关系，水解度越 生的残基数越多，其p H值降低越大，中和时消耗的碱 多，因此在反应中可用耗用碱的量来表示水解度的大(6)根据曲线找出一个水解度最大，并且底物浓度最大 这就是最佳的底物浓度，可以用它来指导工业化生产 会有非常重大的实践意义。 6 结 论 (1)蛋白质类底物的水解与小分子类的底物的水解 同的。因为蛋白质类底物水解的部分是肽键，而肽键是 酶所识别显然和酶与底物的结构有关(。2)当底物浓度 时，粘度增加，蛋白质的活度降低(。3)识别的位点不白质有许多个水解位点)，而和酶是多位点结合的(。4 酶的水解曲线来寻找最佳的底物浓度，可为水解营养 贮藏蛋白并由此生产生物活性肽提供理论依据，而其动 方程对于水解大分子蛋白类底物生产生物活性肽具有重 义(。5)根据本研究结果可知:胰蛋白酶水解酪蛋白的 底物浓度为:10%，而木瓜蛋白酶和2709碱性蛋白酶则 7.8%。 参 考 文 献: [1]MichaelisL,MLMenten.Diekinetikderinvertinwirkung[J].B Z,1913,49:333-369. 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Institute of Biochemistry and Nutrition, Guizhou Univer- sity, Guiyang 550025,China) Abstract:I nthispaper,thecrudepolysaccharidesfromthefruitbodyofmushroomDictyophorarubrovolotawereobtainedbyextractingwithhotwaterandprecipitatingwithalcohol.Thefreeproteinswereremovedfromcrudepolysaccharides,and thenthepolysaccharideswereisolatedandpurifiedbySephadexG-15gelcolumnchromatography.Threepurepolysaccharides (Dr-1,Dr-2andDr-3)wereobtainedbyprecipitatingwithdifferentconcentrationalcohol.ByusingtheTLCmethod,weproved thatthethreefractionswereallcomposedofgalactose(Gal),glucose(Glu),mannose(Man)andxylose(Xyl). Key words: Dictyophorarubrovolota; polysaccharides; isolation; purification; TLC(Thin-layer-chromafography) 中图分类号:Q539文献标识码:A文章编号:1002-6630(2004)03-0043-03 收稿日期:2003-08-20