猪副嗜血杆菌

猪副嗜血杆菌 猪的多发性浆膜炎和关节炎曾一度被认为是由应激引起的仔猪散发性疾病，如今证实是感染了副嗜血杆菌所致，该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。由于进行饲养技术调整不当，以及突发新的呼吸道综合症，使得该病日趋流行，危害日渐严重，通过注射抗菌素、接种疫苗或其它的策略来控制因感染副嗜血杆菌引起的疾病，结果往往得不偿失。人们早就知道，畜群的免疫状态是感染病原后病理转归的决定因素。然而，副嗜血杆菌菌株之间的异性是惊人的，对于这些表现型和基因型的差别与毒力和保护性免疫力之间的联系，人们的认识已逐渐走向深入。 病原学 Glasser(1910)首次报道了一种革兰氏阴性短小杆菌与猪的纤维性浆膜炎和多发性关节炎之间的联系。起初Hjarre和Wramby(1943)将病原体称为猪副嗜血杆菌(Haemophilus suis)，而Lecce(1960)则称之为猪流感嗜血杆菌(Haeophilus influenza suis)。在证明了该菌生长时不需要X因子(血红素或其它卟啉类物质)(Biberstein和White,1969;Kilian,1976)的基础上，该菌更名为副嗜血杆菌(H.Parasuis)。目前，在巴斯德菌族(Pasteurelaceae)中，副嗜血杆菌的分类学位置仍未确定，这是因为它与其它的嗜血杆菌种属之间缺乏核酸同源性(De Ley等，1990;Dewhirst等，1992)。猪副嗜血杆菌菌株间存在大量的异源基因型Considerable genotypic heterogeneity has also been demonstrated among H. parasuis strains(Smart等，1988;Rapp-Garielson等，1992a;Blackall等，1997)已有学者提出，在已确认的副嗜血杆菌中存在着不止一种的细菌类别(Morozumi等，1986;Dewhirst等，1992)。 在显微镜下观察，可见副嗜血杆菌的细胞具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、以致丝状的菌体。通常可见荚膜，但体外培养时受影响(Rapp-Gabrielson等，1992b0。因此，对那些把细菌缺少荚膜与毒力联系在一起的报道，其意义有待进一步探讨(Kobisch 和Desmettre,1980; Morozui和Nicolet,1986a;Kiestein,1991)。该菌生长时需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)，这种物质可通过血液的培养(巧克力培养基)或葡萄球菌菌台条状附近的卫星生长获得。培养24-28h之后，在血液培养基上呈小而透明的菌落，该菌落在血液琼脂上不出现溶血现象。 Bakos等人(1952)首次报道了血清型的存在。此后其他研究者对此进行了拓展，并提出了新的血清型(Schimel等，1985;Morozumi和Nicolet,1986b;Nicolet等，1986;Kielstein,1991;Rapp-Gabrielson和Gabrielson,1992).近来，基于免疫扩散试验的15种血清型已经被确认下来(Kielstein和Rapp-Gabbrielson,1992)。型特异性抗原为对热稳定的多糖(Morozumi和Nicolet,1986b)。据推测，其可能是荚膜或脂多糖(LPS)。在日本、德国、美国、加拿大和澳大利亚分离菌的血清分型显示朱红，血清型5、4和13最为常见(表34.1)，有很大一部分分离菌的血清型不可定，这揭示一些分离菌不表达足够多的型特异性抗原，或者是很可能还存在另外一些血清型。 流行病学 猪副嗜血杆菌只感染猪。通常可从健康猪的鼻分泌物中分离出来(Bertschinger和Nicod,1970;Harris等，1969;Smart等，1989)，还可以从患肺炎猪的肺脏中分离出来，但一般来说，正常猪肺脏是分离不出来的(Little,1970;Moller等，1993)。在传统的畜群朱红，该菌是从1月龄猪鼻黏液标本中分离出来的一种最早的，也是最流行的细菌(Kott,1983)。 以前，猪的多发性浆膜炎和关节炎(Glasser’s disease)被当做应激反应引起的仔猪散发性疾 病。然而，在SPF动物或完全健康的畜群中，其流行病学情形迥异(Nielsen和Danielsen,1975;Baehler等，1974;Menard和Moore，1990)。副嗜血杆菌的引入可能导致高发病率和高死亡率的全身性疾病，影响猪生产的各个阶段。目前，在不同的畜群中混养猪，或在猪群中引入新饲养的种猪时，副嗜血杆菌的存在是个严重的问题(Smart等，1989;Menard和Moore，1990)。 副嗜血杆菌在猪呼吸道疾病中的作用能够尚不清楚。化脓性鼻炎的发生与副嗜血杆菌有关联，这说明了其作为一种预先影响的因素，对其它病毒或细菌性病原体可能有作用(Gois等，1983;Vahle等，1995，1997)。在肺炎中，副嗜血杆菌被假定为一种随机入侵的次要病原，只在与其它病毒或细菌协同时才引发疾病，用伪狂犬病毒接种猪，再随机注射血清型为4的副嗜血杆菌，此时，上述协同关系表现得十分明显(Narita等，1994)。然而，一些最新的报道指出，副嗜血杆菌可能是引起纤维素性化脓性支气管肺炎的病发因素(Pohle 等，1992;Barigazzi等，1994;Solano等，1998)。近年来，从患肺炎的猪中分离副嗜血杆菌的工作还在进行，这与支原体肺炎的日趋流行有关。这些病原体有猪繁殖呼吸综合症(PRRS)病毒、猪流感病毒和猪呼吸道冠状病毒。副嗜血杆菌与支原体结合在一起，患PRRS猪肺的检出率为51.2%(Kobayashi等，1996)。然而，PRRS因感染副嗜血杆菌病情加剧的临床表现，还没有用试验模型证实(Solano等，1997;Cooper等，1995)。 在一个猪群当中，副嗜血杆菌的致病力是影响全身性疾病严重程度和发生发展的因素。通常，可以从猪上呼吸道分离出该菌的一些血清型，这其中包含了一些很少能从全身其它各部分分离出的血清型(Bloch,1985;Rapp-Garielson,1993)。呼吸道中可能存在副嗜血杆菌的亚类，这些菌能够侵染猪全身并引发疾病(Rapp等，1986;Rapp-Gabrielson,1983)。 一些研究表明，从浆膜炎中分离出的菌株，各血清型之间有着明显的联系(Bakos等，1952;Morozumi和Nicolet,1986b;Kielstein,1991)。近来，通过接种SPF动物或剖腹产引发的初乳缺乏症(CDCD)猪，证明了不同的血清型毒力有差异，CDCD猪共有15种血清型(Kielstein 和Rapp-Gabrielson,1992;Nielsen,1993;Amano等，1994;Rap-Gabrielson等，1995)。在这些研究中，一些血清型的菌株毒力非常强，而另一些血清型的菌株无毒力，分离的野菌株毒力与参考菌株(reference strain)一致，这揭示血清型和毒力之间存在有一种偶然的关系(表34.2)。然而，研究已证明两个血清型均为14的菌株对CDCD猪的毒力不同，这表明存在着血清型之外的因子造成了菌株的毒力差异(Rapp-Gabrielson等，1995)。 对整个细胞和外膜(OM)蛋白进行十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电源(SDS-PAGE)，也证明了不同菌株间表现型的差异性(Morozumi和Nicoler等，1986a;Rapp等，1986;Morikoshi等，1990;Rosner等，1991;Rapp-Gabrielson等，1992a)。这些研究揭示，在毒力和特定蛋白质之间可能存在着联系，但蛋白质模型、血清型以及毒力之间的协调关系仍有待确定。副嗜血杆菌的脂多糖具有异质性，这已由SDS-PAGE和单克隆抗体的免疫印染试验得到证实，但脂多糖还没有与毒性联系起来(Zucker等，1994;Zucker等，1996)。细丝状结构推测为菌毛，这已在获得的副嗜血杆菌菌株商行得到了证明，但其在粘连和致病方面的作用仍有待确认(Munch等，1992)。 发病机理 为了阐明副嗜血杆菌感染的发病机理，对人工接种模式进行了改进。Vahle等人(1995)对CDCD猪鼻内接种猪副嗜血杆菌的有毒菌株，观察此后的一系列反应。接种后12h即从鼻窦和气管内分离出了猪副嗜血杆菌;接种后30h，血液培养物中可分离出该菌;接种后36-108h，全身各组织中可分离出该菌。由免疫组化分析法和透射电镜术，证明了在接种早期，鼻窦和气管中部和尾部有细菌移生(Vahle等，1997)。这与化脓性鼻炎、病灶处纤毛丢失以及鼻黏膜和气管黏膜的细胞急性膨胀有关。将鼻甲移出体外注射该菌，也引起了纤毛活 动的显著降低和纤毛上皮的损伤(Vahle,1996)。细菌细胞与纤毛或上皮没有密切联系，移生或细胞损伤的机理还不清楚。研究者们观察到，副嗜血杆菌优先在鼻窦和气管内移生，而不是在扁桃体内，这与该菌从鼻窦而不是从扁桃体或肺标本中分离出来的结果一致(Moller等，1993)。与此相反，有报道指出，用免疫过氧化物染色法和电镜观察法检测(Amano等，1994)，副嗜血杆菌抗原在扁桃体组织而不是在鼻窦中。 黏膜损伤可能会增加细菌入侵的机会。目前尚不清楚有关全身感染和宿主因素的关系。然而，一些菌株的毒性是相当大的，气管内接种不足100菌落形成单位，就会引起全身病变，对于CDCD猪则会导致几天内死亡(Rapp-Gabrielson等，1995)。在猪感染的早期阶段，菌血症十分明显(Vachle，1995)，肝、肾和脑膜上的瘀斑和瘀点构成了败血症损伤;血浆中可检测到高水平的内毒素，许多器官出现纤维蛋白血栓(Amano等，1994)。随后在多种浆膜表面复制产生了典型的纤维蛋白化脓性多浆膜炎、多关节炎和脑膜炎，这在野毒病例中可以观察到(Amano等，1994;Vahle等，1995)。肺炎在应激模型中并不明显，甚至即使副嗜血杆菌由肺分离出来，该猪的肺炎症状也不明显(Vahle等，1997)。在接种血清型为1、4或5的参考菌株后，肺炎症状也不明显(Amano等，1994)。研究结果证明对导致肺炎的副嗜血杆菌致病力不同，是由于不同的应激模型、给予菌量以及受检菌株的不同引起的。 临床症状与病理变化 临床症状取决于炎性损伤的部位。在SPFI猪中，发病很快，接种病原后几天内就发病。临床症状包括发热，食欲不振，厌食，反应迟钝，呼吸困难，疼痛(由尖叫推断)，关节肿胀，跛行，颤抖，共济失调，可视黏膜发绀，侧卧，随之可能死亡。急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产，公猪慢性跛行。即使应用抗菌素治疗感染母猪，分娩时也可能引发严重疾病(Menard和Moore，1990)。在通常的畜群中，哺乳母猪的慢性跛行可能引起母性行为极端弱化。总之，咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱是主要的临床症状。 肉眼可见的损伤主要是在单个或多个浆膜面，可见浆液性和化脓性纤维蛋白渗出物，这些浆膜包括腹膜、心包膜和胸膜，这些损伤也可能波及脑膜和关节表面，尤其是腕关节和跗关节( Hjarre,1958;Amano等，1994)。在显微镜下观察渗出物，可见纤维蛋白、中性粒细胞和较少量的巨噬细胞(Vahle等，1995)。副嗜血杆菌不太可能造成急性败血症，急性败血病在不出现典型的浆膜炎时就呈现发绀、皮下和肺水肿，乃至死亡(Riley等，1977;Peet等，1983;Desrosiers等，1986)。另据报道，副嗜血杆菌会引起筋膜炎和肌炎(Hoefling,1991)，以及化脓性鼻炎(Gois等，1983;Vahle等，1995)。 诊断 疾病诊断通常建立爱畜群病史调查、临床症状和尸体解剖的基础上。细菌的分离培养对确诊是必要的，但往往不能成功，这是因为副嗜血杆菌娇嫩，相对于标本中同时可能出现的其它细菌，难以满足其生长需要。在安大略省的诊断实验室，用回归分析法(retrospective analysis of submissions)分析指出，真实的发病率可能为报道的10倍之多，这一部分是由于不能确认采集来的标本中是否存在副嗜血杆菌(Miniats等，1986)。研究人员不仅要对有严重临床症状和损伤的猪进行尸体解剖，还要对疾病急性期的猪在应用抗菌素之前进行解剖。细菌分离培养最好选择浆膜表面物质或渗出的脑脊髓液及心脏血液，即使损伤轻微或不明显也要这样做。在送到诊断实验室之前接种到转移培养基上，也能由这种液体中获得猪副嗜血杆菌(Mendez-Trigo和Trigo,1996)。尽管常规诊断有些困难，但在加有抗菌素的选择培养基上接种以后，用特殊的稀释技术可成功地在从呼吸道采集来的标本中培养出大量细菌(Moller和Kilian,1990;Moller等，1993)。5%CO或蜡罐培养并不能提高副嗜血杆菌的生长2 速度，而用脱纤维蛋白的血和胰蛋白胨血液琼脂基质培养可以提高生长速度;用牛或羊血和 胰酶水解咯蛋白琼脂为培养基效果不佳。 用生物化学的检测方法可将副嗜血杆菌从其经NAD或V因子依赖的微生物中鉴别开来，这些属于从猪分离出的巴斯德菌族(表34.3，Moller等，1996)。有时其它的NAD依赖的细菌会被误认为嗜血杆菌，这些细菌在鼻窦、扁桃体或肺体中大量存在，但只有较低的致病力(Moller和Kilian,1990;Moller等，1993)。 在一个猪群中出现几个菌株或血清型并非少见，甚至在单个猪上的不同标本中也可发现不同的菌株或血清型(Smart 等1989;Rapp-Gabrielson和Gabrielson,1992;Rapp-Gabrielson,1993)。由此，全身各处或大损伤点的康复是唯一能保证所分离出来的细菌在病程中发挥作用的前提。血清型的分型严格要求研究者熟知疾病爆发的流行病学，以及感染和接种的免疫反应，这只有在少数几个实验室中才能做到。 鉴别诊断要将副嗜血杆菌与败血性细菌感染相区别，能引起败血性感染的细菌有链球菌、猪孔斑丹毒丝菌、放线杆菌、猪霍乱沙门氏菌变种Kunzendorf菌以及埃希氏大肠杆菌。3-10周龄猪的支原体多发性浆膜炎和关节炎能出现与副嗜血杆菌感染相似的损伤。只有确认了其它病毒和细菌病原之后，才能认清副嗜血杆菌在支气管肺炎中的作用，这些病原体可能在多因子疾病的病程中产生影响。 治疗 抗生素预防或口服药物治疗对严重的副嗜血杆菌暴发可能无效(Maden,1984;Wiseman 等，1989;Menard和Moore,1990)。一旦临床症状已经出现，应立即采用口服之外的方式，应用大剂量的抗菌素对整个猪群治疗，而不只是对那些表现出症状的猪用药(Desrosiers等，1986)。可以选用青霉素治疗;但有报道说，细菌对青霉素的抗药性日渐增强(Kielstein和Leirer,1990)。大多数副嗜血杆菌菌株也对氨比西林、氟喹诺槽、头孢菌素、庆大霉素、壮观霉素和增效磺胺类药物敏感，但大多菌株对四环素、红霉素、氨基苷类和林可霉素有抵抗力(Kielstein,1985;Trigo等，1996)。 预防和免疫 鉴于1周龄前的仔猪鼻黏膜就可能有副嗜血杆菌的寄生，因而仅仅通过早期断奶来消除该菌不可能取得成功。Clark等人(1994)对几种早期断奶疗法进行了评估，结果发现，只有同时对仔猪从各种用药途径大剂量给予抗菌素，副嗜血杆菌才能得到消除。将副嗜血杆菌彻底消除出猪群也许并不可取，因为在这之后混养于无病原猪群和生产后期潜伏有副嗜血杆菌猪群中的猪，可能引起发病，造成毁灭性的经济损失。向一个猪群中引入健康状况不同的新猪群，应当隔离饲养，并维持一个足够长的适应期，以使那些没有免疫接种但有感染条件饲养的猪群建立起保护性免疫力。 母代的免疫力和天然的免疫力是控制疾病过程的关键性因素(Nielsen和Dainelsen，1975)。预先让猪接触无致病力的副嗜血杆菌菌株，以培养其对后来的有毒菌株刺激的抵抗里(Nielsen，1993)。母猪接种后可对4周龄以内的仔猪产生保护性免疫力，这时再用含有相同血清型的灭活菌激发小猪的免疫力(Solano等，1998)。由于该菌的败血症特性，抗体很可能是保护性免疫的主要因素。 大量报道指出，通过商业疫苗接种或使用猪特异性灭活菌苗，可以成功地控制疫病的发生(Nielsen和Danielsen,1975;Riising,1981;Wiseman等，1989;Menard和Moore,1990;Schimel 等，1992)。也有使用灭活菌苗预防失败的事例，这可能是因为病程中出现的菌株血清型不同而缺乏交叉保护。对其它有毒力菌株的交叉保护在实验激发模型上并不总是很明显(Miniats等，1991;Kielstein和RaBbach,1991;Rapp-Gabrielson等，1997)。虽然交叉保护是对商用灭活菌的基本要求，但是猪特异性灭活菌可能因为猪群中存在不止一种菌株或血清 型而缺乏功效，也可能因为后来猪群中引入了新的菌株而失去功效。现已证明，有毒力的菌株可能不受相同血清型的无毒菌株激发保护而致病，甚至同源菌株的激发对其也无济于事，这表明保护性抗原与毒性因子或型特异性抗原并不一致(Kielstein和RaBbach,1991;Rapp-Gabrielson等，1997)。 如同对异源性血清型的交叉保护一样，相同血清型的不同菌株可激发免疫力，这种交叉保护的功效已通过含血清型4和5的副嗜血杆菌的灭活菌苗得到证实(Rapp-Gabrielson等，1996，1997)。然而，同样是在这些报道总，对这种灭活菌苗的评估同其它商业疫苗一样，在北美存在的与疾病相关最常见的六种血清型中，无一种菌苗能够同时具有保护作用。研究已证明代表几种血清型和非血清型的菌株都有毒力。由于菌株致病力的差异，以及当前对保护性抗原和毒性因子缺乏深刻的认识，还不可能有一种灭活菌苗同时对猪所有的致病菌株产生交叉免疫力。控制可能包括疫苗接种和抗菌素处理，但也应当加强饲养管理，以减少或消除其它呼吸道病原菌，如提前断奶、减少猪群流动、杜绝猪生产各阶段的混养状况等等。