【doc】肝细胞腺瘤肿瘤抑制基因杂合性缺失分析

【doc】肝细胞腺瘤肿瘤抑制基因杂合性缺失 肝细胞腺瘤肿瘤抑制基因杂合性缺失分析 临床与实验病理学杂志JClinEa'pPathol2003Oct;19(5)?481? 肝细胞腺瘤肿瘤抑制基因杂合性缺失分析 潘晶丛文铭 【摘要】目的探讨肿瘤抑制基因杂合性缺失(LOH)在肝细胞腺瘤(HCA)发生中的可能作用:采用显微组织切割术 从石蜡组织切片中提取DNA,在聚合酶链式反应(PcR)基础上进行毛细管电泳DNA测序,对12例手术切除的HCA标本进 行了视网膜母细胞瘤1基因(Rb1),腺瘤性息肉病基因(APC),结直肠癌突变基因(MCC),结直肠癌缺失基因(DCC)4种肿瘤 抑制基因(TSGs)LOH.结果4种肿瘤抑制基因LOH发生率分别为Rbl(2/7,28.5%),APe(1/10,10.0%),MCC(0/ 5,0%),Dec(0/6,0%).发生LOH的3例HCA无1例在手术切除后出现肿瘤复发.结论HCA的LOH是较为少见的分子 事件,Rbl和APC基因的LOH可能在少数HcA的发生中起一定作用,但仍不足以支持HCA是肝细胞癌的癌前病变. 【关键词】肝肿瘤;肝细胞腺瘤;肿瘤抑制基因;杂合性缺失 【中图分类号】R735.7;R394.2【文献标识码】A【文章编号】1001—7399(2003)05—0481—03 Analysisonlossofheterozygosityoffourtumorsuppressorgenesinhepatocellular adenoma PanJing,CongWenming (DepartmentofPathology,OrientalHepatobiliarySurgeryHospital,SecondMilitaryMedic alUniversity, Shanghai200438) 【Abstract】Pu叩0seToinvestigatethepossibleroleoflossofheterozygosity(LOH)oftumorsuppressorgenes inthedevelopment ofhepatocellularadenoma(HCA).MethodsTwelvecasesofHCAwereanalyzedforLOHinfourtumorsuppressorgenes,including APe,MCC,DecandRbl,bymeansofmicrodissection— basedpolymerasechainreaction(PER)andDNAsequencingusingcapillary electmphoresis.ResultsThefrequencyofLOHwas28.5%(2/7)atRbl,10.O%(1/10)atAPC.NoLOHwasfoundatMCC andDec.Noneof3casesofHCAharboredLOHhadrecurrenceaftersurgicalresection.ConclusionsLOHisanuncO眦onevcnt inHCA.AlthoughLOHatRblandAPemayplayaroleinasmallpartofHCA,whichisstillnotsufficienttocOr1siderHCAasa precancerouslesion. 【Keywords】 liverneoplasms;hepatocellularadenoma;tumorsuppressorgenes;lossofheterozygc~sity 肝细胞腺瘤(hepatocellularadenoma,HCA)是 收稿日期:2003—04—04修回日期:2003—05—30 作者单位:第二军医大学东方肝胆外科医院病理科,上海200438 作者简介:潘晶,女,28岁,硕士研究生,主要研究肝肿瘤抑制基因 不稳定性.l:(021)25070860,E—mail:jingiingpan@so hu.COITI 丛文铭,男,48岁,教授,博士生导师,通讯作者 4 5 6 一 种并非罕见的肝脏良性肿瘤,其发病原因至今尚 不十分清楚,对于HCA是否为肝细胞癌(HCC)的 癌前病变或前期病变也存有不同看法.以往认为 HCA的发生与长期口服避孕药物有关,但这还不能 解释与口服避孕药无关的患者以及男性HCA患者 的发生机制.鉴于目前国外陆续有HCA存在分子 变异的报道…,本研究选择4种肿瘤抑制基因(tu— RebhandlW,FelberbauerFX,PuingS,eta1.Solid—pseudopapil— larytumorofthepancreas(Frantztumor)inchildren:reportof fourcasesandreviewoftheliterature. JSurgOncol,2001,76 (4):289,96. MoralesA,Ruiz—MolinaJM,EstevesHe,etalPapillary-cystic neoplasmofthepancreas.Asex—steroiddependentturll0rlntJ Pancreatol,1998,24(3):219,25. HaberMH,GattusoP,SpitzDJ,eta1.D(fferentialdiagnosii surgicalpathology.HealthScienceAsia,ElsevierSciPlice. 北京: 人民卫生出版社,2002:677--8. 7陈创奇,詹文华,何裕隆,等.胰腺乳头状囊实性肿瘤的临床病 理特点及诊治(国内,外文献复习附1例报告).中国普外基础 与临床杂志,2002,9(6)388-91 8祝秀丹,何乐健,曾津津.儿童胰腺囊实性瘤的诊断与治疗. 中 华医学杂志,2002.82(17):1180,2. 9穆殿斌,刘自芬,贺爱丽.胰腺实性一囊性一乳头状上皮性肿瘤 1例.临床与实验病理学杂志,2003,19(1):106,7. 10ShimizuM,MatsumotoT,HirokawaM,eta1.Solid—pseudopapil. 1arycarcinomaofthepancreas.Pathollnt,1999,49(3):231,4. ? 482?l临床与实验病理学杂志JClinEPathol2003Oct;19(5) motsuppressorgenes,TSGs),采用毛细管电泳技 术,在12例手术切除的HCA组织中进行杂合性缺 失(1ossofheterozygosity,LOH)检测,旨在探讨与 HCA发生有关的基因及其分子机制. 1材料与方法 1.1材料12例HCA组织均来自第二军医大学 东方肝胆外科医院病理科1999年1月-2001年l2 月存档蜡块,全部病例均进行复查,诊断按照 WHO肝脏肿瘤组织学分类.其中男性8例,女性4 例,平均年龄35.1岁.本组12例HCA具有以下I临 床,病理特点:(1)均无口服避孕药物史;(2)血清 AFP含量和肝功能正常;(3)无肝炎病史,血清IAB— sAg阴性;(4)临床进程缓慢,无恶性肿瘤表现;(5) 瘤细胞呈肝细胞性分化,细胞核无异型性;(6)肿瘤 边界清楚,包膜或邻近肝组织无侵犯;(7)周围肝组 织无硬化;(8)术后无复发. 1.2显微组织切割及DNA组织提取取常规石 蜡包埋组织块,7m厚连续切片5,6张,脱蜡后1 张切片做HE染色对照,在显微镜下,用细针分别刮 取白片内的肿瘤组织及癌旁组织,放人含50l消 化缓冲液的离心管中,加入20g/L的蛋白酶K3, 5l,65?温箱内孵育过夜,100?水浴8min灭活蛋 白酶K,5000r/m[n离心5min,取上清液4?保存 备用. 1.3PCR扩增PCR反应体系:2l组织DNA模 板,10pmolPCR引物(引物序列见表1【]),4种脱 氧核苷酸各5mmol/L,1.25UTaqDNA酶,10× PCRbuffer缓冲液(引物及试剂均购自上海申能博 彩生物科技有限公司),加双蒸水至终体积25l. PCR反应条件:95?预变性5min,95?变性3Os, 55?复性1min,72?延伸90S,共30个循环,4?保 存备用. 1.4测序使用MegaBACE一500毛细管测序仪及 配套试剂,每个基因的上游引物作为测序引物,取 PCR产物10,80ng,进行测序PCR反应,反应体积 10l,包括:(PCR模板+去离子水)4l,引物(1 nmol/L)2l,ET(测序仪配套试剂)4l.反应条 件:95?预变性20S,95?变20S,50?复性15s, 60?延伸1min,30个循环,412保存.之后按照测 序仪操作规程进行测序,得出序列峰值图.比对正 常组织峰值图找出肿瘤组织LOH位点. 1.5信息性与LOH的定义在测序峰图上,信息 性病例表现为正常组织的某一等位基因位点上出现 碱基杂合,与其相比,若同一病例的肿瘤组织该位点 一 个碱基峰值减半或丢失,则提示TSGs一个位点 部分或全部片段发生缺失,即为LOH. 表1检测基因的IRZR引物序列 2结果 2.1石蜡组织抽提DNA的效率由于甲醛对石 蜡包埋组织DNA的破坏,DNA抽提成功率为约为 70%,片段大小为500,1500bp.PCR扩增后经 2%的琼脂糖凝胶电泳,可观察到清晰的条带. 2.2TSGs的LOH发生率12例HCA组织中,仅 有视网膜母细胞瘤1基因(retinoblastoma1,Rb1) 和腺瘤性息肉病基因(adenomatouspolyposiscoli, APC)基因出现LoH,3种TSGs的杂合性检出率和 LoH发生率见表2.无1例HCA出现一种以上 TSGs的LOH.与其他HCA病例相比,3例出现 LOH的病例在临床病理学表现上并无特殊,随访1 , 2年,预后良好,均无肿瘤复发. 表212例HCA4种抑癌基因的杂合性和LOH检出率 3讨论 从病因学的角度上看,除了有明确病因的HCA 外(如长期口服避孕药或雄激素与蛋白同化激素,糖 原贮积病,酪氨酸血症等),自发性HCA的病因一 直不明.第二军医大学东方肝胆外科医院病理科从 临床与实验病理学杂志J(,/7ExpPathol2003Oct;19(5)'483? 19822001年共积累手术切除的HCA27例,其中 绝大多数是自发性HCA~2.HCA与HCC的关系 一 直受到关注,国外已有数例在HCA基础上发生 HCC的报道【3l.笔者以往的研究显示,A_PC,Rbl, 结直肠癌突变基因(mutatedincolorectalcancer, MCC)和结直肠癌缺失基因(deletedincolorectal carcinoma,DCC)4种TSCes在HCC中的LOH发 生率分别为41.7%,20.0%,0和0J,在本研究 HCA组织中分别为10.0%,28.5%,0和0,提示在 HCA的形成过程中LOH的发生是一个甚为少见的 分子事件,APC和Rbl信号转导通路或有可能在少 数HCA的发生中起一定作用. Rbl定位于染色体13q14.2,编码相对分子质 量约11×10的蛋白(pRb),后者的主要功能是与 E2F转录调控子结合,发挥负调控作用,限制细胞通 过G期,从而调控细胞的增殖活性,由此又被称为 S期基因[5_.本组12例HCA中有2例检测到Rbl 基因的LOH,提示Rbl有可能与少数HCA细胞的 增殖有关. wnt信号传导通路在调控细胞生长,发育,增 殖和迁移活动起着关键作用,这一组信号链主要包 括APC,beta—catenin(E一钙粘素)和axin基因,三者 组成复合物形式控制wnt信号的传递.如果其中 某一个基因发生突变或缺失,则不能形成复合物,造 成正常的Wnt信号传导途径中断,进而可导致细胞 .wnt信号转 接受过度增殖的错误信号,形成肿瘤 导途径异常在许多肿瘤中均有发生,包括结肠肿瘤, 黑色素肿瘤以及HCC等.Chen等[J发现30%的 HCA出现beta.catenin基因第3和第4外显子的中 间缺失(interstitialdeletions),但未发现有APC和 axin基因的变异.本研究结果显示l0%的HCA出 现APC基因的LOH,提示Wnt信号传导通路在部 分HCA的形成过程中可能起一定作用. DCC为一种肿瘤抑制基因,定位于染色体 18q21.3,编码一种跨膜蛋白,属于免疫球蛋白家族, 最近发现DCC基因可能参与细胞凋亡路径[. MCC是与APC基因相连锁的一个肿瘤抑制基因, 两者常同时发生变异.DCC和MCC常在消化道肿 瘤中出现LOH,在肝内胆管癌的发生率分别为 46.2%和14.3%[83,但在HCC中的变异罕见[. 本研究显示DCC和MCC基因在HCA的发生中不 起明显作用,从另一个角度提示HCA与HCC之间 无明确的分子关联. Wilkens等…采用比较基因组杂交的方法,发 现6例HCA中有2例出现染色体畸变,但若选择染 色体l,6,7,8和X作为一组FISH检测标志物,则 14例HCA中无l例出现畸变,而14例HCC中有 l3例出现其中1,5个染色体的畸变,提示HCA与 HCC在基因组变异上仍存在差异.Tannapfel等] 采用RT—PCR(限制性酶切相关PCR)的方法,研究 发现HCA中p16(INK4a)和p14(ARF)两种肿瘤 抑制基因甲基化发生率分别为24%(6/25)和l2% (3/25),与mRNA转录子丢失相关,但无特定位点 的突变或缺失.认为这种改变仅是细胞周期调控失 常的结果,并非恶性转化所必须.综上所述,尽管 HCA存在某种基因异常现象,但总体上看发生率极 低,而且本组3例发生L0H的HCA均无特殊的临 床病理表现,预后良好.因此,目前研究不足以说明 HCA存在明显的基因组变异以及具有癌前病变的 性质 参考文献 1WilkensL,BredtM,FlemmingP,eta1.Comparativegenomichy— bridization(CGH)andfluorescenceinsituhybridization(FISH)in thediagnosisofhepatocellularcarcinoma.dHepatobiliaryPancreat Surg,2002,9(3):304,11 2丛文铭,朱世能,主编.肝胆肿瘤诊断外科病理学.上海:上海科 技教育出版社,2002:79,87. 3FosterJH,BermanMM.Themalignanttransformationoflivercell adenomasArchSurg.1994.129(7):712,7 4丛文铭,FinkelsteinSD,DemetrisAJ,等.显微切割法对肝细胞 癌抑癌基因杂合性缺失的研究.肿瘤,2003,23(1):19--21. 5WellsJ,YanPS,CechvalaM,eta1.Identificationofnove1DRb bindingsitesusingCpOmicroarrayssuggeststhatE2FrecruitspRb tospecificgenomicsitesduringSphase.Oncogene,2003,22(10): 1445,60. 6ChenYW,JengYM,YehSH.eta1.p53geneandWntsignaling inbenignneoplasms:beta—cateninmutationsinhepaticadenomabut notinfocalnodularhyperplasia.Hepatology,2002,36(4Pt1):927 , 35 7LiuJ,YaoF,WuR,eta1.MediationoftheDCCapoptoticsignal byDIP13alpha.JBiolGhem,2002,277(29):26281,5 8丛文铭,FinkelsteinSD,吴孟超.胆管癌基因变异与临床病理学 特征的关系.中华病理学杂志,2001,30(3):183-7. 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