次级淋巴组织趋化因子的基因克隆表达及抗肿瘤作用研究

次级淋巴组织趋化因子的基因克隆表达及抗肿瘤作用研究 次级淋巴组织趋化因子的基因克隆表达及抗肿瘤作用 研究 目 录 中文摘要 英文摘要 第一部分: 人次级淋巴组织趋化因子(SLC)的基因克隆及在大肠杆菌内表达 第一部分 成熟人SLC基因克隆及序列分析 前言 材料 方法 结果与讨论 小结 附图 第二部分 人SLC在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的鉴定 前言 材料 方法 结果 讨论 小结 附图 第三部分 小鼠次级淋巴组织趋化因子(SLC)基因的克隆、瞬时 表达及抗肿瘤作用初步研究 前言 材料 方法 结果 讨论 小结 附图 论文总结 参考文献 发表论文与综述 致谢 次级淋巴组织趋化因子的基因克隆表达 及抗肿瘤作用研究 专 业 免疫学 研究生 董忠军 导 师 赵跃然 中 文 摘 要 一 立题依据和目的 次级淋巴组织趋化因子SLC (Secondary Lymphoid tissue Chemokine ) 又称6CKine 、Exodus2 和TCA(Thymus-derived Chemokine Agent4)，是由 Nagira 等1997年用信号序列捕获(signal sequence trap)法寻找趋化因子同源序列时在人EST 文库里克隆出的新的CC趋化因子。几年研究表明SLC对多种免疫细胞特别是对T细胞具有趋化作用，其趋化的归宿主要为次级淋巴组织或器官，因而SLC被认为是第一个参与体内淋巴细胞归巢( Lymphocyte homing )的趋化因子。无论是重组SLC蛋白瘤内注射还是基因转染肿瘤细胞或树突状细胞，SLC均有显著的抗肿瘤作用，所以是一种较有发展潜力的抗肿瘤药物。目前，国内外实验研究用SLC均来自杆状病毒表达产品，我国已有在大肠杆菌融合表达SLC的报道，由于目前还没有杆状病毒表达产品上市供人使用，且融合蛋 白也不可用于人体等原因，我们试图通过高效表达载体pBV220实现SLC在大肠杆菌内非融合表达，用于SLC的生物学作用的研究。 肿瘤免疫治疗的方法主要是利用免疫刺激细胞因子、协同分子和一些免疫细胞，但是，这些方法均表现局限的抗肿瘤反应，特异性的抗肿瘤反应需要吸引大量的效应细胞到抗原呈递部位，趋化因子在这种免疫反应中发挥重要作用。Sharma,-S等首次使用重组SLC注射到3LL肺癌细胞系荷瘤小鼠瘤内，40%肿瘤完全消退，且在肿瘤局部和全身检测到系统性和局部免疫反应，包括CD4T细胞、CD8T细胞和树突状细胞明显上升，并伴有Th1类细胞因子上调，而免疫抑制细胞因子IL-10显著下降，体外检测肿瘤局部浸润的淋巴细胞细胞毒活性明显增强，SCID小鼠以及CD4、CD8基因敲除小鼠没有观察到SLC抗肿瘤活性，表明T细胞在SLC抗肿瘤效应中发挥主导作用，到目前还没有证实NK是否参与SLC抗肿瘤的报道，不过有人已经证实NK参与ELC的抗肿瘤作用，基于ELC和SLC的诸多相同点，且NK也表达SLC受体(CCR7),推测NK很可能参与抗肿瘤效应。 二 方法和结果 1. 人SLC成熟肽的基因克隆及在大肠杆菌中的重组表达 取正常人淋巴结，用本室制备的RNA提取试剂盒分离纯化细胞总RNA。以RNA模板，随机六聚体核苷酸为引物，在M-MLV逆转录酶的作用下进行反应，合成cDNA的第一链。根据GeneBank报道的SLC的编码序列，扩增成熟SLC基因的上、下游引物，分别在5，端加上限制性酶切位点 EcoRI和BamHI。设计上游引物时，在成熟SLC编码序列的上游加上起始密码子ATG,同时在上游加上保护性碱基TA,下游加上AA，降低G+C含量，防止二级结构的形成，提高重组蛋白质的表达含量。以RT反应物为模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR，扩增SLC基因。用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化PCR扩增产物后，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，接种含100ug/ml氨苄青霉素的LB 平板。用菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆，采用ABI100 全自动DNA测序仪测序，结果显示，克隆的基因和预期的成熟人SLC基因完全一致，成功构 建了SLC重组质粒pMD18-hSLC。 用EcoRI和BamHI双酶切消化重组质粒pMD18-hSLC，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化SLC片断，插入原核表达载体pBV220的PL启动子的下游，构建重组SLC表达载体。重组子同样用菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆，从而获得重组阳性质粒pBV220-hSLC。含有pBV220-SLC的大肠杆菌(工程菌株)接种于含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，30?振荡培养至对数生长期，42?诱导4小时，离心收集细菌，进行SDS-PAGE和Western blotting 分析。结果显示，重组蛋白的表观分子量约18KD，和文献报道一致，凝胶图像分析表明重组蛋白约占菌体总蛋白的20,。Western blotting 分析，重组蛋白能和抗人SLC抗体特异性反应，说明重组蛋白为人SLC。 为研究重组SLC的生物学活性，进行小规模的发酵。工程菌以1:100接种于含有葡萄糖和甘油的LB培养基中，30?振荡培养至OD值约04-0.5，迅速转移至40?水浴摇床又到4小时。4?离心收集细菌，洗涤，超声破碎。7000rpm离心洗涤，分离包含体。沉淀用含0.2%的TritonX-100洗涤3次，纯化包含体。用8M尿素溶解包含体，然后用凝胶过滤初步纯化目的蛋白，SDS-PAGE分析显示，获得蛋白纯度约90%。 2、小鼠趋化因子SLC 的抗肿瘤作用研究 为了探讨SLC的抗肿瘤作用机制，特别是NK细胞在SLC抗肿瘤作用中所发挥的作用，我们用同样的方法从小鼠脾脏成功克隆并构建了带有信号肽序列的重组pMD18-mSLC，序列测定表明所克隆的SLC基因与Nakano,H报道的亮氨酸突变体一致。用Hind?和BamHI双酶切消化重组质粒pMD18-mSLC，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化SLC片断，插入真核表达载体pCDNA的CMV启动子的下游，构建哺乳细胞表达载 体pCDNA- mSLC。脂质体法转染猴肾细胞COS-7，Western blotting 分析证实， 细胞上清中可检测到可溶性的SLC，提示构建的重组表达载体pCDNA- mSLC可用 于黑色素瘤细胞的基因修饰，并可用于SLC的基因治疗的实验研究。将纯化的 pCDNA- mSLC质粒和适量的脂质体混合后，转染70%融合生长的小鼠黑色素瘤细 胞系(B16)，经G418筛选后，用PCR和Western blotting 分析SLC的分泌表 达水平，结果提示，基因修饰的B16细胞可表达小鼠SLC。大量培养扩增阳性克 隆细胞，背部接种C57BL/6小鼠，观察肿瘤大小和存活率,结果显示，基因修饰 的B16细胞致瘤性下降，小鼠存活率延长。 三 结论 1. 成功克隆了人成熟SLC 基因，序列分析显示，克隆的基因序列和文献报道一致。 2. 构建了成熟SLC 的原核表达载体，获得稳定表达的工程菌株，重组蛋白约占菌体总蛋白的20%。 3. 初步摸索优化了重组SLC的表达条件，包含体提取步骤，初步纯化工艺。 4. 成功克隆了小鼠SLC基因，序列分析与Nakano,H报道的亮氨酸突变体一致。构 建了分泌型表达载体，并实现了瞬时表达。 5. 成功完成小鼠黑色素瘤细胞系 (B16)的基因修饰，修饰后的肿瘤细胞致瘤性下降，小鼠存活率延长。 关键词: SLC;克隆;表达;抗肿瘤 英文摘要: Cloning And Expression Of Human Secondary Lymphoid Tissue Chemokine And Study On Its Antitumor Responses Background Secondary lymphoid tissue chemokine (SLC, also referred to as Exodus 2 or 6Ckine) is a recently identified high endothelial-derived CC chemokine by searching the Expressed Sequence Tag (EST) database. For many years several studies have revealed SLC can be chemoattractant for many immune cells and especially T lymphocy