[整理版]免疫分型在单株丙球蛋白血症中的应用评价

[整理版]免疫分型在单株丙球蛋白血症中的应用评价 免疫分型在单株丙球蛋白血症中的应用评估 (上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海200092) 目的 对定量检测血清中的免疫球蛋白和免疫分型在单株丙球蛋白血症中的应用价值进行相应的探究和讨论。方法 对研究对象即118例患有血清单株丙球蛋白血症的病者进行血清轻链定量检测和对免疫球蛋白的定量检测以及免疫固定电泳测试。结果 在118位患者中有56位免疫球蛋白定量阴性和免疫分型阳性的患者，其中轻链λ型、轻链κ型和未分泌型所占的病例比率为4:2:1;另外还有62位免疫球蛋白定量和免疫分型均为阳性的患者。结论 对患者进行的三项实验室测验，这些方法都是有利于诊断血清单株丙球蛋白血症的，并且这些鉴别检测技术手段的应用价值都是很显著的。下文中的三项特定的实验室检测是在方法中提出的那几种。 关键字:单株丙球蛋白血症;免疫球蛋白定量;免疫分型;免疫固定电泳 目 录 引言----------------------------------------------------------------------------------------------------1 1.材料和方法-----------------------------------------------------------------------------------------1 1.1 一般材料-------------------------------------------------------------------------------------1 1.2仪器与试剂-----------------------------------------------------------------------------------1 1.3 实验方法-------------------------------------------------------------------------------------1 1.3.1样本采集------------------------------------------------------------------------------1 1.3.2 样本的制备和保存-----------------------------------------------------------------1 1.3.3 血清蛋白区带电泳----------------------------------------------------------------1 1.3.4 免疫球蛋白定量-------------------------------------------------------------------2 1.3.5 免疫固定电泳----------------------------------------------------------------------2 1.3.6 统计学处理------------------------------------------------------------------- ------2 2.结果---------------------------------------------------------------------------------------2 2.1血清蛋白电泳结果----------------------------------------------------------------2 2.2 血清免疫球蛋白及轻链定量检测-------------------------------------------------------2 2.3 免疫固定电泳结果------------------------------------------------------------------------2 2.4 进一步IgD分型---------------------------------------------------------------------------3 2.5比较三种方法的检出率--------------------------------------------------------------------3 2.6 56例免疫分型阳性、免疫球蛋白定量阴性患者在良、恶性单株丙球蛋白血症 及MM不同病期中的分布格局-------------------------------------------------------------------4 2.6.1 免疫分型阳性、免疫球蛋白定量阴性患者在单株丙球蛋白血症中的分布 格局--------------------------------------------------------------------------------------------4 2.6.2 免疫分型阳性、免疫球蛋白定量阴性患者在MM不同病期中的分布格 局-----------------------------------------------------------------------------------------------4 3.讨论-------------------------------------------------------------------------------5 3.1血清蛋白电泳-----------------------------------------------------------------------------5 3.2 三种方法比较检出率--------------------------------------------------------------------5 3.3 免疫球蛋白定量与免疫固定电泳-------------------------------------------------------5 3.4 免疫固定电泳在IgD分型中的应用-----------------------------------------------------6 4.结论-----------------------------------------------------------------------------6 参考文献----------------------------------------------------------------7 致谢-------------------------------------------------------------------9 引言 而血清单株丙球蛋白血症并不是正常的免疫球蛋白，将这种异常的血液增殖性质的免疫疾病留作为特殊病例来观察。在一些情况下，比如巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤还有多发性骨髓瘤等疾病中，可以发现有M蛋白的存在。而对于恶性血液增殖性质的疾病多发性骨髓瘤，良性的丙球蛋白血症是该病的前期现症状，之后脱离调节控制机制再逐 []1渐演变恶化。之所以在临床上会出现漏诊和误诊的情况，也是由于多种脏器被瘤细胞 [2]侵袭，而造成患者的表现症状不够鲜明和明显。并且从发病率的角度来看，多发性骨髓瘤病其实并不罕见。现今，由于检测技术的不断完善和提高，国家人口也愈来愈趋于 [3]老龄，而导致骨髓瘤的发病率也随之增加。然后对全部患者进行三项特定的测验，也可以综合诊断鉴别单株丙球蛋白血症，这是有一定应用价值意义的。下面讲述的是实验所需的材料以及所应用到的方法。 1.材料与方法 1.1 一般资料 在新华医院里选取研究对象118例免疫分型为阳性的患者，并且其中有56位免疫球蛋白定量阴性和免疫分型阳性的患者，其中轻链λ型、轻链κ型和未分泌型所占的病例比率为4:2:1;免疫球蛋白定量和免疫分型均为阳性的患者有62例，选取一定男女比 :7)的良性血液例(15:12)的多发性骨髓瘤的患者。另外，再选取一定男女比例(19单株丙球蛋白血症的患者。另外还有一名暂时未被明确诊断为是单株丙球蛋白血症的男性患者。还有两位54岁的系统性红斑狼疮的女性患者，当然，以上的实验对象患者是均[4]已经排除了感染性疾病、自身免疫性疾病和中枢性神经系统疾病等疾病而确诊了的。这些即可保证实验的精确谨慎性，排除杂因的影响。 轻链λ型、轻链κ型和未分泌型三种不同的免疫类型构成了所有的多发性骨髓瘤的27个病例，统计它们三型所占的病例数，分别为4例、2例和1例。而IgG型:IgA型:IgM型:IgD型(病患例数)=11:3 :3 :3。 对多发性骨髓瘤的患者按照统一来进行病情的分期，稳定期:进展期:缓解期 [5]病患所占的比例为7:6:14。 1.2 仪器与试剂 毛细血管电泳仪(还有它相应的试纸盒)、特定的蛋白仪(德)以及电泳系统(德)。 1.3 实验方法 1.3.1 对血样本进行无菌的采集 采用无菌操作抽取4ml的静脉外周血，往非抗凝管中放入2作为血清分离的使用。 1.3.2 对血液进行制备和保存 对2的静脉血进行离心处理，离心速度设定为3000r/min，五分钟之后将其保存至冰箱待测。 1.3.3 血清蛋白区带电测验:利用特定的自动化电泳仪分离、染色脱色还有干燥患者的血清样本。 1.3.4 免疫球蛋白定量测定:通过德国特定的蛋白仪来对患者免疫球蛋白的浓度进行一个免疫散射比浊法的测定。 1.3.5 免疫固定电泳测验:稀释标本，对血清蛋白进行分离操作。再加相应的25µl抗血清于各泳道，经过试剂固定、孵育之后再吸去抗血清作烘干处理。10min之后，进行洗涤、结晶紫染色、脱色、烘干一系列的操作，扫描，还可以对免疫分型为κ/λ可 能的患者标本进行IgD分型。 1.3.6 统计学的处理 比较分析免疫球蛋白定量阴性和免疫分型阳性的患者在不同病期下所分布的格局，应用特定的统计软件，而不同的三种疾病分别确定是多发性骨髓瘤和良恶性的单株丙球蛋白血症疾病。 2.结果 2.1 血清蛋白的电泳显示的结果 在118例免疫分型为阳性的患者中，有115例患者的血清内可以发现有M蛋白的存在。电泳的结果显示，γ球蛋白区有81例M蛋白，β球蛋白区有28例，在两区之间还有1例，淡染M区带有5例。 2.2 血清轻链还有免疫球蛋白的定量检测 在所有的免疫分型为阳性的研究对象患者里，免疫球蛋白定量阴性和免疫分型阳性的患者有56例，其中的轻链型里的IgG、IgM等免疫球蛋白的含量一般不会增高;另外的62例免疫球蛋白定量和免疫分型都为阳性的患者，他们其中含量有所增高的有IgG、IgA、IgM等。 2.3 免疫固定电泳的结果可以参考表1和图1 得出的结果是，IgG型在118例的患者标本里所占的比例(52.5%)是最大的，第二位的是占20.3%的IgA型，IgM型占16.1%。另外其中不同免疫分型的轻链型:双克隆型:IgD型:未分泌型=6:4:3:1。 表1 患者的血清免疫分型的显示结果 免疫分型 例数(%) κ型 λ型 IgG 61 (51.7%) 31 30 IgA 24 (20.3%) 9 15 IgM 19 (16.1%) 11 8 IgD 3 (2.5%) 0 3 IgE 0 (0%) 0 0 轻链型 6 (5.1%) 2 4 双克隆型 4 (3.4%) 2 2 未分泌型 1 (0.85%) 0 0 合计 118(100%) IgG IgA IgM IgD 轻链型 双克隆型 图1 患者的免疫分型所占的比例图示 2.4 IgD分型鉴定 采用IgD分型鉴定进一步检测118例单株丙球蛋白血症患者中κ或者λ可能的样本，结果显示游离λ轻链型:游离κ轻链型:IgDλ伴λ型所占的比例为4:1:1。如下图2、3所示。 图2 图3 图2所示 1、 4.均为游离的λ轻链型 图3所示 1.IgDλ伴λ 2. 游离λ轻链型 3. 游离λ轻链型 4. 游离κ轻链型 2.5 通过对患者进行三项实验室测验来对血清单株丙球蛋白血症的检出率进行一个相对应的比较和分析。(见下表2) 表2三种实验检测方法对应着的疾病(单株丙球蛋白血症)检出率 组别 例数 SPE IF Ig SPE+IgIgG型 61 100 100 54.1 100 IgA型 24 100 100 66.7 100 IgM型 19 100 100 68.4 100 IgD型 3 66.7 100 0 66.7 轻链型 6 83.3 100 0 83.3 未分泌型 1 0 0 0 0 双克隆型 4 100 100 25 100 合计 118 通过仔细对比和研究分析可得，对单株丙球蛋白血症的检测敏感度最高的是免疫固定电泳，其检测的准确性非常之高;再就是血清蛋白电泳，根据阳性检出率可以比较判断得出。详细请见表2。 2.6 表3，图4、5是其中的56位免疫球蛋白定量阴性和免疫分型阳性的患者在不同病期下所分布的格局。 选取的三种疾病分别是多发性骨髓瘤和良恶性的单株丙球蛋白血症，最后再综合比较分析。 多发性骨髓瘤患者的男女人数比例为15:12，对患者按照统一标准来进行病情的分期，其中的稳定期:进展期:缓解期病患所占的比例为7:6:14;良性单株丙球蛋白血症患者的男女比例为19:7;另外有一名男性患者，暂未明确被诊断为单株丙球蛋白血症。也有患其他免疫疾病的患者。 表3 免疫球蛋白定量阴性以及免疫分型阳性患者在特定疾病中所分布的格局 例数 性别 病期 男 女 稳定期 缓解期 进展期 MM组 27 15 12 7 14 6 MGUS组 26 19 7 / / / 未明确诊断组 1 1 0 / / / 其他组(SLE) 2 0 2 / / / * ? ?[ [ * 30 142512MM组2010MGUS组稳定期组 815缓解期组未明确诊断组610进展期组其他组(SLE)452 00 *:P>0.05，MM组与MGUS组两组进行对比分析。 *:P<0.05，缓解期组 与稳定期组两组进行对比分析; ?:P<0.05，缓解期、进展期组两组 [ 进行对比分析; ?:P>0.05，稳定组、进展组两组进 行对比分析。 图4 免疫球蛋白定量阴性以及免疫分型阳性患 图5 免疫球蛋白定量 者在特定疾病中的分布格局 阴性和免疫分型阳性患者在多发性骨髓瘤MM 不同病期中的分布格局 2.6.1 图4所示 56例免疫分型阳性且免疫球蛋白定量为阴性的患者中，MM组和MGUS组两组之间并没有明显的差异(P,0.05)。 2.6.2 图5所示 MM组中，缓解期患者组的分布水平显著高于稳定期及进展期患者组，两组之间具有明显的差异(P,0.05);而稳定期患者及进展期患者两组之间进行比较，并没有明显的统计学差异(P,0.05)。 3.讨论 3.1 血清蛋白电泳 血清蛋白电泳作为一种相对比较简单的进行蛋白质分离的实验技术，其能够对血浆蛋白质进行系统的分析进而得出全貌图谱，能够粗略的显示出血清中发生异变的某些蛋 [6]白质。我们的研究结果表明在所有的118例病人中，有3例病人未出现M蛋白峰(漏诊率为2.5%)，分别是IgD型MM、轻链型以及未分泌型MM。由此可见，对于轻链型以及未分泌型MM的患者而言，在初筛实验过程中易出现漏诊，对于疑似此类患者的病例需要进一步行免疫固定电泳和骨髓检测等其他实验室检查以辅助诊断。 3.2 三种方法检出率对比分析 对118例单株丙球蛋白血症阳性诊断的三种实验室检测方法进行比较对比研究分析。结果显示IF对单株丙球蛋白血症的检测敏感性最高，并确定型别，其检出率达99.2%，准确性为100%，无假阳性。其次是SPE，其检出率达97.5%，免疫球蛋白定量的检出率 [7]仅为53.4%，SPE和Ig组合检出率达97.6% (见表2)。Katzmann认为单株丙球蛋白血症的筛查需联合EPS、CLL定量检测，以及κ/λ的比值。认为这些测试的优点在于精确性强、检测消耗少、易于实施等优点。2009年国际骨髓瘤工作组(IMWG)建议联合应用SPE、[8]IF和血清CLL定量检测，用于单株丙球蛋白血症的筛查。国内目前暂未开展CLL的常规检测，在今后的研究中要作进一步补充。 免疫固定电泳是通过单克隆抗体对单克隆免疫球蛋白进行检测，与别的研究方法相比具有精准、灵敏、迅速等优点。由于其检测对象为血清，收集样本容易，整个流程用时较短，只需要2h便能够获得相应的数据，商业化的琼脂糖凝胶每次能够同时对9个样本进行分析，因此十分适用于临床上进行的常规实验。单克隆免疫球蛋白被公认为MM发病诊断的标记，因为其在电泳过程中的移动速率一致，所以进行电泳得出的图谱结果在浓集、窄细、以及深染条带等诸多方面均与多克隆免疫球蛋白存在很大的差异。免疫固定电泳的特点是集合了电泳的分离效果、单克隆抗体的特点以及较高的灵敏度等三方 [9]面的优点，从而更容易判断结果。因此免疫固定电泳能够显著地减少MM的误诊率，有利于改善进行相关诊断时的准确性及效率。 3.3 免疫球蛋白定量与免疫固定电泳 免疫球蛋白以及轻链定量检测在进行单克隆丙种球蛋白血症的诊断过程中发挥十分重要的作用。然而MM病人的免疫系统表现出一定的缺陷，导致免疫球蛋白定量结果发现一种甚至多种偏多，另外一些则相应减少。一些病人血清中免疫球蛋白以及轻链的含量处于正常状态，只有两种轻链的含量发生变化。因此仅依据免疫球蛋白定量并无法完 [10]全诊断MM，这就需要通过免疫固定电泳进一步检测血清中是否含有单克隆物质，本研究表明，仅仅依靠免疫球蛋白定量分析会导致46.6%的漏诊率。同时研究还发现，其与固定电泳法均阳性组符合一般分型规律，但也存在免疫球蛋白定量检测阴性而固定电泳法分型阳性组(共56例，约47.4%)，其中MM病人有27例,良性单株丙球蛋白血症(MGUS)病人有26例,未明确诊断的单株丙球蛋白血症患者1例，其他病例如SLE 2例。结果显示免疫分型阳性、免疫球蛋白定量检测阴性的56例患者在良、恶性单株丙球蛋白血症中的分布格局无显著差异，其中缓解期MM患者的分布水平显著高于进展期及稳定期MM患者，而进展期及稳定期MM患者之间的分布格局无显著差异。本研究认为，缓解期MM患者可能由于大量服用药物抑制了异常免疫球蛋白的增殖。进而提示了免疫 球蛋白定量检测仅显示数量上的改变，但不能反映质的变化即单克隆成分存在与否，而质的改变仍需通过免疫固定电泳作验证。免疫固定电泳能够将MM患者分成不同的亚型，根据实际情况有区别的展开治疗，进而对预后情况进行相应的评估:将MM患者分成不同的亚型对于个性的治疗以及评估预后具有十分重要的指示作用。除了能够检测单克隆成分，固定电泳还能够根据图谱结果分析出单克隆成分 的类型:IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、轻链型或未分泌型。还能够依据显示的条带辨别出其为单克隆、双克隆还是寡克隆，能够为MM的治疗策略以及预后的评估做出一定的 [11]指导。这些特点对于定量法以及蛋白电泳法来说是不可比拟的。固定电泳作为单株丙种球蛋白的定性分析方法，不能被定量分析所取代。目前，据国外有关文献报道，游离轻链的定量检能增加对单株丙球蛋白血症的检出率，但国内相关报道较少，有待于进一步的研究。 3.4 免疫固定电泳在IgD分型中的应用 一般情况下，IgD免疫球蛋白在血清中非常少，即便单克隆IgD水平高于一般水平的200倍，血清蛋白电泳上也不一定出现单克隆条带，所以，诊断IgD型单株丙球蛋白 [11]血症需依赖IgD定量和免疫固定电泳，而不是血清蛋白电泳。免疫固定电泳酸性对单 [12]克隆丙球蛋白的检出敏感性为25mg/L，能检出非常少的单克隆成分，用于疾病的早期诊断效果好。本实验中，血清蛋白电泳漏诊的3例阴性样本，最终用免疫固定电泳证实，其中一例为IgDλ伴λ型。 4.结论 多发性骨髓瘤(Multiple myeloma, MM)是一种血液系统的恶性肿瘤，由骨髓浆细胞克隆增殖而成。其特点是由一个完整的免疫球蛋白或数量不等的片段合成，属于单克隆免疫增殖性疾病。几乎所有的多发性骨髓瘤前体均为“前骨髓瘤”的过渡状态，其主 [13，14]要代表是原因不明的单株丙球蛋白血症(MGUS)和无症状的多发性骨髓瘤，约占 [15]60%以上，根据定义他们完全是无症状者。因此诊断单株丙球蛋白血症，初步诊断到后续跟踪的整个过程中都起着重要作用。IMWG于2009年发表有关多发性骨髓瘤和相关疾病时指出，建议联合应用SPE、IF和血清CLL定量检测进行筛查，这样可以检测出几 [16]乎所有的单株丙球蛋白血症。 [17]有资料显示，对于年龄?50岁的人群而言，单株丙球蛋白血症的发病比例大于3%，而且发病率随着年龄的增大而增高，从而成为危害公共健康的重要问题，其实验室诊断显得格外重要。经本实验初步分析，为防止在单株丙球蛋白血症中出现漏诊误诊现象，我们建议将血清蛋白电泳以及定量分析作为初筛实验，把固定电泳看作是对单株丙种球蛋白血症进行诊治和分类的关键步骤，可作为常规检查项目，并不能被定量分析所取代。 参考文献 ++low/-[1] 汪萍，奚迪，王娟娟，费奇力，张力，沈立松.CD4CD25CD127调节性T细胞异常 表达与多发性骨髓瘤的关联性分析[J](国际检验医学杂志，2012,33(7):796-799. 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Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010;2010:295-302. 致谢 通过不懈的努力，我最终完成了的撰写，其中包含了我的指导老师汪萍老师大量的心血。恩师严谨的态度、渊博的学识、认真的作风都对我产生了深远的影响。从最初的论文选题、到论文的撰写、直到论文的最终完成，汪老师始终对我进行悉心的教导，我不但学会了更多的知识，还受到了更多的鼓舞与启发，使我有更多的勇气与信心面对即将来临的新的旅程。在论文的写作过程中，我深刻认识到科研所应当具备的勤恳的态度。在此，我向我的恩师表示最真诚的感谢，汪老师对我的教导与关心我将终生放在心中，永不言忘。 同时，感谢我的家人对我的支持和关爱，以及生活上无微不至的照顾。家人给了我太多太多，我希望用自己的一生去回报给我的父母和亲人们。 要向所有关心我与帮助我同学、师兄、师姐表示真诚的谢意，你们在我的前进道路上给与了我充足的动力，让我在学习与生活中经历了一段美好的回忆，这段经历让我终生受益。 最后，还要感谢所有参加我的论文评阅与答辩的各位老师、专家，感谢你们的辛勤劳动。谨以此文献给我的父母、老师、朋友及所有关心帮助我的人～