氟康唑,汉防己甲素别作用于氟康唑敏感白念珠菌 的差异蛋白质组学研究

氟康唑,汉防己甲素别作用于氟康唑敏感白念珠菌 的差异蛋白质组学研究 氟康唑,汉防己甲素别作用于氟康唑敏感白念珠菌 的 差异蛋白质组学研究 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 氟康唑/汉防己甲素 分别作用于 氟 康唑 敏感 白念珠菌的差异蛋 白质组学研究 硕 士研 究生 : 谭 方舒 导 师: 张宏 教授/ 主任 医师 博士 暨 南大 学第 一临 床医 学院皮 肤病 与性 病学 教研 室 摘 要 目的利 用蛋 白 质组 学及 生物 信息 学技 术分 析比 较 氟康唑 (fluconazole ,FLC )/ 汉 防己 甲素 (tetrandrine ,TET ) 分别作 用白念 珠菌 (Candida albicans )FLC 敏感 株 前后的 蛋白质 表达 谱差异, 探 讨其抗 真菌/ 增效作用的 ,为寻 找 FLC/TET 作用 于 白念 珠菌 FLC 敏感株 的 靶标蛋白 提供理 论依据 。 方法选 用白念 珠菌 FLC 敏感 株 CA-3 , 连续两 次活化 24 小时 ,分 别收 集 FLC/TET 处理 6 小时 前 后 的细胞 , 提取 总蛋白 , 建 立了 FLC/TET 作用前后 的白念 珠菌 的蛋白质 双向电 泳图 谱, 用 ImageMaster 2D Platinum 图 象 软件进 行比较, 显著性 差异 表达蛋白 质 的筛 选标 准是蛋白 点的差 异倍数在 2 倍 以上 。 利用串 联飞行 时间质 谱 MALDI-TOF/TOF-MS 对候选 差异 表达 蛋白做 肽质量 指纹(PMF)和 MS/MS 质 谱鉴定 。应用 生物 信息学, 通过数 据库 的查找分 析,对 差异表 达蛋白 进行了 功能分 类和 其它 初步 分析。 结果 建立了 FLC 作用前后 CA-3 细胞的双 向凝胶 电泳图 谱,鉴 定了 17 个差异表达 蛋白, 下调的 有 Mpg1p 、Acs2p 、Pil1p 、Pyk1p 、Gap1p 、Xyl1p 、Asn1p 、Ndk1p , 上调的 有 Act1p 、 Fum11p 、Adh1p 、Bat21p , 这些蛋 白涉 及细胞 壁甘 露聚糖 、细 胞膜脂 类如麦 角甾醇 和鞘 脂 类物质的 合成、 细胞骨 架 、 糖 代谢、 氨基酸 和核酸 合成、 发酵 作 用等 。 建立了 TET 作用前后 CA-3 细胞的双 向凝胶 电泳图 谱,鉴 定了 18 个差异表达 蛋白, 下调的 有 Aco1p 、Acs2p 、Asn1p 、Gpi1p 、Fum11p 、Pyk1p 、Mpg1p 、Tdh1p 、Dut1p 、Act1p 、 Bat1p 、Rdi1p ,上调 的有 Pyk1p 、Adh1p 、Rdi1p 、Xyl1p , 这些蛋 白 涉 及细胞膜 信号传 导、 细胞骨架 、 糖代 谢、发酵 等 。I 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 结论 4.1 FLC 可以下 调白念 珠菌细 胞壁甘 露聚糖 、 细胞 膜脂类 如麦角 甾醇 和鞘脂类 物质的 合成 通路上的 蛋白 酶 Acs2p 、Pil1p 、Mpg1p 的表达 。 4.2 FLC 可以上 调白念 珠菌细 胞骨架 结构蛋 白 Act1p 的表 达。 4.3 FLC 处理后 的白念 珠菌细 胞表达 的差异 蛋白质 涉及糖 代谢、 发酵 作用、氨 基酸合 成、 核酸合成 的重要 蛋白酶 。 4.4 TET 可以下 调白念 珠菌膜 信号传 导相关 的 Rho GTP 酶 调控因 子 RhoGDI 的 表达。 4.5 TET 可以下调白念 珠菌由 钙依赖 的膜信 号调控 的细胞 骨架 结 构蛋 白 Act1p 的 表达。 关 键词 : 氟康唑 汉防己 甲素 氟康 唑 敏感 白 念珠菌 蛋 白质组 学II 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 Proteomic analysis of the effects of fluconazole/tetrandrine againstfluconazole-susceptible Candida albicans respectively Master Candidate: TAN Fangshu Supervisor: Professor/Chief Physician Zhang Hong, PhDDermatology and Venereology, The First Clinical Medical College of Jinan UniversityAbstract ObjectiveTo identify and analyze differentially expressed proteins fluconazole-susceptible Candida albicans CA-3 cells before and after treatment of FLU/TET by proteomics and bioinformatics, to explore its anti-candida albicans mechanisms, then to afford the theory evidence of searching the targeted proteins for FLU/TET treating Candida albicans cellsMethodsFLC/TET treated CA-3 cells for 6 hours, then FLC/TET treated and untreated CA-3 cells were collected. Total proteins of the four groups were extracted, respectively. The two-dimensional gel electrophoresis maps of CA-3 cells line before and after treated by FLC/TET were establish. Then compare and identify differentially expressed proteins which have multiple differences more than two times of the protein spots as a significant difference in protein expression screening criteria by imagemaster 2-D platinum image analysis softwareTandem time of flight mass spectrometry MALDI-TOF/TOF-MS was used to identified Peptide mass fingerprintPMF and MS/MS identification of right candidate differentially expressed proteins. The differentially expressed proteins were analyzed the functional classification by bioinformatics and database searehing ResultsThe two-dimensional gel electrophoresis maps of CA-3 cell before and after the FLC treated were established, 17 differentially expressed proteins were identified, lowly-expression proteins including Mpg1p 、Acs2p 、Pil1p 、Pyk1p 、Gap1p 、Xyl1p 、 Asn1p 、Ndk1p, while highly-expression proteins including Act1p 、Fum11p 、Adh1p 、Bat21p. These proteins are involved in the biosynthesis of cell wall mannosan and cell membrane lipids 、the biosynthesis of amino acid and nucleotide 、cytoskeleton 、glycometabolism 、 fermentation related proteaseThe two-dimensional gel electrophoresis maps of CA-3 cell before and after the TETIII 暨南大学硕士学位论文氟康 唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 treated were established, 18 differentially expressed proteins were identified, lowly-expression proteins including Aco1p 、Acs2p 、Asn1p 、Gpi1p 、Fum11p 、Pyk1p 、 Mpg1p 、Tdh1p 、Dut1p 、 Act1p 、 Bat1p 、 Rdi1p, while highly-expression proteins including Pyk1p 、 Adh1p 、 Rdi1p 、 Xyl1pThese proteins are involved in the signal transduction 、cytoskeleton 、glycometabolism 、 fermentation related proteaseConclusions1Fluconazole can downregulate the expression level of the biosynthesis related protease of cell wall mannosan 、cell membrane ergosterol and scabbard lipid: Acs2p 、Pil1p 、Mpg1p of Candida albicans2Fluconazole can upregulate the expression level of the Actin cytoskeleton of Candida albicans3The differentially expressed proteins after treatment of Fluconazole involved the biosynthesis of amino acid and nucleotide 、glycometabolism 、 fermentationrelated protease4Tetrandrine can downregulate the expression level of RhoGDI which is regulation factor of Rho GTPase of Candida albicans 5Tetrandrine can downregulate the expression level of actin cytoskeleton which regulate by Calcium-dependent transmembrane signal transduction of Candida albicans Key wordsFluconazole; Tetrandrine; Fluconazole susceptible; Candida albicans; ProteomicsIV 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作 用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 目录 摘 要. I ABSTRACT.III 前言..1 1 白色念 珠菌感 染的流 行病学..1 2 常见抗 真菌药 物分类..2 3 白念珠 菌对唑 类药物 的耐药 现状..3 4 白念珠 菌对唑 类药物 耐药机 制的研 究进展.4 5 白念珠 菌钙- 钙 调蛋白 依赖途 径的研 究进展..5 6 药物间 联合抗 白念珠 菌的研 究进展.6 7 汉防己 甲素的 研究进 展.6 8 蛋白质 组学的 研究进 展9 9 白念珠 菌蛋白 质组学 的研究 进展11 10 本研究的 内容、 创新性 及意义. 12 第 一部 分 氟康 唑 作 用于 氟康 唑敏 感 白 念珠菌 的差 异蛋 白质 组学 研究. 13 1 和 方法. 13 2 结果. 22 3 讨论. 24 3.1 本部分 研究目 的、相 关基础 和新颖 之 处24 3.2 实验菌 株的来 源和意 义. 25 3.3 FLC 用药浓 度的确 定 25 3.4 酵母相 白念珠 菌破壁 方法的 确定26 3.5 双 向电 泳后差 异蛋白 出现的 原因和 意义26 3.6 本结果 可能相 关的机 制. 26 3.7 本研究 的意义 和展望. 30 第 二部 分 TET 作用于 氟 康唑 敏感 白念 珠菌 的差异 蛋白 质组 学 研 究31 1 材料 和方 法31 2 结果. 31 3 讨论. 33 3.1 本研究 目的、 相关基 础和新 颖之处. 33 3.2 TET 剂量的 确定34 3.3 本结果 可能相 关机制341 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲 素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 3.4 其它蛋 白的解 释. 39 3.5 本 研究 的 意义 和展望39 结论40 缩 略词 列表41 参 考文 献 42 附录57 致谢582 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑 敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 前言 白念珠菌 (Candida albicans ,CA ) 又称 白假丝 酵母, 归 属半知菌 亚门- 芽孢菌纲- 隐球 酵母 菌目- 隐 球 酵母 科- 念珠 菌属 , 常寄 居在 人 体口 腔、 肠 道和 皮肤 等 处, 是一 种 常见 的条 件致病菌, 可引起 皮肤黏 膜念珠 菌病、甲 念珠菌 病及深 部念珠 菌病, 甚至引起 威胁生 命的 [1] 系统性念 珠菌病 。 由于 人口 老龄化 严重,肿瘤 、艾滋 病 等免 疫功能 缺陷相 关疾病 的患者 增加,抗生 素药 物、器官移 植广泛 应用于 临床,植 入性医 学材料 如人工 关节、人 工心 脏瓣膜 的 应用和 各种 [1-9] 导管技术 的开展 ,真菌 感染的 发生率 呈上升 趋势, 白念珠 菌是最 常见 的致病菌 。 氟康唑 (fluconazole ,FLC )是广谱的唑类抗真菌药物,具有临床疗效明显、安全、 服用方便 等优点 , 目 前是临 床治疗 真菌病 的一线 药物 。 随 着 FLC 的 大 剂量 长期 、 广 泛使用 , [11-19] 临床逐渐 发现了 对其耐 药株 。 因此 , 解 决临床 上因耐 药株感 染而 导致治疗 失败的 有效 途径之一 就是寻 找抗真 菌药物 的增效 剂,逆 转白念 珠菌对 唑类药 物的 耐药性。 有研究发 现, 汉防己 甲素 (tetrandrine ,TET ) 作为 一种 钙 拮抗 剂 能抑 制心肌或 者血管 2+ 2+ 细胞外 Ca 内 流和细 胞内 Ca 动 员, 保 护细胞 免受毒 物及缺 血再灌 注 损伤, 还可以 通过抑 制肿瘤耐 药细胞 表面 P- 糖 蛋白(P-gp )的过 度表达, 增加化 疗药物 在 肿瘤细胞 内的蓄 积, 增强肿瘤 细胞对 化疗药 物的敏 感性。除 外,它还 具有抗 炎、免 疫抑制 、解热镇痛 等作用 而 [20-23] 被广泛应 用于抗 高血压、 抗矽肺、 中药麻 醉等 方面 。因人类 肿瘤 细胞与白 念珠菌 的药 物外排泵 的结构 功能相 似, 我们 推测,TET 也可 以 逆转白 念 珠菌 对 FLC 等唑 类药物 的耐药 [24] 性。 我 们前期 研究表 明 TET 能减少 白念珠 菌对 Rh123 的外排 , 能下调 外排基 因 MDR1 、 Flu1 、CDR1 、CDR2 和唑类 药靶基 因 ERG11 的表达, 在 体内、 外 TET 也可以 增效 唑类药 物抗白念 珠菌的 活性 。 本课以 白念珠 菌 FLC 敏感 株 CA-3 为研 究对象 ,通过 蛋白质 组学 相关技术 , 研究 FLC/TET 单独 作用于 白念珠 菌 前后 的差异 蛋白, 探 讨 药物 压力 是 否能 引起与药 物机制 相关 的蛋白质 发生 改 变, 或者发 现 新的 作用靶 点 。 为 白念珠 感染 的 临床用 药 治疗 提供 理论依 据, 为唑类药 物增效 剂的开 发和研 究提供 思路。 1 白念珠菌感染的流行病学 近几十年 来,随 着人口 老龄化 ,恶性 肿瘤 、 艾滋病 等免疫 功能 缺 陷疾 病患者的 增加, 广谱抗生 素、免疫 抑制剂的 大剂 量 使用, 骨髓、 器官抑 制和侵 入性检 查设备 的 开展,真 菌 1 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 感染的发 生率呈 上升趋 势, 白念 珠菌是 最主要 的 致病 菌,是 ICU 患者 和 AIDS 患者 死亡的 [1-9] 主要原因 。 我国真菌 病病原 学 10 年(1986~1996 ) 动态流行病学 研究表 明,白念 珠菌的致 病真菌 [2] [3] 中的构成 比从 1986 年的第 5 位上到 1996 年的第 2 位 。吴安华等 从 94723 例住院患者 中分离 出 病原 菌 1955 株, 真菌 470 株 占 24.04% (470/1955 ) , 其 中白念珠 菌 203 株 占 10.38% [4] (203/1955 ) 。徐红云 等 从 2003~2007 年间住院患者中 分离得 到 的 6289 株病原菌, 真菌 411 株占 7.0% (411/6289 ) ,白念珠 菌 390 株 占 88.4% (390/441)。 [5] Wilson 在 1998 年的调查结果显示 ,美国 的系统 性真菌 病发病 率为 30.6/10 万,其中 [6] 念珠菌感 染 75% 。 Pfaller 等 研究美国 这些年 的侵入 性念珠 菌感染 显示 , 死亡 率接 近 0.4/10 [7] 万, 致病 菌以 白 念珠菌 为首 。Al-Tawfiq 等 发现 1996~2004 年间沙特阿拉伯的 医院 的 真菌 [8] 血症 中, 白念珠 菌为致 病菌的 占 53% , 总病死 率 为 43% 。Akbar 等 对一综合 性医院 念珠 菌血症的 流行病 学、危险 因素和 发病 率的 预测,念 珠菌血 症已逐 渐成 为住院病 人死亡 的重 要原因之 一,其 中 中心 静脉导 管留置 人群中 发生率为 87% ,重症 监护 房(ICU )为 77% , [9] 广谱抗生 素治疗为 74% ,在 分离的 念珠菌 中,白 念珠菌占 71% 。Luque 等 研究发现 口腔 念珠菌分 离率在 101 例 HIV 阳性患者 明显高 于对照 组 108 例 HIV 阴 性,且白 念珠菌 所占 比最高, 分别 是 60.7% (阳 性组) 和 73.9% ( 阳性组 ) 。 由于 受地 域差异、 气候环 境、宗 教习俗等 影响, 不同国家、地区 甚至 不同时间 所报道 的真菌感 染的发 病率和 致病菌 构成比 不全相 同, 但 真菌感 染已经 成为 一个严重 的公共 卫生 问题。 2 常见抗真菌药物 的分类 目前能够 有效治 疗真菌 感染的 药物,根 据药物 作用部 位、作用 机制的 不同 ,临床 上主 要的几类 见表 1 ( 不包括 新型抗 真菌药 物) 表 1 临床 上常见 抗真菌 药物分 类 靶点 作 用机 制 例 举常 见药 物 真 菌细胞膜 脂质麦角 甾醇 干扰麦角甾 醇的合成 14 α 去甲基化酶 (14DM)抑 抑制 14-DM 的催化活性,阻止羊毛固醇 与 14-DM 接触,造 三唑类: 氟康唑、 伊曲康 制剂 成羊毛甾醇不 能转化为 14- 去甲基羊 毛甾醇 ,而 使真 菌细胞 唑 ;咪唑类:酮康唑 [12] 膜合成受阻, 导致真菌细胞破裂死亡 。 图 1 途径的 B 环节 。2 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 [13] 角鲨烯环氧化酶抑制剂 通过抑制角鲨烯环氧化酶,减少真菌中麦角甾醇的合成。 图 丙烯胺类:特比萘芬 1 的 A 环节。 14 7,8 ? 双键 还原 酶和 ? 异构 可同时抑制次麦角固醇转化为麦角固醇中的 这 两个关键酶, 吗啉类:阿莫罗芬 化酶抑制剂 使麦角固醇合成大量减少 。图 1 的 C 环节。 破坏麦角甾 醇的结构 与细胞膜脂质双分子层中的麦角甾醇和胆固醇结合后产 生微 多烯类两性霉素 B 及其 孔,使细胞内物质外溢,导致细胞死亡,具有杀菌作用。 脂质体 作 用于真菌 细胞壁 [14] β -1,3- 葡聚糖 通过非竞争性抑制 β -1,3- 葡聚糖合成酶, 破坏真菌细胞壁 β - 棘白球类: 卡泊芬净、 米 [15] 葡聚糖的结构,导致真菌细胞死亡,具有杀菌作用。 可芬净 [15] 几丁质 干扰了细胞壁主要的支架结构几丁质的合成。 多氧霉素 D 和尼克霉素 [16] Z 和 X 甘露聚糖、 甘露聚糖- 蛋白质 与甘露聚糖及其复合物桥接,使其空间结构改变,引起细胞 普那米 星 、benamomicin [17] 复合体 壁破裂。 类药物 通过真菌细胞的酶系统进入细胞内,转换为氟脲嘧啶竞争性 5- 氟胞嘧啶 影 响真菌核 酸的合成 [18] 干扰真菌 RNA 、DNA 和蛋白质的 合成 。 [11-12] 图 1 麦角甾 醇的生物合成 3 白念 珠菌 对唑 类药 物的 耐药现 状 在上述不 同作用 机制的 药物中 ,FLC 具 有生物 利用度 高、安全、使用 方便、 组 织渗透 好等优点 , 目前 是临床 上治疗 念珠菌 病疗效 确切的 一线药 物。 但 是随 着 FLC 的 大剂量 、 长 期、广泛使 用,对其 耐药 的 白念珠 菌有增 多趋势, 并且出 现了与 多 种 唑类抗真 菌药物 交叉 [19-22] 耐药 株 。 研究发现 , 白念 珠菌耐 药现象 在 HIV 阳性、 器官移 植后或 血液病 患者 中 较普通 人群中 [23-25] [23] 少见 。Hajjeh 等 对从念珠 菌血症 患者提 取的 1143 株白念 珠菌进 行 FLC 药 敏实验 , [24] 发现只 有 1.2% 的 菌株耐 药。Lee 等 对 1137 株临床白念 珠菌进 行了 FLC 药敏 实验, 发现 [26] 只有 5 株 剂量依 赖性敏 感, 没发现 耐药 株。 Magaldi 等 从 HIV 阳性病 人口腔中 分离 出 108 株白念珠 菌,在无 FLC 用药史 患者的 41 株中,FLC 耐药株 占 10% (4/41 ) ;在有 FLC 用 药史患者 的 67 株中,FLC 耐药 株占 44.7% (30/67);而 总 的耐药 菌株 中,有 93.3% 对 伊曲 3 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 康唑交叉 耐药。 4 白念珠菌对唑类药物耐药机制的研究进展 目前,白念 珠菌对 唑类药 物产生 抗药性 的机制 已经明 确的有 : (1 )真菌 细胞膜 转运蛋 白对 药 物 的外 排 的 作用 增 强 ;(2 ) 麦 角甾 醇 生物 合 成 通路 中 关 键靶 酶的 变 化;(3 )生 物 膜的形成 。 4.1 膜 转 运 蛋白 的过 度表 达 白 念 珠菌 膜 转 运 蛋白 高 表 达, 使 白 念 珠菌 对 药 物外 排 能 力 增强 , 导致 真 菌 细胞 内 药 [31] 物有效浓 度降低, 是产生 耐药性 的主要 原因之 一 。 目前与白念 珠菌 药物外排 有关的 膜转 运蛋白有 两大类 : 一类 是易化 扩散载体 超家族 (major facilitator superfamily, MFS ) , 另一类 是 ABC 转运 蛋白超家 族 (ATP-binding cassette transporters, ABC transporters ) 。 4.1.1 ABC 转 运 蛋 白超 家族 ABC 转运 蛋白 是最 重要 的外 排泵, 它们 拥有 相似 的结 构和 功能 ,均能 通过水 解 ATP [33] [34] 供能把多 种物质 泵出细 胞外 , 与药物的 耐药密 切相关 。 在目 前发 现的十多 种白念 珠菌 [35][36] 耐药(CDR )蛋白 中,与 唑类药 物耐药 有关 只有 CDR1 和 CDR2 蛋白。 [36][37] Sangland 等 发现,FLC 的 MIC 值高 的菌株 其 CDR1 表达 也高,CDR1 高表 达的 耐药株 中 CDR2 也 增高, 同 时敲 除 CDR1 和 CDR2 的白念 珠菌比 单独 敲除 CDR1 的菌株 对 [38] FLC 更加敏 感 , 但 单独敲 除 CDR2 的耐 药株 对 FLC 的 敏感性 并无增 加 。White 等 对一系 列白念珠 菌研究 发现 ,FLC 耐 药株 的 CDR1 表 达量约 为敏感 株及剂 量 依赖株 的 5 倍 。 孙伟 [39] 玮等 研究发现 FLC 耐药菌株 CDR1 和 CDR2 高表达发 生率显 著高 于敏感菌 株, 证 明白 念珠菌临 床分离 株对 FLC 的耐 药性 与 ABC 转运 蛋白过 度表达 相关, 而 加入葡萄 糖供能 后, 增加了 CDR1 和 CDR2 高 表达的 耐药菌 株 对 罗 丹明 的 外排能 力 , 证明 可能存在 其它耐 药机 制。 4.1.2 易 化 扩 散载 体超 家族 Mdr1p 和 Flu1p 是 现阶段 已经明 确与白 念珠菌 耐药性 有关的 主 要 MFS 蛋白。Mdr1p 的 [31][40] 高表达, 使药物 从胞内 泵出增 多,胞 内的有 效浓度 减少, 导致真 菌 耐 药 。研究表明, 该基因在 唑类药 物耐药 株中 较 敏感株 高表达 ; 敲除 MDR1 高表 达 的耐 药 株的该 基因后 , 突 [41] [42 ] 变子对唑 类药物 的敏感 性增加 。Calabrese 等 在白念珠 菌中鉴 定了 FLU1 基 因, 其编 码 蛋白与 Mdr1p 氨基酸 序列相 似, 高 表达能 增强白 念珠菌对 唑类药 物的 耐药性, 但是敲 除该 基因增强 菌株对 药物的 敏感性 甚微。4 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 [27-29] 4.2 编码靶酶 ERG11 基 因 突变 及过 度表 达 ERG11 基因 (亦 称 CYP5 基 因) , 是唑 类抗真 菌药作 用靶 酶 14 α - 去甲 基化酶 (14-DM ) 的编码基 因, 该酶 是麦角 甾醇生 物合成 的关键 酶。麦角 甾 醇是 细胞膜 的主要甾 醇 成分, 与 [31] 膜结构完 整性 、 细胞 活力 、 膜 结合酶 的活性 以及物 质运输 等起重 要作 用 。 长期大量 使用 唑 类药 物 , 白念 珠 菌 会 在不 断 适 应环 境 的 过 程中 产 生 一 些变 化 ,ERG11 基因 点 突变 ,基 [27] 因过度表 达 ,导致 14- DM 突变 或 过量 表达; 或通过 14- DM 的结 构改变,使 其与 唑 类 [32] 抗真菌药 的亲和 下降; 或由 于 ERG11 基 因突变 使唑类 抗真菌 药作用 的靶酶增 多 ,最终 [30] 产生耐药 。麦角 甾醇耗 竭时 ERG11 的过度 表达可能 是一 种反馈 机制 。 4.3 生 物 膜 的形 成 白 念 珠 菌 的 生 物 膜 同 细 菌 相 似 , 是 细 胞 黏 附 于 物 体 表 面 , 自 身 产 生 的 细 胞 外 基 质 [43] [44] (extra cellular matrix ,ECM ) ,表 现出高 度的耐 药性 。Ramage 等 对白念珠菌进 行药 物敏感测 定,FLC 对 7 株受试 菌株的 MIC 值范 围为 0.25~16 μ g/mL ,形成生 物膜后 ,其 SMIC 值均>1024 μ g/mL 。 生 物膜细胞 密度较 高、 低生长 率、 屏 障作 用、 免疫 防御等 与生 50 [89] 物膜耐药 机制相 关 。 5 白念珠菌钙- 钙调蛋白依赖性途径的 研究进展 白念珠菌 耐药机 制是多 方面、共 同作用 的结果。 除开上 述机制 外, 本 实验小组 成员袁 [86] 2+ 少辉 在前期研究 中还探 讨了白 念珠菌 钙- 钙调 蛋白依 赖性途 径(Ca -CaM 依赖性 途径) 与耐药的 相关性 。 5.1 白 念珠 菌钙 调蛋 白及其 功能 2+ 在膜介导 的信 息传递 中,钙- 钙调 蛋白依 赖性途 径(Ca -CaM 依赖性 途径)是 白念 珠 [46-52] 菌细胞内 最重要 的 钙 依 赖性生 理过程 。 钙 调蛋白(calmodulin ,CaM )为钙 结合蛋 白, [57] [46] [47] [48] [48][58] [58] 在酵母之 间高度 同源, 功能相 似 : 双相转 化 、 细胞周期调 控 、 脂类生成 、 [50][59] [50] [51] 应激反应 、毒力 、细胞壁的生成 。 2+ 除此之外 ,研究 发现抑制 Ca -CaM 依赖性 途径可 以增效 唑类药 物抗 白念珠菌 活性, [53-56] [53] 逆转其耐 药 :Krajewska 等 发现 CaM 抑 制剂与 酮康唑 有协同 抗 白 念珠菌 作用 , 他们 分别用氯 丙嗪、 左美丙 嗪和氟 哌啶醇 联合酮 康唑抗 66 株 临床分 离的 白念珠菌 ,发现 联合 [54] 组酮康唑 MIC 值远远 小于酮 康唑单 独用药 组。同样 Bulatova 等 人单独使用 FLC 抗 白念 珠菌 株 (ATCC90028 )MIC 为 5.5 μ g/mL , 临床分 离株 MIC 为 0.55 μ g/mL , 而联 合氯 丙嗪用药 后的 MIC 分别为 0.76 μ g/mL 和 0.008 μ g/mL 。 外排 泵的调 节:研究 表明,CsA 5 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 有抑制 ABC 转运蛋白 的作用, 但是 CsA 联合 FLC 有协同 抗白念 珠菌 作用的机 制不是 单纯 [52] 通过抑 制 ABC 转运蛋 白实现 的 。 5.2 白 念 珠菌 钙调 蛋白 作 用靶 点 2+ CaN 是研究 最多 的 Cmd1p 的靶蛋 白, 也是 细胞内 唯一依 赖 Ca -CaM 的 丝氨酸/ 苏氨酸 [60] 2+ 蛋白磷酸 酶 ; Dhillon 等 鉴定和纯化 了一种 分子量 约为 69KDa 的依 赖 Ca -CaM 蛋白 激酶 , 2+ 该蛋白在 Ca 和 CaM 存在的 条件下 可以自 身磷酸 化,也 能磷酸 化一 大批内源 性的白 念珠 菌蛋白, 从 而发挥 广泛的生 理生化 作用;Spc110p ( 又称 Nuf1p ) 也是 钙调蛋白 重要 的 靶蛋 白, 钙调蛋 白 通过 与该蛋 白 C 端的 特殊结 构结合 而发挥 生物学 效应。 该结合位 点的突 变会 [61] 导致细胞 有丝分 裂时纺 锤体不 能形成 ,最终 导致细 胞死亡 。 6 药物间联合抗白念珠菌的研究进展 6.1 抗 真 菌 药物 联合 使用 (见 表 2 )表 2 常见抗 真菌药 物联合 使用抗 白念珠 菌 联 合用药 观察 指标 结果 特比萘芬+ 伏立康唑 白念珠菌(对 FLC 和伏立康唑交叉耐药) 51% 的 菌株协同,41% 的菌株相 加,无 [64] MIC 拮抗作用 [65][66] FLC+ 氟胞嘧啶 白念珠菌 MIC 协同作用[67] 卡泊芬净+ 两性霉素 B 脂质体 系统性光滑念珠菌感染的小鼠的预后 预后明显改善 [68] 卡泊芬净+ 特比萘芬 动物体内乳酒念珠菌感染 的预后 协同作用 6.2 抗 真 菌 药物 和增 效剂 的联 合 抗真菌药 物的增 效剂本 身或低 浓度时 并不具 有抗真 菌作用 , 却可 以增 加其它抗 真菌药 物的抗菌 活性。 非细胞 毒性剂 量(本 身对细 胞生长 没有影 响)的 CaM 拮抗 剂( 氯丙嗪 、 [53] 氟哌 啶醇 、 左美 丙 嗪) 在体 外 可以 增 加酮 康唑 抗 白念 珠 菌的 活性 。 同样 ,CsA 、FK506 [55][56][69][70] 等也有增 效作用 。环孢霉素除 了在体 外可增效 FLC 抗 白念 珠活性, 在小鼠 白念 [69] 珠菌心脏 、 肾 脏感染 模型中 , 联 合使用 能提高 治疗的 有效率 。 研究 证实 FK506 、GP382 、 [70] 环孢霉素 的增效 作用 是 通过抑 制 Cdr1p 、Cdr2p 完成的 。 7 汉防己甲素 的 研究进展 汉防己甲 素 (tetrandrine ,TET ) 又称粉 防己碱 , 是 从防己 科千金 藤属 植物粉防 己的块 根中分离 出的 一 种生物 碱,分 子式 C H N O , 如图 2 。TET 是一种 钙 拮抗剂 , 可以 拮抗 33 42 2 6 6 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 [71][72] CaM,又 可以非 选择性 阻滞钙 通道 。 其药理作用十 分广泛 , 有解 热镇痛、 抗炎、 利尿 、 抗过敏休 克的功 效,近 几十年 临床上 用于肺 纤维化 、缺氧 性肺动 脉高 压、矽肺 、高血 压、 [73] 心绞痛、 肝 硬化及 眼科疾 病的治疗 。 而今年 来的研 究表明,TET 作 为增效剂 对逆转 药物 的多药耐 药有良 效。图 2 TET 结构 式7.1 TET 作为唑类 抗 真菌 药物 增效 剂的 研究 进展 7.1.1 体 外 药 敏实 验 我们参照 美国国 家临床 实验室 标准化 委员会 (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI ) 推荐 的 M38-A 方 案进行 大量的 体外药 敏实验, 见表 3 。 药 敏实 验 结果 差 异均有 统计 学意义。 表 3 本实 验小组 前期体 外药敏 实验结果 菌株 状态 TET 最大 单独/ 联合用 药 MIC 范围 下降 非 细胞毒性 ? 单独/ 联合用 药 ? 梯度 [82-84] 白念珠菌 酵母相 30 FLC/FLC+TET 0.25~ 64/ 0.125~16 1~2 [82,85,86] 白念珠菌 菌丝相 2 FLC/FLC+TET 0.25~64/ 0.125~8 1~3 [87,88] 白念珠菌 酵母相 30 酮康唑/ 酮康唑+TET 1~32/ 0.0038~0.25 7~8 [89] 白念珠菌 生物膜 0h 30 FLC/FLC+TET ? 0.25~64/ 0.125~16 1~2 [89] 白念珠菌 生物膜 4h 30 FLC/FLC+TET ? 8~256/ 1~64 2~3 [89] 白念珠菌 生物膜重悬 30 FLC/FLC+TET 0.25~64/ 0.125~16 1~2 [90] 40 0.250~2/ 0.0313~0.0625 3~5 红色毛癣菌 分生孢子 益康唑/ 益康唑+TET [91] 红色毛癣菌 分生孢子 40 联苯苄唑/ 联苯苄唑+TET 0.25~1/ 0.0313~0.0625 3~4 注: ?处 测得的是 附着状态微生物的最小抑菌浓度 (sessile minimum inhibitory concentration, SMIC)。 ?处单位为 μ g/mL 。7 暨南大学硕士 学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质 组学研究 7.1.2 其 它实 验(见表 4 ) 表 4 本实 验小组 前期研究(不 包括药 敏和蛋 白质组 学实验 ) 处理 研 究对象 结果 体外实验 ? 流式细胞术和荧光光度 白念珠菌酵母相/ 菌丝相用药前后 Rh123 阳 TET 可以增加细胞内 Rh123 的蓄积, 减少其 [85] 计法的蓄积/ 外排实验检 性细胞率 外排 ?RT-PCR TET 30 μ g/mL 作用白念珠菌 酵母相 24h (h ) 所有菌株用药后外排基因低表达, 敏感株的 [84][92] 前后药物外排 基因 MDR1 、Flu1 、CDR1 、 ERG11 低表达 CDR2 及药靶基因 ERG11 的表达 ?RT-PCR TET 2 μ g/mL 作用白念珠菌菌丝相 , 观察 指 用药后外排泵基因 和药靶基因均 受到抑制 [86] 标同?动物体内实 验 ? 小鼠白念珠菌阴道炎模 阴道内 TET 和 FLC 高剂量 26mg/kg? d、低 高剂量 TET 联合高剂量 FLC 用药组真菌载 型 剂量 13mg/kg? d 不同 组合 给药 ,观察 小鼠 量较单独使用高剂量 FLC 组明显降低,未 阴道灌洗液的真菌载菌量、 涂片镜检和阴道 见假菌丝, 且黏膜水肿、 炎细胞浸润较其它 [88][93] 组织病理学检 查 组的情况较好 ? 豚鼠皮肤须癣毛癣菌的 外用 TET、联苯苄唑霜剂单独和联合用药 联合用药组较联苯苄唑单独用药组, 皮损评 [94] 皮肤癣菌模型 (浓度均为 1% ) , 观察指标为皮损评分、 皮 分低,真菌学转阴早 2 天,炎症反应轻 损真菌学检查和皮损病理学检查 ? 豚鼠皮肤须癣毛癣菌的 外用 TET 、 益康唑霜剂单独和联合用药 (浓 联合用药组皮损毛根侵犯试验、 皮损直接接 皮肤癣菌模型 度均为 1% ) , 观察指标为皮损表现 (皮损评 种法的培养阳性率明显降低; 菌落形成单位 分) 、病 原学( 毛根 侵犯试 验、 菌落 形成单 计数法的培养阳性数明显减少; 病理组织中 位计数法、皮损直接接种法) 、病理学检查 真菌菌丝和 孢子、 炎症反应和组织破坏程度 [90][95] 明显减轻 人体体内实 验 ? 单纯性阴道念珠菌病患 阴道后穹窿放置栓剂,1 次/ 天,连续 7 天, 联 合用药组的临床症状、体征如外阴瘙痒、 者 FLC (50mg ) 联合 TET (150mg ) 栓与单独 黏膜红肿和分泌物异常等缓解提前, 且临床 [96][97] 使用 FLC (50mg )栓 ,观察 临床疗 效、微 症状、真菌清除率和总体疗效较高 生物学指标 ? 皮肤癣菌病(体癣、股 外用 2%TET 联合 2% 酮康唑霜与单独使用 联合用药组在治疗 中的各项指标 均有差异 [96]癣、手足癣)患者 2% 酮 康 唑 ,观 察 临床 症 状 体征 和 微生 物 学 指标 注: 各项实验 在 TET 最大非细胞毒性及对临床有效率及真菌清除率均无影响的前提下进行 ; 指 标的 差异均有统计学意义 。 人体体内实验未发现明显的 不良反应。8 暨南大学硕士学位论文氟康唑/ 汉防己甲素 分别作用于氟康唑敏感白念珠菌的 差异蛋白质组学研究 7.1.3 蛋 白 质 组学 实验 [98][99] 王志远 等 以白念珠菌 FLC 敏感 株 CA-3 为实验 对象, 尝试 用 3 种 裂解方法 分别裂 解,用 Bradford 法 测定总 蛋白 、SDS-PAGE 电泳后 分辨蛋白 质、相差 显微镜镜 下观 察 3 种 [98] 途径, 得 到了 提 取白念 珠菌总 蛋白的 优化方 法。 王志远 等 用同一亲本 的 FLC 敏 感和耐 药 株为实验 对象 , 通过 优化方 法提取 总蛋白 , 二 维聚丙 烯酰胺 凝胶电 泳 技术 (2-DE ) 分析总 蛋白图谱 上的差 异蛋白 , 再 以基质 辅助激 光解析 串联飞 行时间 质谱仪 (MALDI-TOF/TOF ) [99] 鉴定差异 蛋白 , 结果鉴 定出了 与耐药 相关的 蛋白 。 吴斯等 用 FLC ( 终浓度 750 μ g/mL ) 单独/联合 TET (终浓 度 250 μ g/mL ) 作用 CA-3 号菌 株 6h , 通 过 2-DE 和 MALDI-TOF/ TOF , 进行差异 蛋白质 研究, 结果显 示 FLC 可能通 过影响 白念珠 菌细胞 壁的 合成以及 抑制细 胞的 糖酵解、 能量代 谢等相 关的生 化反应 ,达到 协同 FLC 增效 的作用 。 7.2 TET 作 为 抗 肿瘤 药物 增效 剂的 研究 进展 (见 表 5 ) 表 5 TET 的 抗肿 瘤药物 增效剂 的实验 研究 处理 研 究对象 结果 体外实验 [74] TET+ 表柔比星 人 类 乳 腺 癌 多 药 耐 药 细胞周期停滞在 G2-M 期,细胞分裂受限 MCF-7/ADM 株 TET+ 顺铂/ 长春新碱 多药耐药的表皮样癌细胞 联 合 用 药 能 增 加化 疗 药 物 在细 胞 内 的 蓄积 而 增 效 化疗 药 物 对 [75] 株 KB-3-1 和 Kb-MRP 的抗癌作用 [76] TET+ 化疗药物 小鼠腹水肿瘤 细胞 能减少诱导细胞多药耐药的发生 [77] TET+ 放射 鼻炎癌细胞 CEN 诱导细胞的凋亡,增加细胞对放射的敏感性 动物体内实 验 TET+ 长春碱(VBL ) 小鼠白血病 P388/ADR 细胞 联合用药在体外能提高细 胞的敏感性, 使 VBL 的 半抑制浓度 [78] (耐 VBL ) 降低了 100 倍,体外也能有效的延长白血病小鼠的寿命 [79] TET+ 顺铂 小鼠移植性肝癌 联合用药能增加顺铂的抑瘤率 人体体内实 验 [80] TET+ 抗肿瘤药物 治疗无效的 22 例急性白血 联合用药后取得好转的 17 例患者中,8 例完全缓解 病和多发性骨髓瘤患者 TET+ 放疗 112 例鼻咽癌患者 每天服用 TET (40mg ) 的治疗组的近期有效 率为 89.3% , 明显 [81] 高于不服用 TET 的对照组 的 69.9%9 暨南大学硕士学位论文氟