注射用重组人促红素（CHO细胞）

注射用重组人促红素（CHO细胞） 注射用重组人促红素(CHO细胞) Zhusheyong Chongzu Ren Cuhongsu (CHO Xibao) Recombinant Human Erythropoietin for Injection (CHO Cell) 本品系由高效达人红细胞生成素(简称人促红素)基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，经细胞 培养、分离和高度纯化后冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。 1基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2制造 2(1工程细胞 2(1(1名称及来源 -重组人促红素工程细胞系由带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr(二氢叶酸还原酶 基因缺陷型细胞)细胞系。 2(1(2细胞库建立、传代及保存 由原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库;从主细胞库的细胞传代， 扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。每次传代不超过批准的代次。细胞系冻存于液氮中，检 定合格后方可用于生产。 2(1(3主细胞库及工作细胞库细胞的检定 应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 2(1(3(1外源因子检查 细菌和真菌(附录XIIA)、支原体(附录XIIB)、 病毒检查(附录XIIC)均应为阴性。 2(1(3(2细胞鉴别试验 应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一进行鉴别，应为典型 CHO细胞。 2(1(3(3人促红素表达量 应不低于原始细胞库细胞表达量。 2.1.3.4目的基因核苷酸序列检查(工作种子批可免做) 目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。 2(2原液 2(2(1细胞的复苏与扩增 从工作细胞库来源的细胞复苏后，于含灭能小牛血清培养液中进行传代、扩增，供转瓶或细 胞培养罐接种用。小牛血清的质量应符合规定(附录?I D)。 2(2(2细胞培养液 生产用细胞培养液应不含牛血清和任何抗生素。 2(2(3细胞培养 细胞培养全过程应严格按照无菌操作。细胞培养时间可根据细胞生长情况而定。 2(2(4分离纯化 收集的培养液采用经批准的超滤法或其他适宜方法进行浓缩，多步色谱纯化后制得高纯度的 重组人促红素，即为人促红素原液。除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。 2(2(5原液检定 按3.1项进行。 2.3半成品 2.3.1配制与除菌 原液加入适宜稳定剂，并用缓冲液稀释。除菌过滤后即为半成品。 2.3.2半成品检定 按3.2项进行。 2.4成品 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2分装及冻干 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。半成品应及时分装、冷冻。冻干的全过程中，制品温度应不高于30?。 2.4.3规格 应为经批准的规格。 2.4.4包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3检定 3.1原液检定 3.1.1蛋白质含量 用4g/L碳酸氢铵溶液 将供试品稀释至0.5-2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L碳酸氢铵溶液作为空白测定供试品溶液在320nm，325nm，330nm，340nm，345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数做直线回归，求得回归方程。照紫外-可见分光光度法(附录II A)，在波长276nm,280nm处，测定供试品溶液最大吸光度A，将A对应波长带入回maxmax归方程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A。按下式计算，应不低于0.5 mg/ml。 光散射 蛋白质含量(g/100ml)=(A-A)?7.43×供试品稀释倍数 光散射max 3.1.2生物学活性 3.1.2.1体内法 依法测定(附录? B)。 3.1.2.2体外法 按酶联免疫法试剂盒说明书测定。 3.1.3体内比活性 5每1mg蛋白质应不低于1.0×10IU。 体外比活性 4每1mg蛋白质应不低于9.0×10IU。 3.1.4纯度 3.1.4.1电泳法 依法测定(附录? C)。用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。 3.1.4.2高效液相色谱法 依法测定(附录? B)。亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300 kD，孔径24nm,粒度10μm，直径7.5mm,长30cm;流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠1.5mmol/L磷酸二氢钾400.4mmol/L氯化钠，pH7.3;上样量20,100μg，于波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算理论板数应 不低于1500。 按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。 3.1.5分子量 依法测定(附录? C)。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36,45kD。 3.1.6紫外光谱扫描 依法测定(附录? A)，用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.5-2mg/ml,在光路1cm、波长230nm-360nm下进行扫描，最大吸收峰279nm?2nm;最小吸收峰250nm?2nm;在320,360nm处无吸收峰。 3.1.7等电聚焦 使用含有pH范围为3至5的两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶。取尿素9g、30%丙烯酰胺单体溶液6.0ml、40% pH 3至5的两性电解质溶液1.05ml、40% pH 3至10的两性电解质溶液0.45 ml、水13.5ml，充分混匀后，加入N’N’N’N’-四甲基乙二胺 15μl和10%过硫酸铵溶液0.3ml，脱气后制成凝胶，加供试品溶液20μl(浓度应在每1 ml含0.5 mg以上)，照等电聚焦电泳法进行(附录? D)，同时做对照。电泳图谱应与对照品一致。 3.1.8唾液酸含量 每1mol人促红素应不低于10.0mol(附录? C)。 3.1.9外源性DNA残留量 每10000IU人促红素应不高于100pg(附录? B)。 3.1.10 CHO细胞蛋白残留量 用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于0.05%。 3.1.11细菌内毒素检查 每10000IU人促红素应小于2EU(附录 ? E凝胶限量试验)。 3.1.12牛血清白蛋白残留量 用酶联免疫法检测，应不高于0.01%。 3.1.13肽图(每半年测定一次) 供试品经透析、冻干后，用1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至1.5mg/ml，依法测定(附录? E)，其中加入胰蛋白酶(序列分析纯)，37??0.5?保温6小时，色谱柱为反相C8柱(25cm×4.6mm，粒度5μm，孔径30nm) ，柱温为45??0.5?;流速为每分钟0.75ml;进样量为20μl;按下表进行梯度洗脱(表中A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液)。 编号 时间/分钟 流速/ml A% B% 1 0. 00 0.75 100.0 0.0 2 30.00 0.75 85.0 15.0 3 75.00 0.75 65.0 35.0 4 115.00 0.75 15.0 85.0 5 120.00 0.75 0.0 100.0 6 125.00 0.75 100.0 0.0 7 145.00 0.75 100.0 0.0 肽图应与人促红素对照品一致。 3.1.14 N-末端氨基酸序列(至少每年测定1次) 用氨基酸序列分析仪测定。N-末端序列应为: Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。 3.2半成品检定 3.2.1细菌内毒素检查 依法测定,每1000IU人促红素应小于2EU(附录? E凝胶限量试验)。 3.2.2无菌检查 依法检查(附录? A)，应符合规定。 3.3成品检定 除复溶时间和水分测定外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。 3.3.1鉴别试验 按免疫印迹法(附录? A)或免疫斑点法(附录? B)测定，应为阳性。 3.3.2物理检查 3.3.2.1外观 应为白色疏松体，复溶后为无色澄明液体。 3.3.2.2复溶时间 加入标示量的灭菌注射用水，复溶时间应不超过2分钟。 3.3.2.3可见异物 依法检查(附录? B)，应符合规定。 3.3.2.4装量差异 按附录? A中装量差异项进行，应符合规定。 3.3.3化学检定 3.3.3.1水分 应不高于3.0%(附录? D)。 3.3.3.2 pH值 依法测定(附录? A )，应符合批准的要求。。 3.3.3.3 钠离子含量 应不大于190mmol/L(附录? J)。 3.3.3.4枸橼酸离子含量 如制品中加入枸橼酸钠，则枸橼酸离子应不大于25mmol/L(附录? H第二法)。 3.3.3.45蛋白质含量 依法测定(附录? B第二法)，应符合经批准的蛋白质含量范围。 3.3.3.5 渗透压摩尔浓度 依法测定(附录V H)，应符合批准的要求。 3.3.4生物学活性 3.3.4.1体外法 按酶联免疫法试剂盒说明书测定供试品体外活性(IU/ml)，根据标示装量计算供试品生物学活 性(IU/瓶)，应为标示量的80%,120%。 3.3.4.2体内法 按附录? B测定供试品体内活性(IU/ml)，根据标示装量计算供试品生物学活性(IU/瓶)， 应为标示量的80%,140%。 3.3.5无菌检查 依法检查(附录? A)，应符合规定。 3.3.6细菌内毒素检查 每1000IU人促红素应小于2EU; 5000IU/支以上规格的人促红素，每支应小于10EU每1次 人用剂量应小于10EU/ml(附录? E凝胶限量试验)。 3.3.7异常毒性检查 依法检查(附录? F小鼠试验法)，应符合规定。 4保存、运输及有效期 于8?以下避光保存和运输。自生产分装之日起，按批准的有效期执行。 5使用说明 应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。