荧光定量PCR分析儿童EB病毒感染与异型淋巴细胞相关性[1]2

荧光定量PCR分析儿童EB病毒感染与异型淋巴细胞相关性[1]2 荧光定量分析儿童EB病毒感染与异型淋巴细胞相关性 周建峰 夏献颗 陈平 摘要:目的 了解儿童感染EB 病毒(EBV) 后外周血中异型淋巴细胞(异淋)的比值。方法荧光定量PCR测定外周静脉血的EBV拷贝数，确定EBV感染后，分三组:EBV 感染组、住院对照组、健康对照组各100 例, 取外周血涂片染色, 进行白细胞分类计数, 统计异淋比值。结果 EBV 感染组异淋为(5. 7 ?3. 3) % ,与住院对照组(2. 1?1. 2) %比较,差异有显著性意义(P < 0. 01) ; 与健康对照组(1. 0 ?0. 9) %比较, 差异有显著性意义(P < 0. 001) ;住院对照组与健康对照组比较,差异无显著性意义(P > 0. 05 ) 。100 例EBV 感染组中有20例异淋高于10 % ,100 例住院对照组中有3 例异淋高于10 % ,100 例健康对照组没有一例异淋高于10 % ,三组比较差异有显著性意义(P < 0. 01) 。在EBV 感染组,有15 %(15/ 100) 异淋?2. 0 %。结论 EB病毒在体内复制水平与异性淋巴细胞的比值成高度正相关，其中也存在个体差异。荧光定量PCR检测EB病毒具有特异性强、灵敏性和准确性高的优点。 关键词:EB 病毒; 儿童; 异型淋巴细胞;荧光定量PCR。 EB病毒是儿童感染性疾病中常见的病毒, 以呼吸道飞沫传播为主，可以造成人体全身多系统的损伤。 早期临床表现多样, 不易明确诊断。异型淋巴细胞(异淋)是外周血中出现的一种形态变异的不典型淋巴细胞。一般认为, 外周血中异型淋巴细胞(异淋)在病毒感染特别是EB病毒( EBV)感染时明显增多，但是在细菌感染或其他病毒感染时甚至正常人也可出现，以往把异淋高于10 %作为传染性单核细胞增多症的诊断之一。但是，发现大部分EB病毒感染病人异淋并未超过10,，尤其早期感染的患者异淋并不增高，经过追踪随访才确诊为EB病毒感染。而EB病毒DNA测定(咽刷)特异性、敏感性高，早期在异型淋巴细胞未增高时EB病毒滴度即已升高。本研究对我院住院儿童经荧光定量PCR确定的EBV 感染者, 行外周血涂片异淋比值的检查, 以未感染EBV 住院儿童患者和健康体检儿童作为两组对照组,了解EBV 感染对异淋比值的影响。 资料与方法 1. 1 研究对象 采集本院儿科2011 年4月至2012年3 月的住院儿童患着EBV 感染组和住院对照组各100例;另设100例本院儿保科健康体检儿童为健康对照组。病人中有发热、黄疸、咽峡炎、淋巴结肿大、皮疹、肝脾肿大、腹泻等临床表现。其中男184 例,女116 例，这些患者年龄最大的6岁，最小的3月。 1. 2 仪器和试剂 仪器: 中山达安公司生产的DA-7600荧光定量,,,仪; 试剂: EB 病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒购于中山大学达安基因股份有限公司, 瑞氏染液由东耀生物科技有限公司(台湾) 提供。 1. 3 方法 所有研究对象均于入院时抽取, mL 外周静脉血EDTA 抗凝，封闭送检。用实时荧光定量PCR 法检测住院儿童患者血样中EB病毒 DNA , EB病毒 DNA 阳性患者作为EB病毒感染组, EB病毒 DNA 阴性患者作为住院对照组, 儿保科健康体检儿童作为健康对照组。 取手指末梢血涂血涂片, 用瑞氏染色, 在显微镜下分类计数100 个白细胞, 统计异淋比值。 set up, grasping party building work in non-public economic and social organizations, expanding the coverage of the party building. Conscientiously implement the party members the whole publicity, voting and mobile party members management system, strengthen and improve party 1. 4 统计学处理 应用统计软件SPSS12.0统计，计量资料以X?SD表示，显著性比较采用,检验。 2 结果 2. 1 平均异淋比值的比较 三组年龄比较无统计学差异( P > 0. 05) , 见表1。EBV 感染组异淋比值为(5. 7 ?3. ) % , 与住院对照组(2. 1?1. 2) %比较, 差异有显著性意义(P < 0. 001) ; 与健康对照组(1. 0 3 ?0. 9) %比较, 差异有显著性意义(P < 0. 001) ; 住院对照组与健康对照组比较差异无显著性意义(P > 0. 05 ) , 见表1。 2. 2 异淋> 10. 0 %的比较 100 例EBV 感染组中有28 例异淋高于10. 0 % , 100 例住院对照组中有3例异淋高于10 % ,100 例健康对照组也没有一例异淋高于10 % , 三组比较差异有显著性意义(P< 0. 01) , 见表1。 表1:三组异淋比较 组别 异淋比 异淋?2% 2%,异淋?6% 6%,异淋?10% 异淋,10% N EB病毒感染(5. 7 ?3. 100 15 16 49 20 组 3) % 住院对照组 (2. 1?1. 100 73 13 11 3 2) % 健康对照组 (1. 0 ?0. 100 97 3 0 0 9) % 2. 3 异型淋巴细胞比例和EB 病毒copy 数的比较 在EB 病毒感染组,有15 %(15/ 100) 异淋?2. 0 % ,异淋> 6. 0 %的共有69例。而在住院对照组仅有14例异淋> 6. 0 % , 见表1。通过EB病毒感染组内比较，随着EB 病毒的拷贝数的增加，异型淋巴细胞比例也显著上升，见表2。 表2:异型淋巴细胞比例和EB 病毒copy 数的比较 异淋比 列数 Log EB病毒浓度(copy/mL) 异淋?2% 3.4?1.2 15 2%,异淋?6% 3.8?1.3 16 6%,异淋?10% 4.4?1.2 49 异淋,10% 6.3?2.1 20 3 讨论 EB 病毒是疱疹病毒科r 亚科中唯一能引起人类感染的淋巴滤泡病毒，广泛存在于自然界，人类普遍易感。人群中EBV 感染大多发生在儿童时期，EBV 感染是儿科常见的一种病毒性疾病，可感染全身多个系统，包括肝、脾、淋巴结、肾、心脏、肺、骨髓、脑等, 但以网状内皮系统病变为主。而且症状多变, 病情轻重不一, 可以出现典型的传染性单核细胞增多症以及其它复杂的临床表现或隐匿感染[ 1 ] 。受EBV 感染后，部分患儿因病情得不到控制，感染经久不愈甚至继发其他恶性疾病,2,。因此，早期诊断并及早治疗至关重要。 set up, grasping party building work in non-public economic and social organizations, expanding the coverage of the party building. Conscientiously implement the party members the whole publicity, voting and mobile party members management system, strengthen and improve party 对异淋细胞的判定受个人主观因素影响较大, 因此要求检验师具有较高的细胞形态学水平。在实际操作过程中避免人为造成的误差, 除严格按照DOWNEY 分型标准进行质控外, 还应在单核样异淋较多时, 一律对细胞进行过氧化物酶染色以区别单核细胞。 本项研究发现EB病毒感染组的异淋细胞比值高于住院对照组和健康对照组( P < 0. 01) ,说明儿童感染EV病毒后会导致异淋比值显著的升高，且异淋细胞比例大于6%的患者占69%(69/100)，提示异淋细胞在6%以上极有可能是EB病毒感染。临床上将外周血异淋比值大于10 %作为IM的一项诊断标准, 在本项研究中，100 例EBV 感染患者中只有20 例异淋比例高于10 % , 也就是在EBV 感染患者中只有20%(20/ 100) 发展到传染性单核细胞增多症(IM)。因此，为了防止病情的发展, 当异淋比值高于6 %时应引起临床的高度重视, 以免延误治疗。本研究还发现在EB病毒感染组中,有15%(15/ 100) 患者异淋?2%。有可能通过实时荧光定量PCR法检测EBV DNA所确定的EB病毒感染患者, 大多还处在感染初期, 还没有导致异淋细胞的增高。在机体免疫应答EBV的过程中逐步导致异淋的增高。提示当患者在EBV 感染初期, 及时进行了抗病毒治疗, 就不容易发展到IM。 应当注意的是，小儿外周血异型淋巴细胞升高在其他病毒感染的疾病中也会出现,3,，如在水痘,带状疱疹病毒(varicellazoster virus)、肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)，汉坦病毒属(Hanta virus)、登革病毒(Dengue virus)等感染的患者血涂片中均发现了异型淋巴细胞，说明异型淋巴细胞数量的升高对诊断EB病毒感染还缺乏特异性。长期以来，血清法一直是检测及临床诊断EB病毒感染的传统方法，其检测的是人体对病毒的体液免疫 ，但是儿童体液免疫功能尚未发育完善，所以测定的抗EBV 抗体阳性率普遍偏低,4,。EB 病毒衣壳抗原lgM( EB , VCA , lgM)度过窗口期1 , 2 周后， 3 个月。在疾病早期( 1 周内) 检出率较低; 被引起人的免疫应答产生抗体，持续约1 , EB病毒再次感染或免疫抑制的患者通常不表现此抗体的升高，易出现假阴性结果。 因此，即使EB , VCA ,lgM 阴性，也不能排除EBV 感染。荧光定量 PCR 技术是近年来各医院确诊各种病毒感染的一种技术，该技术具有特异性强、灵敏性和准确性高等优点，直接从分子水平反应病毒在体内的复制水平。其操作方法简单，检测速率快，可批量进行临床标本检测。由于EBV 感染人后首先在咽部上皮细胞复制，开始主要表现以呼吸道感染症状为主。用实时荧光定量PCR法检测患者咽拭中EB病毒 DNA ,可以早于通过检测血清抗病毒衣壳抗体来确定EBV 的感染[5] 综上所述，通过荧光定量PCR的检测，发现EB病毒在体内复制水平与异型淋巴细胞的比值成高度正相关，具有诊断意义，但其中也存在着个体差异。荧光定量PCR法检测EB病毒为临床诊断提供真实可靠的依据, 是值得推广的一种技术手段。 参考文献 1. 李中跃,陈洁. 儿童EB 病毒感染190 例临床分析. 临床儿科杂志, 2004; 22 (7) : 439 - 441. 2. 郭龙( EB 病毒与非肿瘤性重症疾病,J,( 中国实用儿科杂志，2008， 23( 1) : 64 , 66( 3 刘瑞明，丁信军，杨晓艳，等(血液异型淋巴细胞检测结果的实验分析,J,( 第四军医 大学吉林军医学院学报，2001，23(2):98,99. 4. Ressing ME，Horst D，Griffin BD， et al( Epstein , Barr virus evasion of CD8( + ) and CD4( + ) T cell immunity via concerted actions of multiple gene products,J,( Semin Cancer Biol，2008， 18( 6) : 397 , 408 5. 陈意援, 鲁莉萍, 邹波. 应用PCR 技术检测小儿呼吸道病原体的研究[ J] . 中国优生与遗 传杂志, 1997, 5 ( 6) : 44 - 45. set up, grasping party building work in non-public economic and social organizations, expanding the coverage of the party building. Conscientiously implement the party members the whole publicity, voting and mobile party members management system, strengthen and improve party