实验九测定细菌生长曲线　

　实验九测定细菌生长曲线　 实验九 测定细菌生长曲线 [实验目的] 1(了解细菌生长曲线特征:2(学习液体培养基的配制以及注意事项。3(学习液体种子和固体种子的不同接种方法和注意事项。4(利用细菌悬液浑浊度间接测定细菌生长。 [仪器和材料] 1(实验材料 (1)大肠杆曲，枯草杆曲培养液及大肠杆菌平板。 (2)牛肉膏蛋门胨葡萄糖培养基(150ml,250ml 三角瓶X 4瓶,大组)，配方:牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖10g，加水至1000ml，pH7(5。 2(实验仪器 取液器(5000μl，1000μl，200tμl 各一支); 培养箱(摇床，722s分光光度汁; 1000μl 无菌吸头100个;5000μl 无菌吸头2个;1ml或4ml玻璃或塑料比色皿4个，共用参比杯一个。 [实验原理] 将一定量的细菌接种在液体培养基内(在一定的条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定规律性，如以细菌活菌数的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，可绘成一条曲线，称为生长曲线(图9 1)。 单细胞微生物发酵具有4个阶段，即调整(迟滞期)、对数期(生长旺盛期)、平衡期(稳定期)、死亡期(衰亡期)。 生长曲线可示细菌从开始生长到死亡的全过程动态。不同微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的( 测定微生物生长曲线的方法很多，有血细胞计数法，平板菌落计数法，称重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与浑浊度成正比，因此，可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值(测OD550或 OD620或OD600或OD420，可任选一波长)与对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测生长曲线的衰亡期不明显。 从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G表示。其计算公式为; G=(t-t)/[(1gW—lgW),lg2] 2112 式中tl和t2为所取对数期两点的时间;w1和w2分别为相应时间测得的细胞含量(g/L)或 OD。 [实验步骤] 1(准备菌种:将大肠杆菌，枯草杆菌分别接种到装有牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基的三角瓶中，37?，200r,min振荡培养14-18h(另外准备大肠杆菌单菌落平板l块(37'C培养24h)。 2(接种:分别将1(5ml(1,接种量)和4-5ml(3,接种量)大肠杆菌菌液和一个大肠杆菌单菌落接人含150ml培养液的三角瓶中(37?，200r,min振荡培养;把4(5ml枯草杆菌(3%接种量)接入含150ml培养液的三角瓶中，37?，200r,min振荡培养。 3(测量;每培养1h取样一次(净培养(不包括取样时间)10h结束培养，测量培养液pH值。零小时也要测。 如果选用4ml比色皿取500μl培养液到2000μl蒸馏水中(稀释5倍)，以蒸馏水为对照，测OD650。或OD620或OD600或OD420任选一波长)，如果选用lml比色皿，可以取1000μl培养液，以蒸馏水为对照，直接测OD620 、OD600或OD420(任选一波长)，当OD值大于0.6时，下一样品要稀释1倍测量( [实验结果]( OD值测量记录 1 2 3 45 67 8 9 10 0时间(h) 0.23 0.325 0.904 1.192 1.364 1.505 1.574 1.635 1.651 1.669 1.678 E.coli1% 0.350 0.405 1.403 1.268 1.358 1.50 1.5201.5811.625 1.65 1.69 E.coli3% 0.20710.1840.276 0.361 0.601 1.179 1.411 1.562 1.59 1.62 1.631 B.subtilis3% 0.1370.134 0.138 0.1720.389 1.01 1.121 1.389 1.54 1.5811.591 E.coli(plate) 注:?OD值为600nm比色所得。其代时(min)分别为:E.coli1% 40.65; E.coli3% 43.92; B.subtilis3% 61.72; E.coli(plate) 35.61 。?液体种子比较均匀，用相同的液体培养基转接后条件变化小，因此迟缓期几乎没有出现;实验结果代时长于理论值，主要是实验条件的影响，培养基、接种量、培养容器、温度条件等均影响到理论值。 E.coli/B.subtilis生长曲线比较 1.8 1.6 1.4 1.2E.coli1% 1E.coli3% 0.8 OD(600nm)0.6B.subtilis3% 0.4E.coli(plate)0.2 0 1234567891011 时间(h) [试验讨论] (1)全班同时取样，时间以教室挂钟为准，取样时间越短越好，要求在10~15min内完成)，同时开始振荡，取样期间假定细菌暂停生长(取样时间从发酵总时间中扣除( (2)为减少误差，须固定参比杯，不要旋动波长旋钮;每组固定同一台分光光度计，固定同一取液器