雌核发育与正常二倍体条斑星鲽胚胎发育比较研究

雌核发育与正常二倍体条斑星鲽胚胎发育比较研究 雌核发育与正常二倍体条斑星鲽胚胎发育 比较研究 第28卷第12期 2009年12月 水产 FISHERIES 科学 SCIENCE Vol_28NO.12 Dec.2009 雌核发育与正常二倍体条斑星鲽胚胎发育比较研究 李忠红,刘海金,张世奎,姜秀凤,王玉芬 (1.东北农业大学动物科学与技术学院,黑龙江哈尔滨150030;2.中国水产科学 研究院,北京100039;3.上海海洋大学,上海200090;4.中国水产科学研究院北戴 河中心实验站,河北秦皇岛066100) 摘要:在用牙鲆精子诱导条斑星鲽雌核发育的同时,对条斑星鲽单倍体,雌核发育胚胎发育过程进 行了观察,并与普通胚胎发育作了比较.观察结果表明,(1)单倍体胚胎,卵裂开始至64细胞期,发育 速度较普通胚胎发育发育速度明显缓慢,至多细胞期发育速度相同.历时14h;到达高囊胚期比普通二 倍体慢1.5h,到达低囊胚期发育速度相同,历时31h;到达原肠末期,神经胚期,晶体形成期历时相同, 其他发育时期一直处于缓慢状态;孵化仔鱼具有明显的单倍体综合症.(2)雌核发育与普通胚胎的发 育的特征相比无明显区别,在卵裂期发育速度明显迟缓.但在囊胚期以后,所用时间基本相同;孵化时 间比普通胚胎长约1h.(3)与普通胚胎相比,雌核发育胚胎,单倍体胚胎孵化率较低, 仔鱼畸形率高. 关键词:条斑星鲽;胚胎;雌核发育;单倍体 中图分类号:S9l7.4文献标识码:A文章编号:1003一i1iI(2009)i2-0752-05 条斑星鲽(Veraspermoseri),属鲽形目,鲽科, 星鲽属,是冷温性大型鲆鲽鱼类,主要分布于日本 茨城县以北到鄂霍茨克海以南海域,我国黄海,渤 海海域亦有少量分布.近年来,其自然资源衰退, 捕获量极少,很难形成稳定的渔获量,且呈现越来 越少的趋势.随着牙鲆(Paralichthyolivaceus), 大菱鲆(Scophthatmusmaximus)养殖效益的逐步 下滑,条斑星鲽以其外观漂亮优美,富含胶原蛋白, 肉质细嫩鲜美,生长快,经济价值高,成为研究人员 和海水养殖业主要研究和开发的对象之一,具有很 大的开发价值和养殖潜力.为了增加资源量,满足 市场需求,2004年条斑星鲽被引进到我国辽宁,河 北和山东等省进行驯化及试验养殖,现已取得了初 步成功_4_. 目前,我国对条斑星鲽的研究处于初级阶段, 主要集中在人工育苗,工厂化养殖技术上.为发挥 条斑星鲽雌性个体大于雄性个体生长优势,笔者在 人工诱导条斑星鲽雌核发育同时,对其单倍体,雌 核发育胚胎发育做了观察,并与普通二倍体在孵化 率和畸形率,胚胎发育时序及形态上做了比较,以 期为条斑星鲽雌核发育研究提供基础,对掌握 其生命活动规律,建立鱼类人工育苗和操作管理技 术体系具有重要指导作用. 1材料与 试验于2008年4月在中国水产科学研究院北 戴河中心实验站进行.条斑星鲽雌性亲鱼为2004 年从日本引进的苗种培育而成,4龄,体质量3240 ~ 4280g.牙鲆雄性亲鱼为该站人工养殖牙鲆,4 , 6龄,体质量1240,1530g.条斑星鲽产卵期进 行人工挤卵,干法受精,受精卵孵化水温(8? 0.5)?,过滤海水盐度3l,35,pH8.O,8.3. 普通二倍体胚胎是由条斑星鲽精卵正常人工 授精获得,作为试验对照组.条斑星鲽单倍体胚胎 由经紫外线照射60S后的牙鲆精子,激活条斑星鲽 卵子而获得.雌核发育胚胎是由经紫外线照射60 S后牙鲆精子激活条斑星鲽卵子,受精i1min后放 人一1.5?的海水中冷休克处理60min放回到(8 ?0.5)?海水中孵化而获得. 孵化期间按照其发育的各个时期定期取样,各 时期测定样品数超过50个,在Motic显微镜下观 察胚胎发育各时期的形态特征,当其中5O发育至 某时期的时间作为该期的胚胎发育时间,并进行记 录,拍照. 统计各试验组孵化率,畸形率.孵化率为孵化 个体数与原肠期正常胚胎数之比;畸形率为畸形个 体数与孵化个体数之比. 收稿日期:2008-12-12;修回日期:2009一O1—20. 作者简介:李忠红(1982一),女,硕士,研究方向:动物遗传育种与繁殖;E— mail:lizhonghongl2345@126.COIl1.通讯作者:刘海金 (1951一),男,研究员,博士,研究方向:鲆蝶类全雌化育苗技术 Email:liubaijin@hotmail.COIq1. 第12期李忠红等:雌核发育与正常二倍体条斑星鲽胚胎发育比较研究753 2结果 2.1胚胎发育统计 正常人工授精获得的条斑星鲽二倍体孵化率 为22.3%,单倍体与雌核发育试验组与其相比,孵 化率明显较低(表1).雌核发育胚胎孵化率仅为 8.5,仔鱼畸形率较高,达8.6%.单倍体孵化率 高于雌核发育试验组,孵化率为l3.7,畸形率为 100%. 表1条斑星鲽胚胎发育统计 2.2条斑星鲽普通胚胎,雌核发育胚胎,单倍体胚 胎发育时序 单倍体,雌核发育胚胎和普通胚胎发育时序见 表2. 表2条斑星鲽胚胎发育时序 2.2.1卵裂期(图1,图9) 条斑星鲽受精卵为无油球的悬浮卵,呈圆球 形,分离透明.卵膜具粗波纹状的纹络.卵黄均 匀,浅黄色或米黄色.卵径平均(1.70?0.02) YD_m.各试验组受精卵在受精后2.5,3.5h原生 质向动物极集中形成胚盘,此时动物极因重力关系 而向下,植物极朝上.普通胚胎受精后4h开始第 一 次卵裂,卵裂期共历时14h呈桑椹状.单倍体 受精后4.5h开始第一次卵裂,卵裂期共历时l4 h,卵裂期,单倍体较普通胚胎发育明显缓慢.经冷 休克处理的雌核发育胚胎受精后5h开始第一次 卵裂,卵裂期共历时14.5h.经冷休克处理的雌 核发育试验组发育明显缓慢.各试验组发育速度 由快到慢依次为:普通胚胎,单倍体胚胎,雌核发育 胚胎.分裂至16细胞时,细胞形状规则,细胞界限 清晰.分裂至32细胞时,细胞形状开始不太规则, 卵裂球大小不一,但界限清晰,细胞体积变小.各 试验组卵裂期鲜明特点是第三次卵裂不同步现象 明显,有大量的非正常数目裂球的胚盘,如6细胞, l2细胞.此外,条斑星鲽胚胎发育至多细胞期时, 胚盘所有分裂球大小差别很大,且较大裂球分布在 胚盘的周围. (图1O,图11) 2.2.2囊胚期 细胞分裂在层次上有所增加,胚盘明显突出于 卵黄上,细胞数量明显增多,体积变小,此时处于高 囊胚时期.细胞继续分裂,胚盘高度有下降之势, 边沿向外扩展,与卵黄囊交界处坡度变得平缓,此 时处于低囊胚时期,为原肠期下包做好准备.普通 胚胎,雌核发育胚胎和单倍体胚胎发育速度至低囊 胚时达到一致,历时31h. 2.2.3原肠期(图12,图14) 囊胚层的细胞沿着卵黄的表面向四周继续扩 展,下包,并开始伴随内卷运动,此时原肠作用开 始.原肠作用是胚胎细胞有规律的定向迁移,排列 和分化,形成胚层的过程,并在此基础上逐渐分化 形成各种组织和器官原基.原肠早期,胚环下包约 1/3,原肠中期,胚环下包约1/2,原肠晚期,胚环下 包约4/5,出现胚体雏形.各试验组发育至原肠早 期的顺序为:普通胚胎一单倍体>雌核发育胚胎, 历时64h,各试验组同时到达原肠晚期. 2.2.4神经胚期(图15,图16) 胚盘外包到3/4时,胚体雏形形成,胚盾变细 而长,头突出现.此时期,单倍体,雌核发育胚胎出 现畸形胚. 2.2.5器官形成期(图17,图22) 受精后78.5h,普通胚胎胚体头部两侧向外隆 起,雌核发育胚胎79.5h出现视泡.单倍体眼泡形 成较普通胚胎和雌核发育胚胎迟3,4h.受精后 水产科学第28卷 83h,普通胚胎体节出现,单倍体与雌核发育二倍 体胚胎受精后85h体节出现,此时雌核发育胚胎 与普通胚胎发育基本相同,但部分出现畸形.单倍 体表现出明显的畸形,胚体多数粗且短小.受精后 114h,各试验组胚胎晶体均出现,但单倍体晶体不 清晰.卵黄囊上分布零星点状黑色素. 2.2.6尾芽期(图23,图24) 肌节数量不断增多,黑色素增多,尾部开始从 卵黄分离,尾芽明显,卯周隙增大,胚体其他部分仍 然与卵黄紧密相连.胚体绕卵黄50.受精后 128h,单倍体发育至尾牙期,比普通胚胎组迟5h. 雌核发育胚胎比普通胚胎迟0.5h. 2.2.7心跳期(图25,图27) 尾芽继续伸长,胚体包卵黄囊约2/3,耳石出 现,围心腔清晰,位于胚体头腹面右侧,与体轴呈斜 角.胚体有间歇性的开始搐动,可见心脏开始跳 动,进入心跳期.受精后141h,普通胚胎心跳频率 为48次/min,受精后143h,胚体旋转摆动加大,心 跳加快.单倍体心跳期较其他试验组迟4h且大部 分难以观察到心跳. 2.2.8孵化期(图28,图34) 普通胚胎胚体绕卵黄囊1周,胚体色素明显. 胚体摆动与扭动频率与幅度不断增大,头前端先将 卵膜顶起,脱离卵黄囊,随后胚体甩出,脱膜.普通 胚胎与雌核发育胚胎孵化出膜时间基本一致,历时 约210h,单倍体破膜经历时间较长,较其他试验组 长10h,其畸形率达100%,偶尔观察到尾部先出膜 个体.雌核发育二倍体仔鱼与普通二倍体仔鱼,形 态上无明显区别,单倍体仔鱼具有明显的单倍体综 合症. ????? ????? 一?一?? ?一?一? 羞?一一? 薯???? 图1 图1.受精卵;图2.胚盘形成;图3.2细胞;图4.4细胞;图5.8细胞;图6.16细胞;图7.32细胞;图8.64细胞;图9.多细胞;图1O.高囊胚; 图11.低囊胚;图12.原肠早期;图13.原肠中期;图14.原肠末期;图15.神经胚期;图16.单倍体神经胚期;图17.普通二倍体视泡形成期; 图18.单倍体视泡形成期;图19.普通二倍体体节形成期;图2o.单倍体体节形成期;图21.普通二倍晶体形成期;图22.单倍体晶体形成期; 图23.普通二倍体尾牙期;图24.单倍体尾牙期;图25.普通二倍体心跳期;图26.单倍体心跳期;图27.雌核发育心跳期;图28.单倍体孵化 前期图;图29.普通二倍体孵化前期;图30.单倍体孵化期;图31.普通二倍体孵化期;图32.单倍体出膜期(畸形);图33.普通二倍体出膜 期;图34.雌核发育二倍体出膜期. 第12期李忠红等:雌核发育与正常二倍体条斑星鲽胚胎发育比较研究755 2.3单倍体,雌核发育与普通二倍体的形态比较 单倍体在胚体形成期出现畸形胚,在发育过程 中与普通胚胎有明显的差异,可以通过解剖镜观察 而区分开,而雌核发育胚胎与普通胚胎在胚胎发育 任何时期,胚胎都难以区分.初孵仔鱼形态特征明 显,可以明确观察其区别(表3). 条斑星鲽普通胚胎初孵仔鱼卵黄囊仍较大,扁 椭圆形,长度约占体长1/2.消化肠管很直,紧贴卵 黄囊上.色素细胞呈雪花状,散布身体表面,背腹 鳍膜在尾部相连,背鳍膜起始于身体头后1/3处, 尾鳍膜自卵黄囊后即开始出现.雌核发育正常仔 鱼形态与普通胚胎孵化仔鱼形态无明显区别.孵 化出膜的单倍体鱼苗畸形率为100,均表现出典 型的单倍体综合症,包括躯体粗短,躯体扭曲,围心 腔扩大,卵黄囊肿大,循环系统发育不全,不能形成 清晰视泡,肌节,头部组织不能分辨等,这些单倍体 鱼苗活力较差,不能继续发育,在孵出5d内陆续死 亡. 表3初孵仔鱼形态比较 3讨论 条斑星鲽胚胎发育遵循着硬骨鱼类胚胎发育 的一般规律,其胚胎发育过程也主要分为5个主要 时期:卵裂期,囊胚期,原肠期,神经胚期和器官形 成期.条斑星鲽普通胚胎,雌核发育胚胎和单倍体 胚胎在细胞分裂期形态上无明显区别,发育至多细 胞期,胚盘所有的裂球小,均一程度较低;且一般较 大的裂球分布在胚盘的周围,而其他鲆鲽类的卵胚 却少有此现象.条斑星鲽为冷温性鱼类,其胚胎发 育过程比较缓慢,受精卵在水温6,1l?均能孵化 出正常仔鱼,最适孵化温度8,10?,在鲆鲽鱼类 中孵化期相对较长,胚胎在约l0?水温,历时168 h脱膜孵出L5],孵化历时与圆斑星鲽(V.varie— gate)E相近,但比牙鲆?和大菱鲆L8等鱼类的胚 胎发育时间长.星斑川鲽(Platichthysstel— latus)[g仔鱼在脱膜孵出之前胚体环卵超过1周以 上,而条斑星鲽仔鱼脱膜之前胚体环卵不超过l 周.从原肠胚到孵化期间,是鱼体各器官发生的重 要阶段,不同种类有些器官分化时序不一,大西洋 牙鲆(P.dentatus),暗纹东方纯(Fuguobscurus), 杂交东方纯(F.ocellatus旱×F.obscurus舍)等先 形成体节后出现视泡L1;泥鳅(Misgurnusan— guillicaudatusontor)L1等肌节,视泡是同时出现 的;而条斑星鲽在胚孔关闭前胚胎先出现视泡,而 后胚体才开始分节,进行类似发育的有牙鲆],漠 斑牙鲆Ll](P.1ethostigma),圆斑星鲽及石鲽 (Kareiusbicoloratus)[等. 研究结果表明,条斑星鲽普通胚胎孵化率为 21,远低于牙鲆受精卵孵化率L8(90.2),究其 原因,可能与本试验卵质差,成熟度不一致有关. 雌核发育胚胎与普通胚胎相比,孵化率明显较低, 仅为8.5,仔鱼畸形率达8.6.洪一江等.研 究冷休克对兴国红鲤(Cyprinuscarpiovar.Xing— guonensis)胚胎发育的影响指出,受精后冷休克处 理可能是引起雌核发育胚胎发育发育迟缓,出膜率 低的和畸形率高的主要原因,冷休克温度低,冷冻 刺激时间过长,卵质中的启动因子因冷休克而失活 或活性降低,或传递途径阻断而不能启动基因,细 胞分裂不能进行,胚胎不能正常发育而死亡.本研 究中单倍体胚胎在发育过程中与普通二倍体相比 处于滞后状态,这与牙鲆,半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)口雌核发育单倍体不同,牙鲆单倍体胚 胎在细胞分裂期发育速度比普通胚胎快,至原肠早 期开始滞慢口].半滑舌鳎单倍体胚胎发育过程中, 卵裂期发育速度比普通胚胎快,原肠中期发育开始 滞后,另外与半滑舌鳎单倍体胚胎不同的是,条斑 星鲽单倍体可以孵化出膜,而半滑舌鳎单倍体在心 跳期之前陆续死亡[1.而条斑星鲽雌核发育二倍 体胚胎在发育过程中较普通胚胎缓慢,这一现象与牙鲆,半滑舌鳎雌核发育胚胎发育结果相似[7. 冷休克处理可能是引起期雌核发育胚胎发育迟缓 756水产科学第28卷 的主要原因,冷休克温度低,时问长,可能使代谢缓 慢,使发育迟缓.冷休克抑制第二极体排出对条斑 星鲽胚胎发育的影响,还需要深入研究. 参考文献: [1]森立成.古平地区6:挡c于67,y力r7海面蕃殖现状 匕裸题[J].北水试土.2004(65):13—16. 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ComparisonofEmbryonicDevelopmentinGynogeneticand DiploidBarfinFlounder(Veraspermoseri) LIZhong—hong,LIUHal—jin.,ZHANGShi—kui.,JIANGXiu—feng,WANGYU-fen (1ICollegeofAnimalScienceandTechnology,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin15 0030.China; 2.ChineseAcademyofFisherySciences,Beijing100039.China;3.ShanghaiOceanUniversity,Shanghai 200090,China;4.BeidaiheCentralExperimentStation,ChineseAcademyofFisherySciences,Qinhuangdao 066i00,China) Abstract:Japaneseflounder(P以r口 Zcf^olivaceus)spermwasusedtoinducehaploidofgynogenetiebarf— inflounder(Veraspermoseri),andhomologousfrozenspermwasusedtoinducenormalbarfinflounder embryostOtestthemethodsofinducinggynogenesisinbarfinflounder.Observationandcomparisonof theembryonicdevelopmentsshowedthatthehaploidembryonicdevelopmentwasslowerthanthenormal embryobeforemuhicelledstageanditlasted14hours.Theearlyblastulaofhaploidembryonicdevelop— mentwasfoundtobeslowerthanthenormalembryoswhilethelategastrula,neurulastage,andforma— tionofeyelensstagewerethesameasthenormalembryos.Thehaploidembryoshadslowerdevelopment ratethanthenormalembryosdid,andthehaploidsyndromewasobservedinthehaploidlarvaewhilethe gynogeneticembryonicdevelopmenthadthesimilarcharactertothenormalembryo.Lowerhatchingrate andhighermalformationwerefoundinthegynogeneticandhaploidlarvaecomparedwiththenormalem— bryos. Keywords:barfinflounder(Verasperoseri);embryo;gynogenesis;haploid (责任编辑:晓荷)