益气解毒方调节线粒体途径阻断气虚染毒大鼠鼻咽上皮细胞癌变发生

益气解毒方调节线粒体途径阻断气虚染毒大鼠鼻咽上皮细胞癌变发生 DOC,方便您的复制修改删减 益气解毒方调节线粒体途径阻断气虚染 毒大鼠鼻咽上皮细胞癌变发生 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 作者,孙映求,成细华,田道法,喻嵘,胡伟 成细华 【摘要】 目的 探讨益气解毒方通过调节线粒体途径阻断气虚染毒大鼠鼻咽癌变的发生。方法 72只SD大鼠随机分为模型组、益气解毒方组和维甲酸组。腹腔注射二亚硝基哌嗪(DNP)和佛波醇酯(TPA),同时进行力竭游泳,建立大鼠鼻咽癌变模型,益气解毒方组和维甲酸组分别给予相应药物进行干预治疗,定期分批处死大鼠,取鼻咽组织做病理检测,免疫组织化学SABC法检测蛋白达,RT-PCR检测mRNA的表达。结果 在诱发性鼻咽癌变进程的单纯性增生阶段,与模型组比较,益气解毒方组和维甲酸组大鼠鼻咽上皮细胞的Bcl-2、Bax、Cytochrome-C和Caspase-3蛋白表达差异均无统计学意义(P,0.05)。而在异型增生阶段,益气解毒方组鼻咽上皮细胞的Bcl-2蛋白表达活性显著低于模型组(P,0.05),Cytochrome-C和Caspase-3又分别显著高于模型组(P,0.05),Bax蛋白表达活性虽然高于模型组,但比较结果表明,组间差异却无统计学意义(P,0.05)。在同一病 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 理阶段,各组鼻咽上皮细胞的Bax和Bcl-2 mRNA转录活性与各自蛋 白的表达活性呈现平行趋势。结论 益气解毒方能够有效阻逆大鼠鼻 咽上皮细胞癌变进程,其作用与其有效调节线粒体途径关键基因的表 达密切相关。 【关键词】 鼻咽癌,线粒体途径,益气解毒方,大鼠 Abstract,Objective To investigate the effects of Qi-Boosting Toxin-Resolving Formulae (QBTRF) by regulating mitochondrion pathway in the developing process of nasopharyngeal carcinogenesis among rats. Methods 72 SD rats were randomly divided into model group, Qi-Boosting Toxin-Resolving Formulae (QBTRF) group, vitamin A acid group. All these animals were subcutaneously injected in axillary fossa with N, N’ -dinitrosopiperazine (DNP) and 12-O-tetradecanoylphorbol (TPA) in combination with exhausted swimming to establish the model of nasopharyngeal carcinomas. QBTRF was given to intervention. Samples were fixed in 4% neutral paraformaldehyde for pathohistological evaluation, and the protein expression were detected by SABC immunohistochemical and mRNA expression were detected by RT-PCR. Result In the simple hyperplasia stage of induced cancerous transforming lesion in the nasopharyngeal epithelia, no significant difference were determined in the expressing activities of Bcl-2, Bax, Cytochrome-C and Caspase-3 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 in QBTRF group and vitamin A acid group (P,0.05), compared with the model group respectively. At the pathological stage of atypical hyperplasia, the expressing activity of Bcl-2 was significantly lower (P,0.05) and the activities of Cytochrome-C and Caspase-3 were significantly higher in QBTRF group than that of model group (P,0.05). Though the expressing activity of Bax was higher in QBTRF group than that of model group, no significant difference was determined between them (P,0.05). There was a parallel tendency of expressing activity in either Bax mRNA or Bcl-2 mRNA with Bax or Bcl-2 itself respectively in any stage of pathology. Conclusion The anticancer effect of QBTRF was realized by regulating mitochondrion pathway in the developing process of carcinogenesis among rats. Key words,nasopharyngeal carcinomas,mitochondrion pathways,Qi-Boosting Toxin-Resolving Formulae,rat 依据有关鼻咽癌发生的中医病机假说“气虚染毒”理论建立的益 气解毒方在临床和基础研究方面均取得了一定的疗效[1-5]。体内外实 验研究证明,益气解毒方能抑制鼻咽癌细胞增殖,促进细胞凋亡[1,5], 但其通过调节哪条细胞凋亡信号途径从而促进“气虚染毒”大鼠鼻咽 上皮癌变细胞的凋亡未见有文献报道。由于肿瘤(或癌变)的发生一般 需经历启动、进展和演变几个阶段,而在此过程中,癌前病变处于一个 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 非常关键的阶段,此阶段相关的各类病变细胞具有不同程度的可逆性,可以进行干预治疗,以达到逆转癌前病变或减轻病变程度的目的。据此,本研究以大鼠为研究对象,从细胞凋亡的NF-κB途径,探讨益气解毒方对气虚染毒大鼠鼻咽上皮癌变的阻逆机制,现报道如下。 1 实验材料 1.1 动物 健康雄性SD大鼠72只,体质量(80?9)g,购自湖南中医药大学动物实验中心,动物合格证号,20-002。 1.2 药物 益气解毒方由黄连、黄芪、天花粉、白花蛇舌草等组成,湖南中医药大学附属第一医院提供,各味中药由湖南中医药大学附属第一医院的王宇红教授鉴定为正品。1 g/mL益气解毒方药液和0.5%二亚硝基哌嗪(DNP)的制备均参见文献[1],1 μg/mL佛波醇酯(TPA)用生理盐水配制,-80 ?保存备有。维甲酸(维A酸片),山东良福制药有限公司生产,批号071201,用蒸馏水溶解成0.1 mg/mL浓度。 1.3 试剂 通用型SABC试剂盒及兔抗大鼠单克隆抗体,均为北京中杉生物公司产品,总RNA提取试剂盒,Gibco公司,批号0816A20,通用型RT-PCR试剂盒,北京鼎国生物技术有限责任公司,批号76000220,dNTP(上海生工),TaqDNA 聚合酶(Promega公司),引物合成(北京鼎国生物技术有限责任公司)。 1.4 仪器 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 Shandon325石蜡切片机(英国Shandon公司),LEICADMLB2型双目显微镜(德国LEICA公司),MoticB5显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司),MIAS医学图像分析系统(北航公司), Ultrospec4300 紫外-可见光分光度计(瑞士安法玛西亚公司),TC-48PTPH基因扩增仪(杭州大和热磁电子公司),GIS-1000数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。 2 实验方法 2.1 大鼠鼻咽癌模型的建立和药物干预研究 SD大鼠随机分为模型组、益气解毒方组和维甲酸组。气虚染毒大鼠鼻咽癌模型的建立参照文献[6]模型组?的造模方法。益气解毒方组造模时以12 g/(kg?d)灌胃给药干预,维甲酸组以1.05 mg/(kg?d)灌胃,均按人(70 kg)和动物体表面积 折算的等效剂量比值表换算,模型组以等体积的生理盐水灌胃,持续时间为90 d。分别于实验开始后第150、240、300、400日断头处死各组动物各6只,于冰上迅速取其鼻咽黏膜组织,用利刃分成两部分。一部分用4%多聚甲醛固定后用于石蜡包埋,制备常规石蜡切片,另一部分用液氮保存,用于RT-PCR的检测。 2.2 免疫组化检测 免疫组化检测按试剂盒的说明书进行操作。依据何氏[7]的方法进行结果判定和图像分析。 2.3 RT-PCR扩增 按TRIzon 试剂盒上的操作方法提取鼻咽组织总RNA,电泳结 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 果表明RNA 分子完整。用RT-PCR 法进行mRNA的半定量分析。每份样本取1 μg总RNA,严格按试剂盒的要求进行扩增。β-Actin(260 bp)引物1,5’ TGA CGG TCA GGT CAT CAC TAT CGG CAA TGA 3’,引物2,5’ TTG ATC TTC ATG GTG ATA GGA GCG AGG GCA 3’,Bcl-2(431 bp)引物1,5’ GTC CGT GCC TGC ATT TAG CAA GCT 3’,引物2,5’ ACA TAA GGC AAC CAC ACC ATC GAT 3’,Bax(257 bp)引物1,5’ TCC ACC AAG AAG CTG AGC GA 3’,引物2,5’ GTC CAG CCC ATG ATG GTT CT 3’。β-actin PCR条件,变性94 ?,30 s,退火60 ?,60 s,延伸72 ?,30 s。Bcl-2 PCR条件,变性94 ?,1 min。退火67 ?,40 s,延伸72 ?, 1 min。Bax PCR条件,变性94 ?,30 s,退火58 ?,30 s,延伸72 ?,30 s。循环数均为35次。5 μL扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳后,用GIS-1000数码凝胶图像处理系统中PCR定量分析得出PCR产物的光密度值,同时以β-Actin为内参照,以目的基因和β-Actin的光密度比值表示目的基因mRNA的表达水平。 3 统计学方法 采用SPSS15.0软件进行数据统计分析。所有计量数据均以x?s表示,各病理阶段比较用F检验,方差不齐两两比较用秩和检验。 4 结果 4.1 益气解毒方对大鼠鼻咽病理组织学变化的影响 动物鼻咽上皮细胞癌变的全过程可以概括为4个阶段,正常黏膜上皮、单纯性增生、异型增生、原位癌与浸润癌并存。益气解毒方 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 组癌变阻断于异型增生阶段,维甲酸组没有发生鼻咽癌变大鼠,但自250 d开始逐步出现死亡,至310 d时,已全部死亡。 4.2 益气解毒方对大鼠鼻咽黏膜组织Bcl-2、Bax、Cytochrome-C和Caspase-3蛋白表达活性的影响 4种蛋白表达定位于胞质,呈棕黄色。在诱发性鼻咽癌变进程的单纯性增生阶段,分别比较3组大鼠鼻咽上皮细胞4种蛋白表达活性,其组间差异均无统计学意义(P,0.05)。而在异型增生阶段,益气解毒方组鼻咽上皮细胞的Bcl-2蛋白表达活性显著低于模型组(P,0.05),Cytochrome-C和Caspase-3蛋白表达活性又分别显著高于模型组(P,0.05),Bax蛋白表达活性虽然高于模型组,但比较分析结果表明,组间差异却无统计学意义(P,0.05)。见表1、表2。表1各组大鼠单纯性增生鼻咽黏膜中线粒体途径蛋白表达平均灰度值比较(略) 4.3 益气解毒方对大鼠鼻咽上皮细胞中Bcl-2和Bax mRNA表达活性的影响 在诱发性鼻咽癌变进程的单纯性增生阶段,分别比较3组大鼠鼻咽上皮细胞的Bcl-2、Bax mRNA表达活性,结果组间差异无统计学意义(P,0.05)。当病变发展至异型增生阶段,益气解毒方组的Bcl-2 mRNA表达活性显著低于模型组(P,0.05),而Bax mRNA表达活性又高于模型组,二者比较结果,组间差异无统计学意义(P,0.05)。结果见表3 表3各组大鼠鼻咽上皮细胞癌变过程不同阶段Bcl-2、Bax mRNA比较(略) 注,1.DNA Marker,2.模型组单纯性增生,3.益气解毒方组单纯性增生,4.维甲酸组单纯性增生,5.模型组异型增生, DOC格式论文,方便您的复制修改删减 6.益气解毒方组异型增生、图1。图1益气解毒方对大鼠鼻咽上皮细胞癌变过程不同阶段Bcl-2 mRNA表达的影响 5 讨论 我们的前期研究显示,“气虚染毒”诱发性大鼠鼻咽癌的发生与鼻咽上皮细胞凋亡密切相关[6],而益气解毒中药可促进鼻咽癌变细胞凋亡,逆转或阻断癌变进程[1]。 已有研究表明,Bcl-2的高表达和Caspase-3的低表达都与鼻咽癌的发生过程密切相关[8]。本研究结果则进一步表明,益气解毒方诱导癌变鼻咽上皮细胞的凋亡活性,可能是通过细胞凋亡的线粒体途径实现的。在鼻咽上皮细胞癌变病理进程中的单纯性增生阶段,各组实验动物鼻咽组织的Bcl-2、Bax、Cytochrome-C 和Caspase-3表达无明显差异,提示鼻咽局部病变尚处于可调控范围。当病变发展至异型增生阶段,益气解毒方组大鼠鼻咽组织Cytochrome-C和Caspase-3蛋白表达活性明显高于模型组,Bcl-2蛋白表达活性则明显低于模型组,而2组间的Bax表达活性差异却无统计学意义。说明益气解毒方通过抑制线粒体途径的Bcl-2表达,减少了Bcl-2/Bax二聚体的形成,使得Bax可在线粒体外膜形成各种通道或孔道,有利于Cytochrome-C的释放,而释放到胞质中的Cytochrome-C可激活Caspase-9,并进一步切断Caspase-3前体,使其转变为具有活性的形式而诱导细胞凋亡。本研究结果显示,通过细胞凋亡的线粒体途径,益气解毒方可以诱导病变鼻咽上皮细胞的凋亡活性,抵消了诱癌因素促成的病变鼻咽上皮细胞的增殖活性,从而阻断了局部病变的进展。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 【参考文献】 1 成细华,田道法,喻 嵘,等.益气解毒方对大鼠鼻咽癌变过程中细胞凋亡和增殖的干预研究[J].湖南中医药大学学报,2009,29(2),10,13. 2 汤爱国,田道法,易运连,等.中药益气解毒颗粒下调端粒酶活性抑制鼻咽癌细胞的生长[J].中国现代医学杂志,2005,15(1),53,55. 3 王光平,唐发清,周金平,等.复方黄连对NF-κB活化相关基因在鼻咽癌移植瘤组织表达活性的影响[J].湖南中医学院学报,2004,24(6),14,17. 4 唐发清,田道法,龚志军,等.益气解毒颗粒干预鼻咽癌细胞HNE1蛋白质表达的研究[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志,2004,12(3),120,123. 5 胡彬雅,田道法,任基浩.益气解毒颗粒对鼻咽癌细胞株HNE1凋亡诱导活力的研究[J].中国耳鼻咽喉头颈外科,2007,14(3),153,155. 6 成细华,田道法,喻 嵘,等.“气虚染毒”大鼠鼻咽癌变过程 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 中细胞凋亡和增殖变化及相关性研究[J].中华中医药学刊,2009,27(1),57,60. 7 何迎春,田道法,田 甜,等.外源突变型p53和潜伏膜蛋白1基因在转基因鼠不同器官组织中的表达[J].中国临床康复,2005,9(42),99,101. 8 刘 宇,张幸平,邓红彬,等.Bcl-2、bax和p53在鼻咽鳞癌中的表达及其与瘤细胞凋亡的关系[J].现代肿瘤医学,2006,14(7),278,279.